UNIVERSIDAD AUTONOMA GABRIEL RENE MORENO

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y TECNOLOGIA

CARRERA DE INGENIERIA QUIMICA

LABORATORIO Nº3
TINCIÓN DE GRAM
1. OBJETIVOS

Conocer las diferentes técnicas de tinción haciendo énfasis en la tinción de Gram.

2. FUNDAMENTO TEORICO

En la microbiología, es fundamental la observación de los microorganismos. Esta

observación se hace necesaria para su clasificación, identificación y diferentes
estudios.

Para ello se utiliza el microscopio tanto óptico como electrónico y en sus diversas
variantes (microscopios de rayos UV, electrónico de barrido, de contraste de fase,
de campo oscuro), en nuestro caso abordaremos el microscopio compuesto.

Un microscopio suele tener cuatro objetivos, en microbiología se usa

preferentemente el objetivo de inmersión, aunque para visualizar una preparación
siempre se recomienda empezar por el objetivo de 10X y una vez localizada la
muestra ir subiendo gradualmente el nivel de aumentos.

Formas de ver las preparaciones

o Preparaciones en fresco con el objetivo seco. Tiene el inconveniente de

que las preparaciones son muy difíciles de ver debido al poco contraste del
medio que les rodea.

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o Preparaciones fijadas y teñidas con el objetivo de inmersión. Se matan las

bacterias, pero son más visibles y su contraste es superior y de mayor
calidad.

El método de tinción que se usa universalmente para distinguir las bacterias o

visualizar microorganismos es la Tinción de Gram. Es una tinción diferencial que
basa su distinción en la estructura diferente de la pared bacteriana de las
bacterias Gram + (pared más gruesa, y una sola capa de peptidoglucano) se
tiñen azul y de los Gram – (pared más delgada y dividida en dos partes), se tiñen
de color rosa.

3. MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES Reactivos

Cajas Petri Lugol

Un asa de siembra Cristal Violeta

Porta objetos Alcohol Cetona

Microscopio Safranina

Mechero Agua destilada

Pinza

4. PROCEDIMIENTO Y ESQUEMATIZACIÓN

Proceso

o Colocar básico Cristal Violeta o Violeta de Geniciana. Es el primer

colorante que se agrega sobre el frotis previamente preparado. Es el
colorante selectivo que tiñe todos los microorganismos. Se deja actuar
durante un minuto y se lava con agua a continuación.
o Lugol, producto compuesto de yodo y yoduro potásico. Es un mordiente
que intensifica al Cristal Violeta haciendo que precipite. Se deja actuar un

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minuto y se lava con alcohol, el tiempo justo para que no se arrastre el

colorante del todo.
o Alcohol 96º, el alcohol retira el colorante de las Gram (-) debido a su
diferente estructura de la pared celular (tamaño de los poros).
o Safranina, colorante básico diferenciador. Tiñe a las bacterias Gram (-). Se
deja actuar treinta segundos y se lava con agua.

Como puede verse una vez finalizada la tinción las bacterias Gram (-) estarán
teñidas de un color rosa y las Gram (+) de un color violeta o azul oscuro. Esto
sirve para diferenciarlas al microscopio óptico.

ESQUEMATIZACIÓN

Figura 1. Lavar y secar el Figura 2. Agregar la Figura 3. Esterilizar el

portaobjetos. muestra. aza

Figura 4. Esparcir la 3 la muestra

Figura 5. Secar Figura 6. Agregar 1-2
muestra gotas de violeta de
genciana y esperar 1 min
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Figura 7. Lavar con Figura 8. Agregar 1-2 Figura 9. Agregar

H2O (d) gotas de Lugol y esperar alcohol al 98% y esperar
0.5-1 min 15seg

Figura 10. Agregar 1-2 gotas de Figura 11. Lavar con

soframina H2O (d)

Figura 12. Llevar la Figura 13. Observar

muestra al microscopio
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5. CONCLUCION

Se logró realizar la observación de las bacterias Gram (+) utilizando la técnica de

tinción de Gram, para lo cual se siguió un protocolo con una serie de pasos con el
uso de tres colorantes (Violeta de genciana. Lugol y Saframina), por lo que
decimos que fue una tinción compuesta ya que se utilizó más de un colorante.

6. OBSERVACIONES
o Se observó que el único colorante que se adhiere a las Gram (-) es la
safranina.
o El Lugol fijara el colorante netamente en la bacteria.
o La observación que realizamos en este laboratorio fue la de Gram (+).
o Mayormente las Gram (-) son virus.
o Se realizaron tres muestras para trabajar con la que se encuentre en mejor
estado.
o Se utilizó el objetivo de 100X debido por lo cual se utilizó aceite de inmersión
7. RECOMENDACIONES
o Se recomienda que al momento de realizar la experiencia se respete el tiempo
y la cantidad de cada colorante que se está utilizando.
o Se recomienda siempre esparcir el colorante por toda la muestra para mejor
observación en el microscopio.
o Se recomienda lavar la muestra con el gotero, no con la Pizeta para evitar
retirar toda la muestra.
8. CUESTIONARIO

¿Qué otro método existe para realizar esta práctica?

Se pudo haber aplicado la técnica por fijación, o tinción de Moeller; con las cuales
también se puede hacer la observación de organismos vivos en el yogurt.

¿Por qué algunas bacterias retienen la coloración violeta y por qué otras retienen
el color rosa?

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Esto ocurre debido a que por la tinción de Gram identificamos si son Gram (+) si
se tiñen violeta (azul) y son Gram (-) si se tiñen de color rosa.

¿Qué es un colorante catiónico? De 2 ejemplos

Un colorante catiónico (básico) es un colorante con carga positiva. Estos suelen

tener sales de amonio cuaternario y se combinan con intensidad con los
sustituyentes celulares cargados negativamente tales como los ácidos nucleicos y
los polisacáridos ácidos. Ejemplo: el azul de metileno y el cristal violeta.

¿Qué es un colorante aniónico? De 2 ejemplos

Un colorante aniónico (acido) es un colorante con carga negativa, que suelen

tener uno o más grupos sulfónico y se combinan con los constituyentes celulares
cargados positivamente, tales como muchas proteínas. Ejemplo: Eosina y el rojo
congo.

¿Cuál es la importancia de las tinciones en el estudio de los microorganismos?

La importancia es que a través de la tinción nos permite conocer las propiedades

y características de las bacterias. A través de colorantes que se absorben a una
superficie además de que el uso de colorantes permite cambiar el color de las
células de los microorganismos y poder realizar la observación en microscopio
óptico ya que las bacterias son casi incoloras, no presentan contraste con el
medio en el cual se encuentran suspendidas y no pueden observarse claramente
sin algún tratamiento previo a través del cual podemos observar su morfología
celular como también una diferenciación bacteriana.

9. INVESTIGACION

Otras técnicas de observación por tinción compuesta

 Tinción diferencial
 Tinción estructural
 Tinción de Antohony
 Tinción de Moeller

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 Tinción de Ziehl - Neelsen