Guia Practico 7

1
UNIVERSIDAD TECNICA FEDERICO SANTA MARIA

DEPARTAMENTO DE QUIMICA Y MEDIO AMBIENTE
CATEDRA DE MICROBIOLOGIA AMBIENTAL
MANUAL DE LABORATORIO
PRACTICO 7:
Antibióticos y determinación de la sensibilidad de una bacteria a gentes
Antimicrobianos.
Antibiograma y determinación de la CMI y CMB
Desde 1929, en que Fleming aisló la penicilina a partir de un hongo, Penicillium

notatum, hasta nuestros días han sido sólo puestos a nuestra disposición para la lucha contra
las enfermedades bacterianas gran cantidad de agentes antibacterianos, antibióticos o
quimioterápicos. A diferencia de los antibióticos que son sustancias químicas producidas
por microorganismos o derivados semisintéticos de éstas, los quimioterápicos son
productos de síntesis química, pero con la propiedad común de estar dotados de actividad
antibacteriana. Todas las bacterias no tienen la misma sensibilidad a los distintos
antibacterianos.
La evaluación de esta sensibilidad nos va ayudar en la selección del compuesto más

adecuado para el tratamiento de una infección bacteriana. Las pruebas más utilizadas para
evaluar la sensibilidad de una bacteria a un agente antibacteriano están basadas en el
enfrentamiento in vitro de la bacteria con distintas concentraciones del agente.
La sensibilidad de una bacteria a un antibiótico determinado viene dado por la

concentración mínima inhibitoria (CMI), que se define como la menor concentración de
antimicrobiano capaz de inhibir el desarrollo de una cepa bacteriana dada. Así, si se logra
alcanzar en el organismo la CMI con dosis terapéuticas, podremos afirmar que la cepa es
sensible al antibiótico. En caso contrario, tendremos que decir que la cepa es resistentes.
Una cepa es moderadamente sensible cuando la CMI de ese antibiótico se alcanza en el
organismo con una dosis más elevada que la dosis terapéutica habitua, sin llegar a ser
tóxica. A veces la CMI se suele encontrar en los límites entre sensible y resistente, lo que se
llama puntos de corte o concentraciones críticas; en este caso se clasifica la cepa como
intermedia y se aconseja repetir la prueba.
Algunos métodos permiten además determinar lo que se denomina concentración

mínima bactericida (CMB), que es la menor concentración de antimicrobiano capaz de
destruir una cepa bacteriana dada.
Los métodos más utilizados para determinar la sensibilidad de una bacteria a

agentes antimicrobianos son: la difusión en agr (antibiograma) y la dilución en caldo o
agar.
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Profesor Dr. Bernardo Prado, Profesora Magister María Elisa Escobar Departamento de Química y
Medio Ambiente UTFSM Sede Viña del Mar
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Objetivo.
-.Determinar la sensibilidad bacteriana a distintos antibióticos utilizando una metodología

sencilla y asequible a cualquier laboratorio de Microbiología.
Material
- Cepas bacterinas: Staphylococcus aureus o Escherichia coli

- Caldo de tripticasa soja (TSB) o infusión cerebro corazón (BHI)
- Placas de agar de Mueller-Hinton (M-H)
- Solución salina estéril (SS).
- Discos comerciales de antibióticos
- Hisopos estériles
- Pinzas de laboratorio
- Asa de platino
- Estufa de incubación a 37ºC
- Regla o calibrador
Nota: se utiliza tb Estándar 0,5 de McFarland, pero para efecto de docencia no es necesario
su uso.
Fundamento.
El antibiograma por el método de difusión en agar es una prueba en la que se

enfrenta la bacteria inoculada sobre la superficie de un medio de agar a una solución
antibiótica absorbida en discos de papel de filtro o en pastillas. Este método fue
estandarizado y los halos de inhibición obtenidos, correlacionados con la cMI por Bauer y
cols.,en 1966. Este estudio dio lugar al método de Kirby-Bauer, que es el recomendado por
la Food and Drug Administration (FDA) y el National Committee for Clininical Laboratory
Standards (NCCLC), aunque con ligeras modificaciones. Varios factores afectan el halo de
inhibición: la carga de antibiótico en los discos, la difusión del antibiótico en el medio de
cultivo, el tamaño del inóculo bacteriano, la composición y grosor del medio de cultivo , la
velocidad del crecimiento bacteriano y el tiempo de incubación.
El medio de cultivo más frecuentemente empleado es el de Mueller-Hinton, que

permite el crecimiento de casi todas las bacterias. Este medio puede ser suplementado con
un 5% de sangre desfibrinada de caballo, oveja u otro animal, cuando la bacteria lo requiera
para su desarrollo. El pH del medio debe estar entre 7.2 y 7.4, y el grosor entre 4 y 6 mm.
Los discos de antibióticos son adquiridos comercialmente, aunque también pueden ser
preparados. Deben contener la cantidad establecida de antibiótico y ser conservados a 4ºC
protegidos de la humedad.
El inóculo bacteriano debe tener una turbidez similar al 0,5 de la escala de

McFarland, aproximadamente 108 UFC/mL, y se prepara en solución salina estéril o caldo
de cultivo. La inoculación se puede efectuar con hisopo de algodón estéril.
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Las placas se deben incubar a 35-37ºC en atmósfera aerobia. Se debe evitar en lo

posible la incubación en presencia de CO2, ya que modifica el pH del medio y esto puede
afectar la actividad de algunos antibióticos.
La lectura se debe realizar entre 18 y 24 horas. Este método es adecuado únicamente

para bacterias patógenas de crecimiento rápido. Una incubación más prolongada puede dar
lugar a interpretaciones erróneas del halo de inhibición.
Cuando se agrega un antibiótico a un cultivo bacteriano en crecimiento exponencial, se

observan tres tipos diferentes de efectos:
(a) BACTERIOSTÁTICO: en este caso se observa inhibición en la proliferación,

pero sin que ocurra muerte celular. Los agentes bacteriostáticos frecuentemente son
inhibidores de la síntesis proteica y actúan uniéndose a los ribosomas. Sin embargo, este enlace
no es muy estrecho y cuando disminuye la concentración del antibiótico, éste se libera de los
ribosomas y se presenta nuevamente la proliferación. Ejemplo: Cloramfenicol, Eritromicina,
Tetraciclina.
(b) BACTERICIDA: evitan la proliferación e inducen a la muerte, pero no tiene lugar

la lisis o ruptura celular; éstos generalmente se unen muy íntimamente con sus blancos
celulares y no pueden eliminarse por dilución. Ejemplo: Estreptomicina, Neomicina (por fuerte
unión al ribosoma), Actinomicina, Mitomicina (por unión al DNA).
(c) BACTERIOLÍTICO: inducen la muerte por lisis celular, lo que se observa como
una disminución en el número de células o en la turbidez después de que se agrega dicha
sustancia. Los bacteriolíticos que inhiben la síntesis de la pared celular, como la Penicilina y
Cicloserina, así como los agentes que actúan sobre la membrana celular, como la Polimixina.
Debido al gran aumento de antibióticos usados en quimioterapia ha surgido un

problema aun mayor que la enfermedad, y es que muchas bacterias se han hecho resistentes a
estos antibióticos. Las bacterias son resistentes a los antibióticos cuando pueden multiplicarse
en presencia del mismo, impidiendo la acción del antibiótico. Algunas especies que son
normalmente sensibles a un antibiótico pueden después adquirir resistencia frente a este.
A continuación se mencionan los sitios activos en donde el antibiótico actúa y cuales
son las concentración que se necesita del antibiótico para inhibir o suprimir el crecimiento de
un determinado microorganismo y a cuales son sensibles.
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Niveles de acción de los antibióticos

A nivel celular y subcelular, la mayoría funcionan de una de las siguientes formas:
1.- Inhibición de la síntesis de la pared celular: Cicloserina, Penicilina
a) Penicilina: Inhibe selectivamente la síntesis de pared celular bacteriana al bloquear

la actividad de la enzima transpeptidasa. Esta enzima media la formación de enlaces cruzados
entre las hebras lineares de los glucopéptidos. Este antibiótico, generalmente, es producido por
el hongo Penicillium notatum, aunque también puede ser sintetizado por otros hongos del mismo
género, e incluso por hongos distintos a Penicillium notatum.
b) Cicloserina: Es un antibiótico activo contra muchos tipos de microorganismos,

tanto Gram (+) como Gram (-), incluyendo coliformes, Proteus y bacilos tuberculosos, por lo
cual se ha aplicado con éxito en el tratamiento de la tuberculosis. Actúan inhibiendo la
incorporación de D-Alanina en el peptidoglicano de las paredes bacterianas, bloqueando la
alanin-racemasa (enzima que incorpora D-Alanina al peptidoglicano). Esto se debe a que el
antibiótico presenta una estructura similar a la D-Alanina.
2.- Alteración de la permeabilidad de la membrana: Anfotericina B, Polimixina,

Nistatina
a) Anfotericina B: Es un antibiótico producido por una especie de Streptomyces, tiene

propiedades antibacterianas poco importantes, pero inhibe intensamente el crecimiento de
varios hongos patógenos, tanto in vivo como in vitro. La anfotericina se liga a los esteroles de
la membrana celular del hongo y trastorna su función.
b) Polimixina: Recubre la membrana celular de las bacterias y destruye su función

osmótica de barrera de la permeabilidad selectiva. Actúan como detergentes catiónicos. Son
bactericidas enérgicos para bacilos Gram (-), incluyendo Pseudomonas resistentes a otros
antibióticos que pueden causar septicemia.
c) Nistatina: Es eficaz en infecciones por Candida y hongos en general. Su actividad se

complementa con la de la Anfotericina B.
3.- Inhibición de la síntesis proteica: Streptomicina, Tetraciclina, Cloramfenicol
a) Streptomicina: Este antibiótico es producido por Streptomyces griseus. Se une a la

subunidad 30S del ribosoma, cambiando su conformación, lo que impide la interacción entre el
codón del mRNA y el anticodón del tRNA. El mensaje puede ser leído deficientemente
produciendo proteínas no funcionales. Es un bactericida efectivo tanto contra bacterias
Gram(+) como Gram (-).
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b) Tetraciclina: Impide la unión de nuevos aminoácidos a la cadena polipeptídica

naciente porque se une a la subunidad 30S del ribosoma bacteriano y bloquea la inserción del
tRNA cargado con aminoácidos. Es producida por algunas especies del género Streptomyces,
existiendo una variedad de compuestos isomórficos de tetraciclina. Las tetraciclinas son
principalmente agentes bacteriostáticos.
b) Cloramfenicol: Es una sustancia que se obtiene del cultivo de Streptomyces venezuelae.

Es un efectivo agente inhibitorio de la síntesis proteica. Bloquea la unión de los aminoácidos
de la cadena peptídica naciente en la unidad 50S de los ribosomas, interfiriendo con la acción
de la peptidil-transferasa. El cloramfenicol es, principalmente, un bacterisotático. Esta
inhibición se debe a que el antibiótico se fija a la unidad 50S.
El cloramfenicol, junto con las tetraciclinas, constituyen el grupo de “antibióticos de amplio

espectro”, eficaces contra un mayor número de microorganismos, incluyendo bacterias Gram
(+) y Gram (-).
4.- Inhibición de la síntesis de ácidos nucleicos: Ácido Nalidíxico, Rifampicina
a) Ácido Nalidíxico: Inhibe la actividad de la enzima Girasa, que es la que permite el

superenrrollamiento del DNA.
b) Rifampicina: Es producida por Streptomyces mediterranei. In vitro es efectiva contra

algunos cocos Gram (+) y Gram (-). Este antibiótico se liga fuertemente a la RNA polimerasa
DNA dependiente libre, alterando su estructura y, por lo tanto, inhibe la síntesis de RNA.
Resistencia a los Antibióticos

Existen muchos mecanismos mediante los cuales, los microorganismos, podrían
exhibir resistencia a los antibióticos. Algunos de ellos son:
1.- Producción de enzimas que destruyen el medicamento activo
Ejemplos:
- La enzima -lactamasa producida por Staphylococcus. Hidroliza a la penicilina.
- La cloramfenicol-acetil-transferasa. Destruye el cloramfenicol.
2.- Los microorganismos cambian su permeabilidad al medicamento
Ejemplos:
- Las tetraciclinas se acumulan en bacterias susceptibles, pero no en las resistentes.
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Determinación de la Sensibilidad de los Microorganismos frente a los Antibióticos

Son los procedimientos que se emplean para seleccionar el antibiótico que ejerza una
mejor acción antibacteriana sobre una determinada cepa microbiana.
El método empleado para efectuar esta determinación se denomina
ANTIBIOGRAMA. Este examen es necesario para completar el estudio de una cepa
microbiana aislada de una muestra patológica e identificada, pues permite conocer, in vitro, la
sensibilidad a los diversos antibióticos de uso en la práctica médica.
Con la aparición de cepas antibiótico-resistentes, cada día más frecuentes, éste ha
pasado a ser un examen de gran importancia y nos da una idea clara de las posibilidades de
tratar una infección con probabilidad de éxito.
Espectro de acción del antibiótico

Los antibióticos y sus concentraciones se fabrican dentro de un rango que no sea
tóxico en su aplicación en quimioterapia. Una vez determinada la concentración apropiada se
puede averiguar su espectro de acción sobre una variedad de microorganismos.
Técnica: Se preparan placas que contengan medio de cultivo más el antibiótico a la

concentración determinada. Una vez solidificadas, se pone una plantilla numerada bajo cada
placa y se siembran diferentes cepas bacterianas por picadura o depositando una gota del
cultivo. Luego de la incubación se verifica qué cepas fueron capaces de crecer y cuáles no. Es
importante no utilizar cepas invasoras que dificultan la determinación.
Antibiograma (o Método por Difusión en Agar; o Método de Kirby Bauer)
Está basado en la propiedad que tienen los antibióticos de difundir a través del agar, de
modo que las cepas sembradas quedan en contacto con el antibiótico.
Los laboratorios comerciales han preparado discos especiales para este fin, llamados
sensi-discos. Cada uno de ellos está marcado claramente por ambos lados con una sigla que
indica el antibiótico que contiene. Son estables, pero de duración limitada.
Se pueden preparar discos en el laboratorio. Para esto se debe conocer la cantidad de
líquido que absorbe cada disco esterilizado, preparando una dilución de antibiótico adecuada,
para que el disco quede con una dosis determinada y útil. Los discos se deben guardar en el
refrigerador.
Ejercen una gran influencia en los resultados obtenidos, el pH y la concentración del
medio, la cantidad de inóculo, la concentración del agar, el tiempo y temperatura de
incubación.
En términos generales, existen escalas que se aplican a la lectura de los antibiogramas

hechos con el método de los discos de papel, una de las cuales es la siguiente:
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Zona de Inhibición Sensibilidad de la cepa

0 a 10mm de diámetro Resistente
10 a 15mm de diámetro Medianamente resistente
15 a 25mm de diámetro Sensible
25mm o más de diámetro Muy sensible
Realización del antibiograma
➢ Depositar, con pipeta, un volumen de 0,1ml de la bacteria crecida en el medio de

cultivo líquido, sobre la placa de medio de cultivo sólido (Figura 1ª). Esparcir
homogéneamente el inóculo con un cotolín estéril. (Figura 1b)
➢ Depositar con una pinza un máximo de tres discos distintos sobre la superficie del
medio sólido recién sembrado , como se observa en la (Figura 1c)
➢ Incube las placas invertidas a temperatura ambiente, o idealmente a 35ºC.
➢ Observar resultados según figura 2.
Figura 1: Como realizar un antibiograma
1ª) Agregar 0,1 ml del cultivo
1b) Distribuir el inóculo con una

tórula por toda la superficie del agar
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1c) Por los discos de antibióticos

sobre la superficie del agar
Figura 2: Resultados de un antibiograma
Resistente Sensible
Medianamente resistente
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Interpretación: los diámetros de los halos de inhibición se traducen a las categorías de

resistente (R), intermedio (I),moderadamente sensible (MS) o sensible (S), de acuerdo a
los criterios interpretativos de la tabla 30-1
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Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) y de la

concentración mínima bactericida (CMB)
Los métodos más utilizados para la determinación de la concentración mínima

inhibitoria (CMI) son los métodos de dilución. Al final de este capitulo se describirá la
técnica Etest, un procedimiento novedoso que permite la determinación CMI empleando la
difusión en agar. Los métodos de dilución pueden realizarse en medio sólido (dilución en
agar) o en medio líquido (dilución en caldo). Diluciones dobles seriadas de un antibiótico
determinado se enfrentan con una bacteria, y la menor concentración de antibiótico
expresada en Unidades/mL o ug/mL, que inhibe el desarrollo de la bacteria, se conoce
como CMI. Estos resultados pueden ser interpretados y trasladados a las categorías
cualitativas de sensible (S),moderadamente sensible (MS), intermedio (I) o resistente (R)
utilizando la tabla 31-1
El medio normalmente utilizados es el medio de Müeller-Hinton, pero puede ser

suplementado o incluso sustituido para bacterias exigentes.
El método de dilución en caldo fue originariamente realizado en tubos de

hemólisis (13*10 mm), con un volumen de caldo con 1 mL de antimicrobiano
(macrométodo). Hoy en día los sistemas serológicos de dispensación y dilución han
permitido su adaptación a microplacas de 96 pocillo, utilizando volúmenes de 50-200 uL
(micrométodo). El micrométodo permite testar un gran número de antibióticos de forma
sencilla, rápida y económica. Además ha hecho posible la comercialización de esta técnica
mediante el empleo de placas ya preparadas con las soluciones antibióticas congeladas o
desecadas.
Junto a la CMI es necesario a veces evaluar el efecto bactericida de un antibiótico

sobre una bacteria determinando la concentración mínima bactericida (CMB). La CMB
se puede calcular partiendo del método de dilución en caldo, generalmente macrométodo, y
determinando la proporción de bacterias viables después de 18-24 horas de contacto cone l
caldo que contiene el antibiótico.
En la determinación de la CMI mediante el método de dilución en caldo, al ir

disminuyendo la concentración de antibiótico se observará que no hay desarrollo de
microorganismos por la ausencia de turbidez, hasta llegar a un tubo a partir del cual
comienza a haber un aumento de turbidez y, por tanto, desarrollo bacteriano. Definimos la
CMI como la mínima concentración de antibiótico que inhibe el desarrollo de una
bacteria. No obstante, si hacemos subcultivos de los tubos donde no hay turbidez,
observaremos que este proceso de inhibición bacteriana es reversible a nivel del tubo de la
cMI e incluso en concentraciones mayores. Esto aparece sobre todo con antibióticos
bacteriostáticos.
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Con antibióticos bactericidas hay una concentración en la cual no pueden

recuperarse bacterias viables tras el subcultivo, y por tanto tampoco en concentraciones
superiores. Esta concentración es denominada concentración mínima bactericida (CMB) y
se define como la menor concentración de un antibiótico que reduce al 0,1% o menos
el número de bacterias del inóculo original, o sea, una reducción de 1.000 veces el
inóculo original, o, lo que es lo mismo, reduce el inóculo inicial en 99,9%. Aunque esta
definición es arbitraria, es la adoptada por la mayor parte de microbiólogos clínicos.
OBJETIVOS.
1. Determinar la CMI por el macrométodo de dilución en caldo e interpretar los

resultados en categorías de sensibilidad.
2. Determinar la CMB por la técnica de Etest
MATERIALES.
- Cepa bacteriana (recomendable Staphylococcus aureus o Escherichia coli)

- Caldo de tripticasa soja (TSB)
- Placas de agar tripticasa soja (TSA)
- Placas de agar sangre
- 20 tubos con 1 mL de caldo de Müeller- Hinton
- 1 tubo con 1,8 mL de caldo Müeller-Hinton
- Solución salina estéril
- Antibiótico que hay que ensayar
- Estándar 0,5 de la escala de McFarland*
- Pipetas estériles (1.5 mL y 10 mL)
- Asa de Drigalski
- Estufa incubadoir a 37ºC
- Agitador de tubo tipo Vortex
• Preparación del estándar 0,5 de McFarlan: añadir 0,05 mL de BaCl 2 0.048 M

(1,75% p/v) de BaCl2*2H2O) a 9,95 mL de H2SO4 0,36N (1% v/v).
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PROCEDIMIENTO.
1. Preparar cultivos de 18 horas de las bacterias a testar en agar tripticasa soja

suplementado con un 5% de sangre. También se puede emplear agar infusión
cerebro corazón o agar de Müeller – Hinton.
2. Inocular 3 o 4 colonias aisladas en 5 mL de caldo TSB e incubar en un baño a 37ºC

hasta que la turbidez sea visible (2-5 horas). Ajustar la turbidez con so9lución salina
o caldo de cultivo estéril hasta una turbidez equivalente al estándar 0,5 de la escala
de MacFarland, aproximadamente 106 UFC/mL.
3. Realizar una dilución al 1/100 de este inóculo (0,2 mL del inóculo en 19,8 mL de
caldo de Müeller –Hinton). Sí obtendremos un inóculo de aproximadamente 10 6
UFC(mL.
4. Preparar 15 tubos con 1 mL de caldo Müeller-Hinton y otro con 1,8 mL. Preparar
una solución madre de antibiótico a una concentración de 5.120 ug/mL (tabla 31-2)
5. Añadir 0,2 mL de la solución madre de antibiótico al tubo que contiene 1,8 mL de

caldo (concentración de antibiótico en este tubo= 512 ug/mL). A partir de este tubo,
preparar diluciones dobles seriadas tomando 1 mL del primer tubo (512 ug/mL) y
transfiriéndolo al segundo (la concentración de antibiótico en este tubo será de 256
ug/mL).
Después de mezclar bien el contenido del segundo tubo, transferir con una pipeta
diferente 1 mL al tercer tubo (128 ug/mL) y así sucesivamente hasta el tubo 14, del
cual se toma 1 mL y se descarta. De esta manera habremos obtenido diluciones
dobles del antibiótico desde 512 ug/mL hasta 0,0625 ug/mL.
6. Añadir a cada tubo con antibiótico 1 mL del inóculo preparado en el punto 3 que
contiene aproximadamente 106 UFC/mL. Esto supone un inóculo final aproximado
de 5*105 UFC/mL. Las concentraciones finales de antibióticos serán ahora desde
256 ug/mL hasta 0,03125 ug/mL.
7. Para comprobar el recuento del inóculo real: añadir 1 mL del inóculo al tubo
restante con caldo de cultivo y sin antibiótico.
Preparar 3 diluciones decimales sucesivas a partir de este tubo. Tomar 0,1 mL de
cada dilución y dispensar en placas de agar sangre y distribuir uniformemente con
una asa de drigalski estéril. Sembrar las placas por duplicado.
8. Incubar los tubos con antibióticos (punto 6) y las placas de agar sangre (punto 7) a
37ºC durante 18 horas.
9. Al día siguiente leer los resultados y anotar la CMI. Agitar en un vortex los tubos
donde no ha habido desarrollo bacteriano e incubar otras 4 horas. Volver a anotar la
CMI.
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10. Contar las colonias de las placas de agar sangre inoculadas con las diluciones del
inóculo (recuento real del inóculo, punto 8). Determinar el número de colonias que
representa el 0,1% del inóculo real (99,9% de reducción).
11. A partir de cada uno de los tubos sin desarrollo bacteriano inocular una placa de
agar sangre con 0,1 mL y extenderlo con una aza de drigalski.
12. Incubar las placas 18 horas a 37ºC.
13. Contar el número de colonias en las placas para la determinación de la CMB.
Interpretación de los resultados. Se considera CMI como la correspondiente al tubo con

menor concentración de antibiótico donde no ha habido desarrollo bacteriano, demostrado
por la ausencia de turbidez. Los resultados de la CMI pueden ser interpretados en las
categorías de sensible, moderadamente sensible, intermedio o resistente de acuerdo con la
tabla 31-2
Se considera CMB como la menor concentración de antibiótico cuyo subcultivo produce un

número de colonias menor al 0,1% del inóculo original (< 50 UFC).
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DETERMINACION DE LA CMI MEDIANTE LA TECNICA DE ETEST.
FUNDAMENTO
La técnica de Etest es un nuevo método que combina los métodos de difusión en

agar y la dilución para determinar la CMI. Es un método tan simple como la difusión en
agar pero que, además, proporciona la CMI. La sistemática es similar a la del método de
difusión en agar, pero en lugar de discos utiliza tiras de Etest. Estas tiras contienen un
gradiente del agente antimicrobiano en la superficie inferior. El agente antimicrobiano
difunde en el agar y establece un gradiente continuo del antimicrobiano a lo largo de la tira.
Después de la incubación se forma una zona elíptica de inhibición del crecimiento, y la
CMI se corresponde con el punto donde el borde del área de inhibición del crecimiento
intersecciona con la tira. El rango del gradiente de antimicrobiano es de 0,016 a 256 ug/mL
o de 0,002 a 32 ug/mL. Este rango corresponde con 15 diluciones dobles en los métodos
convencionales de dilución, pero, además, el método de Etest proporciona concentraciones
intermedias.
PROCEDIMIENTO.
Para la determinación de la CMI por el método de Etest, seguir los pasos 1, 2, 3 y 4

de la técnica del antibiograma por difusión en agar.
5.- Coger con unas pinzas la tira por la zona marcada con una “E” y depositarla sobre la
superficie del medio de cultivo, de forma que la tira tome contacto gradualmente.
Utilizar una sola tira de antibiótico por placa de 100 mm  y de 1 a 6 tiras si se utilizan
placas de 150 mm .
6.- Eliminar las burbujas que se hayan formado pasando suavemente las pinzas sobre la tira
(las burbujas pequeñas no interfieren con el resultado).
Nota: nunca volver a colocar la tira una vez que ha tomado contacto con l superficie de la
placa, ya que el antimicrobiano se libera rápidamente.
7.- Incubar la placa en posición invertida a 37ºC durante 18 horas.
Interpretación de los resultados: La CMI corresponde con el punto donde el borde del
área de inhibición del crecimiento bacteriano intersecciona con la tira. Si no hay inhibición
del crecimiento, la CMI se interpreta como una concentración mayor que la concentración
más alta de la tira.
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MATERIALES
- Tiras Comerciales de Etest. Se recomienda empelar el mismo antimicrobiano que se

utilice para el método de dilución en medio líquido, con el objeto de poder
comparar los resultados.
- Ver el material necesario para realizar el antibiograma por el método de la difusión

en agar.
Si la zona de inhibición del crecimiento no se cruza con la tira, la CMI se interpreta como
una concentración menor que la concentración más baja de la tira.
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UNIVERSIDAD TECNICA FEDERICO SANTA MARIA

Antibiograma y determinación de la CMI y CMB

Desde 1929, en que Fleming aisló la penicilina a partir de un hongo, Penicillium

La evaluación de esta sensibilidad nos va ayudar en la selección del compuesto más

La sensibilidad de una bacteria a un antibiótico determinado viene dado por la

Algunos métodos permiten además determinar lo que se denomina concentración

Los métodos más utilizados para determinar la sensibilidad de una bacteria a

-.Determinar la sensibilidad bacteriana a distintos antibióticos utilizando una metodología

- Cepas bacterinas: Staphylococcus aureus o Escherichia coli

El antibiograma por el método de difusión en agar es una prueba en la que se

El medio de cultivo más frecuentemente empleado es el de Mueller-Hinton, que

El inóculo bacteriano debe tener una turbidez similar al 0,5 de la escala de

Las placas se deben incubar a 35-37ºC en atmósfera aerobia. Se debe evitar en lo

La lectura se debe realizar entre 18 y 24 horas. Este método es adecuado únicamente

Cuando se agrega un antibiótico a un cultivo bacteriano en crecimiento exponencial, se

(a) BACTERIOSTÁTICO: en este caso se observa inhibición en la proliferación,

(b) BACTERICIDA: evitan la proliferación e inducen a la muerte, pero no tiene lugar

Debido al gran aumento de antibióticos usados en quimioterapia ha surgido un

Niveles de acción de los antibióticos

1.- Inhibición de la síntesis de la pared celular: Cicloserina, Penicilina

a) Penicilina: Inhibe selectivamente la síntesis de pared celular bacteriana al bloquear

b) Cicloserina: Es un antibiótico activo contra muchos tipos de microorganismos,

2.- Alteración de la permeabilidad de la membrana: Anfotericina B, Polimixina,

a) Anfotericina B: Es un antibiótico producido por una especie de Streptomyces, tiene

b) Polimixina: Recubre la membrana celular de las bacterias y destruye su función

c) Nistatina: Es eficaz en infecciones por Candida y hongos en general. Su actividad se

3.- Inhibición de la síntesis proteica: Streptomicina, Tetraciclina, Cloramfenicol

a) Streptomicina: Este antibiótico es producido por Streptomyces griseus. Se une a la

b) Tetraciclina: Impide la unión de nuevos aminoácidos a la cadena polipeptídica

b) Cloramfenicol: Es una sustancia que se obtiene del cultivo de Streptomyces venezuelae.

El cloramfenicol, junto con las tetraciclinas, constituyen el grupo de “antibióticos de amplio

4.- Inhibición de la síntesis de ácidos nucleicos: Ácido Nalidíxico, Rifampicina

a) Ácido Nalidíxico: Inhibe la actividad de la enzima Girasa, que es la que permite el

b) Rifampicina: Es producida por Streptomyces mediterranei. In vitro es efectiva contra

Resistencia a los Antibióticos

1.- Producción de enzimas que destruyen el medicamento activo

2.- Los microorganismos cambian su permeabilidad al medicamento

Determinación de la Sensibilidad de los Microorganismos frente a los Antibióticos

Espectro de acción del antibiótico

Técnica: Se preparan placas que contengan medio de cultivo más el antibiótico a la

Antibiograma (o Método por Difusión en Agar; o Método de Kirby Bauer)

En términos generales, existen escalas que se aplican a la lectura de los antibiogramas

Zona de Inhibición Sensibilidad de la cepa

Realización del antibiograma

➢ Depositar, con pipeta, un volumen de 0,1ml de la bacteria crecida en el medio de

Figura 1: Como realizar un antibiograma

1ª) Agregar 0,1 ml del cultivo

1b) Distribuir el inóculo con una

1c) Por los discos de antibióticos

Figura 2: Resultados de un antibiograma

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