2022

Tinción simple y Tinción de Gram

Badillo Badillo Daniela

Hernández Baylon Geraldine
Guadalupe Hernández Esquivel
Monserrat Guadalupe Martínez
Martínez Joanna Michelle Romero
Domínguez Jennifer
Villedas Vasquez Karla
Microbiología
25-6-2022
Introducción
Los microorganismos presentan una gran variedad de formas y tamaños y aunque
algunos pueden ser observados directamente al microscopio óptico, a menudo hay
que fijarlos y teñirlos para aumentar la visibilidad, acentuar las características
morfológicas y conservarlos para su estudio en el futuro, las células teñidas que se
observan con un microscopio deben parecerse lo más posible a las células vivas.
Los métodos de tinción diferencial clasifican a las bacterias en grupos diferentes
según sus propiedades de tinción. Para esta práctica se realizaron dos tipos, la
primera que lleva por nombre tinción simple la cual es un procedimiento de tinción
rápido y sencillo en el cual se emplea un solo colorante, por eso se denomina simple.
Se utiliza principalmente para determinar la morfología y la organización de las
células presentes en una muestra, por otro lado tenemos la tinción de Gram, es una
técnica que además de revelar detalles referentes a la forma y agrupación
bacterianas como cualquier otra técnica de tinción, permite clasificar a las bacterias
en dos grandes grupos: las Gram positivas y las Gram negativas. Las bacterias
Gram positivas conservan el colorante cristal violeta y aparecen de color violeta
oscuro y las Gram negativas pierden el color del cristal violeta y aparecen de color
rojo. La tinción de Gram es muy importante en la identificación de bacterias pues
junto con el análisis de la morfología colonial se pueden identificar algunos géneros
bacterianos. ¹’²’³
Los bacteriólogos fijan por medio de calor frotis bacterianos, cuyo método conserva
adecuadamente la morfología general, pero no las estructuras internas de la célula.
Para observar a los microorganismos será necesario aplicar sobre el frotis alguna
técnica de tinción para diferenciar y hacer más visibles las estructuras celulares.⁴’⁵

Objetivos
Específicos.
●Conseguir una prueba para diferenciar entre una bacteria Gram positiva y Gram
negativa.
●Identificar las diferencias morfológicas que existen entre ambos grupos de
bacterias.
Generales.
o Conocer la importancia de las técnicas de tinción para la observación de
microorganismos.
o Analizar la forma de actuar de los colorantes sobre los microorganismos.
o El alumno aprenderá la técnica de Gram que clasifica a las bacterias en dos
grandes grupos dependiendo de las características de su pared celular.
Marco teórico
Lo primero que tenemos que tomar en cuenta es saber que es la tinción simple y la
tinción de Gram la cual es la tinción simple consiste en un procedimiento de tinción
rápido y sencillo en el cual se emplea un solo colorante, por eso se denomina simple.
Se utiliza principalmente para determinar la morfología y la organización de las
células presentes en una muestra.
Por esto el colorante, cargado positivamente, se ve atraído por las células y se une
a estas de manera espontánea. Es importante tener en cuenta que antes de teñir
una muestra mediante tinción simple, esta debe ser extendida en un portaobjeto.

Imagen 1 Proceso de tinción de Gram

Donde tenemos por otro lado también la tinción de Gram la cual consiste en una
técnica muy sencilla que se basa en el uso de un colorante que permite observar
las bacterias mejor que bajo el microscopio.
La tinción de Gram es un tipo de tinción que se realiza sobre las bacterias para
observarlas mejor bajo el microscopio. Según la distribución del peptidoglicano de
la pared celular que las envuelve, se tiñen de una forma u otra. Así, las bacterias
que no se tiñen mediante esta técnica se denominan Gram negativas. Están
formadas por una pared más fina formada por menos capas de peptidoglicano y una
segunda membrana rica en lípidos que repele la tinción Gram, al microscopio
aparecen incoloras.
Imagen 2 Muestra de cepas observadas en microscopio óptico encontrando Gram
positivas.

Las Gram positivas tienen una pared celular mucho más gruesa, formada por un
gran número de capas de peptidoglicanos entre las que se inserta la tinción Gram,
dando un color violeta intenso al microscopio y se clasifican como Gram +.
Por ello tenemos que las tinciones nos sirven para identificar de la mejor manera las
bacterias que no podemos visualizar a simple vista.

Imagen 3 Muestra de cepas observada en microscopio óptico encontrando Gram

negativas

Si es así, la prueba muestra si la infección es grampositiva o gramnegativa. La

tinción de Gram también puede usarse para diagnosticar infecciones por hongos.
Los tiempos de tinción para la mayoría de estos colorantes son relativamente cortos.
Generalmente oscilan entre los 30 segundos hasta los 2 minutos, dependiendo de
la afinidad del tinte
Tinción simple: El colorante utilizado sirve solo para denotar la morfología celular.
Tinción diferencial: El colorante utilizado pone de manifiesto diferencias entre
células bacterianas o entre partes de una misma célula.
Para detectar la presencia e identificar el tipo de microorganismos bacterias o a
veces hongos en una muestra obtenida de la zona en la cual se sospecha que existe
una infección; para clasificar de forma general bacterias obtenidas a partir de un
cultivo, para posteriormente poder realizar otras pruebas de identificación de
microorganismos y seleccionar el tratamiento adecuado.
Materiales y reactivos
Materiales Reactivos
Matraz con 20 mL de agua destilada Cristal violeta
Portaobjetos Safranina
Asa bacteriológica Lugol
Lampara de alcohol Alcohol acetona
Marcador indeleble
Puentes de coloración
Microscopio óptico
Torundas de alcohol
Pizeta con agua destilada
Cepas puras de bacterias (crecidas
de 18 a 24 grados)

Metodología
Frotis a partir de cultivos en medio líquido.

1. Se marcó en un extremo los portaobjetos limpios y desengrasados

2. Se colocó en el asa estéril una gota del cultivo, justo en el centro del
portaobjetos extendiendola un poco para formar una película delgada y
uniforme.
3.Se seco al aire.
4. Se fijó con calor en el mechero de tal manera que se secara la muestra pero no se quemara el
portaobjetos ni la muestra
5. Con el marcador indeleble señalar su ubicación en el portaobjetos para
facilitar la observación al microscopio
Tinción simple de los frotis
1. Se colocó el portaobjetos con el frotis en el puente de coloración
2. Cubrimos con unas gotas de alguno de los colorantes y dejamos actuar durante 1 minuto.
3. Se tomó el portaobjeto por un extremo y escurrimos el colorante.
 4. Se lavó el exceso de colorante con un chorro suave de agua corriente.

5. Mientras tanto se dejó secar al aire.

7. Observamos al microscopio los portaobjetos, primero en 10 X, después 40x y finalmente con el
objetivo de inmersión.
8. limpiamos perfectamente los objetivos del microscopio, utilizando torundas con alcohol.

Tinción simple de los frotis

1. Colocamos el portaobjetos con el frotis en el puente de coloración.
2. Se cubrió con unas gotas de alguno de los colorantes y dejarlo actuar
durante 1 minuto.

3. Tomamos el portaobjetos por un extremo y escurrimos el colorante.

4. Lavamos el exceso de colorante con un chorro suave de agua corriente.

5.Dejamos secar al aire y realizamos lo mismo con los otros frotis

6.Observamos al microscopio las preparaciones, primero en 10 X, después 40x y finalmente
con el objetivo de inmersión.

Técnica de tinción de Gram.

1. Se prepararon frotis de las muestras en el puente de coloración.
2. Se cubrieron con la solución cristal violeta y se deja actuar el colorante por
1⁄2 min.

3. Se lava con agua corriente para eliminar totalmente el colorante.

4. Se agregó la solución de yodo y se dejó actuar durante ½ min.
5. Se escurrio y se lavó con un chorro suave de agua corriente
6. Se decoloró con alcohol-acetona (de 3 a 5 segundos) e inmediatamente se lavó con agua
corriente.
7. Se cubre el frotis con safranina y se deja actuar durante ½ min.
8. Se dejó secar al aire y se observó al microscopio óptico, primero con el
objetivo de 10X, posteriormente con los de 40X y 100x

Resultados y análisis de resultados.

TINCIÓN GRAM
De acuerdo con la práctica realizada se pudo observar e identificar lo siguiente, el
pulque en el Agar de Mac Conkey se pudo observar en el microscopio levaduras de
con forma de coccus ya que son de forma circular, de color moradas, estas se
encuentran agrupadas de forma conjunta, son Gram positivas debido al tamaño
observado, es decir, que puede oscilar de un 1 ,5 a 2.2 mm de diámetro.
Imagen 4 Levadura del pulque observada en un microscopio óptico a 40x

Imagen 5 Levadura del pulque observada en un microscopio óptico a 4x

Imagen 6 Levadura del pulque observada en un microscopio óptico a 100x

Tinción Simple
De acuerdo a la práctica tensión simple se realizó en el medio de cultivo de Agar de
Sali Maliton con el hisotopado de la garganta previamente hecho, en este se puede
observar de un tamaña grande por lo tanto es una Gram positiva, es de color rosa
ya que fueron teñidas con safranina lo que permitió visualizar de mejor forma, estas
se identifican como estafilococos.
Discusión
De acuerdo a los resultados obtenidos en la práctica podemos decir que son Gram
positivos ya que todos se tiñeron de color morado por lo que si se hubieran teñido
de color rojo estás serían Gram negativas, en este caso no fue así lo que nosotros
observamos en el microscopio fueron levaduras Gram positivas que fueron
provenientes de una muestra de pulque.
Hans Christian . (2018). Tinción de Gram . En Microbiología (34). Monterrey :
Editorial Monterrey
TINCION SIMPLE
De acuerdo a los resultados obtenidos podemos decir que las bacterias que vimos
eran positivas ya que todas se tiñeron de rosa, en caso de tener negativas no
hubieran tenido ningún color ya que solo le agregamos safranina en la muestra de
hisotopado
Conclusión
Se vieron bacilos Gram positivos estos los diferenciamos por el color y tamaño, hubo
presencia de levaduras debido a que el medio lo permitió, por lo tanto, no son
propias para la tinción de Gram ya que no son bacterias, pertenecen al reino fungi.
Cuestionario
CUESTIONARIO Tinción simple
1. ¿Qué es la fijación?
Proceso por el cual se preservan y se fijan en una posición los microrganismos de
la forma más parecida posible a la de las células vivas
2. ¿Cuáles son los mecanismos que utilizan los colorantes para adherirse a
las estructuras celulares?
Por afinidad química elemental: Colorante ácido se une a estructura básica, y
viceversa, para resaltar estructuras en tejidos biológicos que van a ser observados
con la ayuda de diferentes tipos de microscopios. Los diferentes colorantes pueden
ser utilizados para aumentar la definición y examinar grandes cortes de tejido
3. Describe los dos métodos de fijación que se pueden emplear.
La fijación por calor se utiliza de forma rutinaria para observar procariotas.
Normalmente una película de células se calienta suavemente pasando el
portaobjetos por una llama.
La fijación química se utiliza para proteger las subestructuras celulares finas y la
morfología de los microrganismos más grandes. Los fijadores químicos penetran en
la célula y reaccionan con los componentes celulares, normalmente se unen a
proteínas y lípidos para inactivarlos, insolubilizarlos e inmovilizarlos.
4. ¿Cuál es el objetivo de una tinción?
Las moléculas de un colorante se adsorben a una superficie. El uso de colorantes
permite cambiar el color de las células de los microorganismos y poder realizar la
observación en microscopio óptico.
5. ¿Qué tipos de tinciones existen?
Tinción de Gram. Tinción de Ziehl-Neelsen Fundamento, Tinción de ácido alcohol
resistencia, Tinción de endosporas. Tinción de estructuras específicas. Tinción de
flagelos.
6. Plantea una actividad biotecnológica donde apliques esta práctica.
La actividad a plantear es la determinación de bacterias mediante diferentes
muestras de un experimento o proyecto llevado a cabo para un análisis
microbiológico y mediante esta tinción identificar cada una de las bacterias que no
podemos ver mediante la tinción y poder ver en el microscopio.

CUESTIONARIO (Tinción de Gram)

1. ¿Cuál es el objetivo de la tinción de Gram?
Detectar bacterias en el lugar donde se sospecha una infección, como la garganta,
los pulmones, los genitales o las lesiones en la piel. Las tinciones de Gram también
se pueden usar para detectar bacterias en ciertos fluidos corporales.
2. ¿Cuál es el paso crítico de la coloración de Gram? Diga por qué.
El paso crítico en la tinción de Gram es el paso de descoloración, que puede ser
influenciado por el espesor del frotis. Por lo demás, una solución deco- lorante
fresca es muy reactiva, por lo que el resultado debería ser evalua- do
cuidadosamente.
3. Escriba tres ejemplos de bacterias Gram positivas y tres de Gram negativos.
Streptococcus y Staphylococcus aureus, así como bacterias que causan ántrax,
difteria y síndrome de shock tóxico, y Gram negativos son Escherichia coli,
Salmonella, Hemophilus influenzae
4. ¿Qué otros microorganismos además de las bacterias se tiñen con la
coloración de Gram?
También para algunos hongos y parásitos; no obstante, esta técnica tiene algunos
inconvenientes, como la contaminación con otros microorganismos
5. ¿Qué efecto tiene el decolorante sobre la pared celular?
El grosor de la pared celular más la deshidratación por acción del solvente
decolorante que impide la salida del complejo Cristal Violeta-Iodo, también sea la
causa por la cual las levaduras se tiñen como microorganismos Gram positivos,
aunque su estructura química sea distinta
6. ¿Qué relación tiene la composición de la pared celular bacteriana con la
tinción de Gram?
La pared celular es responsable de lo que le sucede al colorante utilizado en la
Tinción de Gram. La propiedad de teñirse o no de violeta oscuro Gram positivas o
Gram negativas, por esta coloración es un criterio de clasificación importante
correlacionable con otras propiedades bacterianas.
7. Plantea una actividad biotecnológica donde apliques esta práctica.
La actividad a plantear es un análisis microbiológico mediante los cultivos de ellos,
donde tenemos que para detectar las bacterias que no son vistas a simple vista con
la tinción de Gram podemos identificarlas en el microscopio.
Bibliografías
1.Álvarez M. C. y Mendoza E. S. Manual Básico de Bacteriología. 1ª. Ed, UNAM,
México. 1994.
2. Elmer W. Koneman, M.D. Diagnóstico Microbiológico.3ªed. Panamericana.
México, 1998.
3. González M., Hinojosa R. Lares V. et al. Manual de Prácticas de Microbiología
General. IPN, México 1986
4. Madigan M., Martinko J. y Parker J. Brock; Biología de los Microorganismos. 8ª.
Ed. Prentice Hall. México, 1998.
5. Prescott L., Harley J. y Klein D. Microbiología. 4ª. ed. McGraw-Hill
Interamericana. México, 1999.
Dr. Hans Christian Jaochim Gram: Inventor of the Gram Stain. Madani, Kaivon. 5,
Florida :s.n., 2003, Elsevier, Vol. 10.
L.M Presscott, J.P. Harley, D.A Klein. Microbiology. S.l. : McGraw-Hill, 2002.
T.D Brock, D.W. Smith, M.T Madigan. Microbiología. Barcelona : 4ta ed. Ed. Prentice
Hall, 1987.
J. Heritage, E.G.V. Evans, R.A. Killington. Introductory Microbiology. S.l. : Ed.
Cambridge University Press, 1996.