LABORATORIO MICROBIOLOGÍA

PRÁCTICA 2: OBSERVACIÓN DE BACTERIAS (TINCIÓN DE GRAM)

. Docente: Laura Milena Rivera García

OBERVACIÓN DE BACTERIAS

Objetivos:
- Reconocer la coloración de Gram como una herramienta importante en la
identificación morfológica de las bacterias.
- Identificar los pasos a seguir en la coloración de Gram, reactivos y fundamento de
la misma.
- Realizar una tinción simple de bacterias procedentes de distintas muestras
naturales
- Realizar observaciones en el microscopio de los montajes realizados.

Marco teórico:
Las bacterias son prácticamente transparentes (hialinas), por ello se emplean colorantes
biológicos que permiten aumentar el contraste entre la célula bacteriana y el medio
ambiente, y a través del empleo de técnicas especiales, es posible distinguir algunos de
los constituyentes celulares más importantes. Cualquiera sea el procedimiento de tinción,
éste produce la muerte de la célula y en cierto modo la alteración de la estructura física de
la bacteria.

Los colorantes son compuestos químicos que poseen un grupo cromóforo que otorga
color a la molécula y un grupo auxocromo que otorga al colorante la capacidad de
disociarse electrolíticamente y por lo tanto, formar sales.

Los colorantes se clasifican como naturales y sintéticos; la mayoría de las tinciones

bacterianas son realizadas con colorantes sintéticos, en su mayoría anilinas, las cuales
derivan del benzeno.

En general, las bacterias tiene afinidad por los colorantes de carácter básico; estos
colorantes llevan en su parte cromófora una carga positiva, la que tiene una fuerte
afinidad por las sustancias electronegativas que normalmente presentan las bacterias.

El pH del medio tiene gran influencia en la tinción ya que permite una mayor o menor
disociación electrolítica del grupo auxocromo, permitiendo de esta manera una mayor o
menor afinidad por los grupos químicos sobre los cuales se une.

Si se aumenta el pH del medio existe una mayor afinidad del colorante por la bacteria,
sucediendo lo contrario si el pH se hace más ácido.

La fijación de colorantes a la célula bacteriana se facilita con el uso de mordientes

(aunque no son colorantes, intensifican la tinción porque aumenta la afinidad de la célula
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por el colorante; también se usan para producir un “engrosamiento” de algunas
estructuras celulares, tales como flagelos), con los que forman compuestos insolubles
(yodo, fenol, ácido tánico, oxalato de amonio, etc.).

Algunos de los colorantes más empleados en microbiología son: azul de metileno, violeta
de genciana, fucsina básica, safranina, verde de malaquita, etc.

Tinción de Gram:
Es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización de
bacterias en muestras. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, quien
desarrolló la técnica en 1844. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular
bacteriana, como primer paso en la diferenciación bacteriana, considerándose como
bacteria Gram-positivas a las bacterias que se visualizan de color violeta y bacteria Gram-
negativa a las que se visualizan de color rosa, este procedimiento es utilizado
universalmente.

Observaciones:
- Al realizar la tinción de Gram, se debe tener la precaución de no utilizar cultivos
bacterianos muy viejos, ya que los resultados obtenidos pueden inducir a error; así
en cultivos bacterianos relativamente viejos de bacterias Gram (+), algunas se
observan como Gram(-), ello se debe a la acidificación paulatina del cultivo,
disminuyendo la afinidad tintorial.
- Siempre que se realice el protocolo, es fundamental realizar el tratamiento con
cristal violeta antes de hacer el tratamiento con yodo. El yodo, en ausencia del
cristal violeta, tiene poca afinidad por la célula por lo cual se pierde en los
siguientes lavados.
- El proceso de decoloración no debe ser extenso, y debe respetarse el protocolo en
cuanto al tiempo designado para los mismos. Así mismo, debe utilizarse poco
agua para evitar la pérdida de tinción de las Gram-negativas.

Materiales:
Laminilla (cubreobjetos)
Portaobjetos.
Microscopio
Asa bacteriológica
Mechero
Azul violeta (cristal violeta)
Lugol
Alcohol /acetona
Safranina o fuchina
Aceite de inmersión
Violeta de genciana
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Metanol
Yogurt
Vinagre

Procedimiento:
A. Observación de bacterias del tejido epitelial:

Fijación de muestra
1. lave con agua y jabón las láminas y desengrase con alcohol.
2. Marque cada lámina con el nombre la muestra que va a observar.
3. Proceda a fijar la muestra con ayuda de un mechero flameando la lámina sin
excederse por que puede desnaturalizar la muestra.

Protocolo tinción de Gram:

1. Realizar un extendido del frotis de la boca con un palillo en la lámina
portaobjetos.
2. Fijar la muestra con calor sobre la lámina portaobjetos.
3. Agregar azul violeta (cristal violeta) cuidando que el colorante cubra toda
la preparación. Esperar 1 minuto. (moradas/Gram-positivas).
4. Enjuagar con agua: eliminar el exceso de colorante y lavar rápidamente
con agua, manteniendo el portaobjetos en posición inclinada.
5. Cubrir el frotis con lugol y esperar 1 minuto.
6. Enjuagar con agua.
7. Agregar alcohol/acetona y espere 30 segundos.
8. Enjuagar con agua.
9. Agregar safranina o fuchina y esperar 30 segundos (rosadas/Gram
negativa).
10. Enjuagar con agua.
11. Deje secar y observe al microscopio en el objetivo de 4X, 10X, 40X y
100 x este último con aceite de inmersión.

B. Observación de Bacterias del yogurt:

El yogur es un producto lácteo producido por la fermentación natural de la leche. A escala
industrial se realiza la fermentación añadiendo a la leche dosis del 3-4% de una
asociación de dos cepas bacterianas: el Streptococcus termophilus, poco productor de
ácido, pero muy aromático, y el Lactobacillus bulgaricus, muy acidificante. En esta
preparación se podrán, por tanto, observar dos morfologías bacterianas distintas (cocos y
bacilos) y un tipo de agrupación (estreptococos, cocos en cadenas). Además, el tamaño
del lactobacilo (unos 30μm de longitud) facilita la observación aunque no se tenga mucha
práctica con el enfoque del microscopio.

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1. Realizar el frotis disolviendo una mínima porción de yogurt en una pequeña gota de
agua.
2. Fijar con metanol para eliminar parte de la grasa.
3. Teñir con violeta de genciana y dejar actuar por 1-2 minutos.
4. Deje secar y observe al microscopio en el objetivo de 4X, 10X, 40X y 100 x
este último con aceite de inmersión.

C. Observación bacterias del vinagre:

El vinagre es una solución acuosa rica en ácido acético resultante de la fermentación
espontánea del vino o de bebidas alcohólicas de baja graduación. La acetificación del vino
es producida por bacterias aeróbicas del ácido acético, principalmente Acetobacter aceti,
aunque también Gluconobacter. Se trata de bacilos rectos con flagelos polares.

1. Tomar con una gota de vinagre comercial o de la telilla que se forma sobre la
superficie de los vinos agriados (vinagre de mata).
2. Extender la muestra en el portaobjetos con una gota de agua y hacer el frotis.
3. Dejar secar y fijar con calor.
4. Teñir con violeta de genciana o safranina, esperar de 2-3 minutos.
5. Lavar el exceso de colorante con agua.
6. Deje secar y observe al microscopio en el objetivo de 4X, 10X, 40X y 100 x
este último con aceite de inmersión.

D. Observación de Bacterias del suelo:

La variedad de bacterias que pueden aparecer en una muestra de suelo es prácticamente
infinita, muchas de ellas no cultivables en los laboratorios y algunas, incluso,
desconocidas para los microbiólogos.

Para recoger la muestra y hacer el frotis basta con dejar parcialmente enterrado en
vertical un portaobjetos en la tierra de una maceta o de un jardín. Después de varios días,
las bacterias se habrán adherido al vidrio y sólo habrá que fijarlas por calor y teñirlas con
un colorante cualquiera.

Previamente hay que limpiar los bordes del portaobjetos, así como la parte que no se va a
teñir. Teñir con violeta de genciana y esperar 2 min.

Deje secar y observe al microscopio en el objetivo de 4X, 10X, 40X y 100 x este
último con aceite de inmersión.

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Contenido que debe tener el informe:
El informe debe contener:
- Título.
- Resumen.
- Palabras clave.
- Introducción.
- Materiales y métodos.
- Resultados y análisis de resultados.
- Cuestionario.
- Bibliografía.

Cuestionario:
1. Consulte qué es una tinción básica, ácida y neutra.
2. Consulte qué son las tinciones simples, diferenciales y especiales.
3. Cuál es la función de los colorantes más empleados en microbiología: azul de
metileno, violeta de genciana, fucsina básica, safranina, verde de malaquita.
4. Cuál es el fundamento de la tinción de Gram?

Bibliografía a consultar o de apoyo:

-Michael T. Madigan; John M. Martinko; Jack Parker (2015): Brock Biología de

los Microorganismos , Ed.Pearson Prentice Hall
- Brown C.M.. Campbell I., Priest F.G. (1998). Introducción a la biotecnología”.
Ed Acribia
- Smith J.E., (1996): Biotechnology (3ª edición). Cambridge: Cambridge University
Press

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