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Colorantes y mordientes.
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Salle, A. J. 1967. Fundamental Principles of Bacteriology. Mc Graw-Hill. Book Company. N. Y.
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Introducción a la Microbiología
Facultad de Ciencias Exactas
UNLP
En algunas coloraciones se
utilizan sustancias capaces de formar
complejos insolubles con los colorantes
y que ayudan al proceso de coloración:
los mordientes. Ejemplos de
mordientes comúnmente usados son el
Lugol, el ácido tánico y algunas sales.
Lógicamente, es de esperar que
el colorante imparta su color a las
estructuras celulares, sin embargo hay
un fenómeno llamado metacromacia en
el cual se observa un color diferente.
Por ejemplo, pueden visualizarse
corpúsculos metacromáticos rojos en
ciertos preparados teñidos con azul de
metileno. Una explicación que da cuenta de este fenómeno se muestra en la figura. El
colorante, al interaccionar con ciertas estructuras polianiónicas como los polifosfatos, se
dispone de tal manera que cambia la longitud de onda de absorción2. Pueden observarse
corpúsculos metacromáticos (gránulos de volutina) en varios géneros microbianos y en general,
su presencia denota algún déficit nutricional en el medio de cultivo.
Los pasos fundamentales previos a una coloración son: extendido, secado y fijado.
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Geneser, F. 1986. Histología. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires.
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Observación en fresco y coloración vital.
Cuando se desea observar bacterias sin afectar su viabilidad, puede realizarse una
observación en fresco (sin colorear) o utilizar colorantes diluídos como por ejemplo cristal
violeta 1/5000. Con esta técnica podrá observarse la morfología y agrupación de las
bacterias así como también la movilidad.
Observación en fresco.
Técnica.
1- Sobre un portaobjetos colocar con el ansa una gota de agua y realizar una suspensión
de la muestra en estudio. No extender.
2- Colocar un cubreobjetos.
3- Observar con poca luz.
Coloración vital.
Coloración simple.
Técnica.
1- Extender, secar y fijar por calor.
2- Aplicar solución de colorante durante alrededor de 2 minutos. En general, el tiempo de
la coloración depende de la concentración y del colorante utilizado.
3- Lavar con agua corriente.
4- Secar entre papeles de filtro y observar con objetivo de inmersión.
Tinción negativa.
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Con este método pueden observarse morfología y agrupación así como también
estraucturas extracelulares como la cápsula.
Técnica.
1- Colocar sobre un portaobjetos, con la ayuda de un ansa, una gota de una solución
acuosa de nigrosina al 10 %.
2- Tomar una porción del cultivo, suspender en la gota de nigrosina y extender en forma
de óvalo.
3- Dejar secar (no exponer al calor) y observar con objetivo de inmersión.
COLORACIONES ESPECÍFICAS.
Coloración de Gram.
Esta coloración fue ideada por el bacteriólogo danés Christian Gram en el año
18833 y ha demostrado ser de suma utilidad. Permite separar los microorganismos en
Gram (+) y Gram (-) lo cual reviste especial importancia taxonómica.
En esta técnica, el preparado fijado por calor se trata primeramente con cristal
violeta, luego se agrega Lugol como mordiente, se decolora con alcohol-acetona y
finalmente se contracolorea con fucsina o safranina. Las bacterias Gram(+) serán las que
resulten violetas luego del procedimiento de coloración de Gram mientras que las Gram (-)
se verán rojas.
La explicación de las diferencias en el comportamiento tintorial entre bacterias
G(+) y G(-), debe buscarse en la estructura y composición de la pared celular bacteriana4.
La pared de las bacterias Gram (+) está constituída fundamentalmente por una
gruesa capa de peptidoglicano (20-30 nm), que es un polímero de N- acetil glucosamina y
ácido N-acetil murámico. Las cadenas de peptidoglicano, se unen a través de puentes
formados por aminoácidos, en arreglos que varían de una especie bacteriana a otra. En
esta capa podemos también encontrar ácidos teicoicos, formados por ésteres fosfato de
glicerol o ribitol, y ácidos lipoteicoicos cuya estructura es similar a los ácidos teicoicos
pero se hallan anclados a la membrana citoplasmática.
En las bacterias Gram (-), la capa de peptidoglicano es mucho más delgada (3-5
nm) y poseen una membrana externa de estructura compleja en cuya composición
intervienen fosfolípidos, proteínas y lipopolisacáridos. En la figura puede observarse una
representación de las paredes celulares de organismos G(+) y G(-).
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Bartholomew, J. and Mittwer, T. 1952. The Gram Stain. Bact. Rev. 16: 1-16.
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Poxton I. R. 1993. Procaryote envelope diversity. J. Appl. Bacteriol. (Symposium Supplement) 74: 1 S-
11 S.
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Técnica.
1- Extender, secar y fijar a la llama.
2- Cubrir durante 2 minutos con solución de cristal violeta al 1%.
3- Escurrir y cubrir con solución de Lugol* durante 30 segundos.
4- Escurrir y cubrir nuevamente con Lugol durante 30 segundos.
5- Decolorar con alcohol acetona y lavar con abundante agua.
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Beveridge, T. J. 1993. Currents trends and future prospects in prokariotic envelope research: a
microscopist's view. J. Appl. Bacteriol. (Symposium Supplement) 74: 143 S - 153 S.
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6- Cubrir con solución diluída de fucsina 0,1 % o safranina 0,5 % durante 2 minutos.
7- Dejar secar o secar entre papeles de filtro y observar con objetivo de inmersión.
La pared celular de los bacilos ácido alcohol resistentes (BAAR) está compuesta
por una gran cantidad de lípidos tanto libres como covalentemente unidos: los ácidos
micólicos y los micósidos6. La alta proporción lipídica otorga a estas bacterias una gran
hidrofobicidad, con la consiguiente tendencia a formar agregados y la dificultad para
captar colorantes que hace necesaria la utilización de métodos drásticos7. Se utiliza
fucsina fenicada en caliente, luego un paso de decoloración con ácido-alcohol y una
contracoloración con azul de metileno. La mezcla decolorante no podrá extraer el
colorante de los BAAR que permanecerán rojas mientras que las demás bacterias se
verán azules.
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Poxton I. R. 1993. Procaryote envelope diversity. J. Appl. Bacteriol. (Symposium Supplement) 74: 1 S-
11 S.
7
Davis, B. D.; Dulbecco, R.; Eisen, H. N.; Ginsberg, H. S.; Wood, W. B y Mc Carty, M. 1983. Tratado de
Microbiología. Editorial Salvat. Buenos Aires.
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coloración es de suma importancia diagnóstica. Otro género de bacterias que se colorean
mediante esta técnica es Actinomyces.
Técnica.
1- Extender, secar y fijar a la llama.
2- Cubrir con solución de fucsina fenicada (solución acuosa de fucsina 1 % y fenol 5 %).
3- Pasar un hisopo de algodón embebido en alcohol por debajo del preparado hasta lograr
la emisión de vapores. El preparado debe mantenerse caliente durante 5 minutos pero
evitando que se produzca la ebullición del colorante. Por consiguiente, no debe
mantenerse el hisopo debajo del preparado sino colocarlo en los momentos en que cese
la emisión de vapores.
4- Escurrir y lavar con agua.
5- Decolorar con ácido nítrico diluído 1/3 y luego con alcohol.
6- Lavar, escurrir y cubrir con solución de azul de metileno durante 2 minutos.
7- Lavar con agua, dejar secar o secar entre papeles de filtro y observar con objetivo de
inmersión.
Coloración de esporos.
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Stanier, R. Y.; Ingraham, J. L.; Wheelis, M. L y Painter, P. R. 1991. Microbiología. Editorial Reverté.
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encuentra en las células vegetativas, y que estaría involucrada en la eliminación de agua
durante el proceso de esporulación9.
Las características antes apuntadas, dan cuenta de la resistencia de los esporos a
los agentes físicos y químicos y de la dificultad que presentan para ser coloreados. Cabe
aclarar que una vez coloreados son difíciles de decolorar.
En todas las técnicas para colorear esporos se utilizan procedimientos drásticos.
Describiremos las técnicas de Dorner y de Moeller.
Para la coloración de esporos según Dorner, se sensibiliza y colorea al esporo con
fucsina fenicada en caliente y luego se extiende sobre nigrosina. La nigrosina extraerá el
colorante de todas las estructuras celulares excepto de los esporos y por consiguiente, se
verán los esporos rojos, el resto de la bacteria incolora y el fondo oscuro. La técnica de
Moeller utiliza ácido crómico y fucsina fenicada en caliente para sensibilizar y colorear al
esporo. La decoloración se realiza con ácido-alcohol y se contracolorea con azul de
metileno. Se observan los esporos rojos y el resto de la bacteria azul.
Si bien es cierto que con otras coloraciones los esporos se verán incoloros, en
algunos casos las bacterias pueden
presentar zonas sin colorear que no
corresponden a esporos y debe confirmarse
su presencia mediante una coloración
específica.
Otro aspecto que debe tenerse en
cuenta al observar esporos es su posición:
terminal, subterminal o central, y si
deforman o no a la bacteria ya que serán
características que ayudarán en la
clasificación.
Técnica.
a) Método de Dorner.
1- Preparar una suspensión del cultivo a
analizar en 1 ml de agua destilada.
2- Añadir 1 ml de fucsina fenicada (solución acuosa de fucsina 1 % y fenol 5 %) y colocar
la mezcla en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos.
3- Tomar una ansada del material y colocar en un portaobjetos. Añadir una ansada de una
solución acuosa, saturada, fresca y filtrada de nigrosina (10 %). Mezclar bien y extender
en forma de óvalo.
4- Dejar secar y observar con objetivo de inmersión.
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Joklik, W. K.; Willet, H. P. y Amos, D. B. 1983. Zinsser Microbiología. Editorial Médica Panamericana.
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b) Método de Moeller.
1-Hacer un extendido del material a examinar. Secar y fijar cubriendo con alcohol,
encendiendo y dejando apagar.
2-Cubrir el preparado con solución de ácido crómico al 5% durante 5 minutos para
sensibilizar.
3-Lavar y cubrir luego con solución de fucsina fenicada en caliente durante 10
minutos ( calentar pasando un hisopo embebido en alcohol hasta emisión de vapores
y volver a calentar ocasionalmente para mantener la temperatura).
4-Lavar con agua corriente.
5-Decolorar con ácido sulfúrico al 5 % o ácido nítrico al 10 %. Puede terminarse la
decoloración con alcohol.
6-Lavar y colorear con azul de metileno (1 %) durante 3 minutos.
7-Lavar, secar y observar con objetivo de inmersión.
Coloración de flagelos.
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Saunders, J. R.; O'Sullivan, H.; Wakeman, J.; Sims, G.; Hart, C. A.; Virji, M.; Heckels, J. E.;
Winstanley, C.; Morgan, J. A. W. and Pickup, R. W. 1993. Flagella and pilli as antigenically variable
structures on the bacterial surface. J. Appl. Bacteriol. (Symposium Supplement) 74: 33 S-42 S.
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La coloración de flagelos se realiza
fundamentalmente en los casos de
bacterias móviles para las cuales la
determinación del número y posición de
estos apéndices contribuya a su
identificación. En la figura se ilustran las
diferentes disposiciones encontradas.
Técnica.
1-Colocar todo el material y las soluciones
que se van a emplear en la estufa a
37°C por lo menos 90 minutos antes de
usarlos.
2-Hacer una suspensión del germen en
estudio en agua estéril termostatizada.
3-Hacer el extendido dejando correr una
gota de la suspensión a lo largo de un
portaobjetos limpio y desengrasado.
Hacer por lo menos 3 preparados y
dejarlos secar en la estufa.
4-Mezclar dentro del cuarto estufa: 5 ml de alumbre de potasio, 2 ml de solución de ácido
tánico y 2 ml de cloruro mercúrico*.
5-Agitar bien y agregar 1- 1.5 ml de Verde de Malaquita 5 %. Mezclar bien y mantener en
estufa 2 minutos con agitaciones periódicas.
6-Filtrar de inmediato con papel de filtro plegado y dejar otros 2 minutos.
7-Agitar y colocar sobre los extendidos a razón de alrededor de 2,5 ml por portaobjetos.
8-Dejar actuar la mezcla colorante. Como el tiempo varía según el germen, dejar actuar
de 5 a 9 minutos.
9-Lavar con agua destilada termostatizada. Puede utilizarse azul de Loeffler** para
colorear el resto de la bacteria. Escurrir, dejar secar y observar con objetivo de
inmersión.
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Coloración de espirilos.
Existen bacterias de forma espiralada que son llamadas en forma general espirilos aunque
debe hacerse una aclaración: los espirilos son bacterias con morfología helicoidal y un cuerpo
bastante rígido, que se mueven mediante flagelos, pero existe otro tipo de microorganismos con la
misma morfología que se llaman espiroquetas cuyo cuerpo es flexible y tienen flagelos internos 12 .
Las espiroquetas están formadas por un cilindro protoplasmático constituido por el citoplasma, la
región nuclear, la membrana citoplasmática y la pared celular. El cilindro protoplasmático se halla
rodeado a su vez por una membrana multilaminar llamada capa externa en cuya composición
intervienen proteínas, lipoproteínas, polisacáridos y fosfolípidos13.
Alrededor del cilindro protoplasmático se encuentran un número variable de flagelos
periplásmicos que, según la especie, puede variar entre 2 y más de 100. La composición química
de los flagelos es similar a la de otros flagelos bacterianos.
A diferencia de otras bacterias móviles, las espiroquetas pueden desplazarse en medios de
alta viscosidad a través de un movimiento de sacacorchos. Entre los géneros de bacterias
espiraladas del tipo de las espiroquetas, podemos nombrar Treponema (el Treponema palidum es
el agente etiológico de la sífilis), Borrelia y Leptospira.
En general, estos microorganismos son demasiado delgados para poder ser visualizados
mediante microscopía óptica y por lo tanto deben engrosarse. En la técnica de Fontana-
Tribondeau, se usa ácido tánico como mordiente y luego se realiza una impregnación argéntica con
nitrato de plata amoniacal (solución de Fontana). Es importante que los lavados se realicen con
agua destilada libre de cloruros ya que de otra manera precipitaría cloruro de plata. En los casos
en que la muestra contenga sangre, debe deshemoglobinizarse con líquido de Rouge (ácido
acético- formaldehído-agua). Al aplicar esta técnica de coloración, se verán los microorganismos
marrón oscuro sobre fondo amarillento.
Técnica.
1- Extender la muestra a examinar sobre un portaobjetos.
2- Deshemoglobinizar con líquido de Rouge (ácido acético glacial 1 ml, formol 2 ml y agua 100 ml).
3- Lavar con agua corriente.
4- Fijar vertiendo alcohol sobre el preparado, dejando escurrir y encendiendo el alcohol. Apagar
inmediatamente.
5- Cubrir con la solución de ácido tánico (5 %) y calentar con hisopo encendido hasta emisión de
vapores. Mantener la emisión de vapores durante 30 segundos cuidando que no hierva la
solución. 6-Lavar con abundante agua destilada.
7- Cubrir con solución de Fontana* en frío, mover el preparado hasta que tome color castaño
claro. Calentar y mantener emisión de vapores durante 15 segundos.
8- Lavar con agua destilada, secar entre papeles de filtro y observar con objetivo de inmersión.
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Basualdo, J. A.; Coto, C. E. y de Torres, R. A. 1996. Microbiología Biomédica. Editorial Atlante Argentina S. R.
L.
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Algunas bacterias son capaces de formar por fuera de la pared celular, una envoltura
polimérica llamada cápsula que las protege de la fagocitosis e interviene en fenómenos de
adherencia a diversos sustratos. Pueden encontrarse cápsulas de variada composición química:
polímeros de glucosa y ácido glucurónico ( Streptococcus pneumoniae), polímeros de ácido D-
glutámico (Bacillus anthracis) y polímeros mixtos de proteínas y carbohidratos (Bacillus
megaterium)14.
Las cápsulas pueden observarse como un halo alrededor de las bacterias cuando se
realizan tinciones negativas con nigrosina o tinta china pero pueden colorearse específicamente.
La técnica de Novelli, utiliza un colorante específico para las cápsulas glucídicas que es el Azul
Alcián. Para teñir la bacteria se utiliza fucsina. Se verán bacterias teñidas de rojo rodeadas de la
zona capsular azul.
Técnica.
1- Hacer un extendido del material sobre un portaobjetos, secar y fijar a la llama.
2- Cubrir con solución de Azul Alcián* durante 2,5 minutos.
3- Lavar y escurrir completamente el agua o, mejor aún, dejar que se seque.
4- Cubrir con solución de fucsina diluida (0,1 %) durante 1 minuto.
5- Lavar y secar.
EL MICROSCOPIO OPTICO.
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Davis, B. D.; Dulbecco, R.; Eisen, H. N.; Ginsberg, H. S.; Wood, W. B y Mc Carty, M. 1983. Tratado de
Microbiología. Editorial Salvat. Buenos Aires.
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Geneser, F. 1986. Métodos histológicos. Capítulo 2 en Histología. Editorial Médica Panamericana. Buenos Aires.
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Meynell, G. G. y Meynell, E. 1969. Bacteriología Experimental. Teoría y Práctica. Ediciones Omega. Barcelona.
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y se cierra el diafragma de la lámpara hasta que la imagen de sus bordes llegue justo hasta el
borde del campo visual.
Siguiendo los pasos mencionados, se logrará una correcta iluminación para cada par
objetivo-ocular utilizado y se conseguirá un máximo aprovechamiento de la capacidad de
resolución de cada objetivo.
Es una práctica muy común, utilizar la altura del condensador y los diferentes diafragmas
para regular la intensidad lumínica, sin tener en cuenta que una vez ubicados en la posición
correcta no deben moverse pues se modificaría la apertura numérica y por consiguiente la
resolución. La intensidad de la luz se debe regular a través de filtros o modificando la potencia de
la lámpara.
Enfoque de preparados.
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