Diario de métodos virológicos

Una PCR multiplex para la detección de seis virus en patos

Resumen
En este estudio, se diseñaron y sintetizaron seis pares de cebadores específicos
que pueden amplificar fragmentos de ADN de diferentes tamaños de acuerdo con
las secuencias de genes de proteínas virales publicadas en GenBan. Luego, se
estableció un método de PCR múltiple para la detección rápida del virus de la
hepatitis 1 del pato, el virus de la peste del pato, el virus Tembusu del pato, el
parvovirus del pato moscovy, el reovirus del pato moscovy y el virus de la gripe
aviar H9N2 de pato, y lograr la detección simple y rápida de enfermedades virales
en patos. Se usó PCR única para confirmar la especificidad del cebador, y las
condiciones de PCR se optimizaron para construir un sistema de PCR multiplex.
También se desarrollaron ensayos de especificidad y sensibilidad. La PCR
multiplex se utilizó para detectar embriones de pato infectados con virus mixtos y
aquellos con enfermedades clínicamente sospechosas para verificar la viabilidad
de la PCR multiplex. Los resultados muestran que los cebadores pueden
amplificar específicamente fragmentos diana, sin ninguna amplificación cruzada
con otros virus. El sistema de PCR multiplex puede amplificar seis fragmentos de
ADN de los genomas virales agrupados y detectar específicamente los ácidos
nucleicos de los seis virus susceptibles a los patos cuando la cantidad de plantilla
es 102 copias / μl. Además, el sistema se puede utilizar para detectar ácidos
nucleicos virales en embriones de pato infectados con los seis virus comunes. Los
resultados de detección para muestras clínicas son consistentes con los
detectados por PCR simple. Por lo tanto, el método de PCR multiplex establecido
puede realizar una detección específica, sensible y de alto rendimiento de seis
virus que infectan a los patos y puede aplicarse a la identificación clínica y al
diagnóstico de infección viral en patos.

1. Introducción
La infección viral es una de las enfermedades importantes que ponen en peligro a
los patos. La reciente expansión de la industria del pato, el crecimiento de
modelos de cultivo mixto, la movilidad mejorada de humanos y animales, la mala
calidad del agua causada por la contaminación del agua y varios otros factores
han creado condiciones favorables para la propagación del virus. La incidencia de
epidemias locales de enfermedades virales ha aumentado significativamente, y
nuevas epidemias continúan ocurriendo, causando serias pérdidas económicas a
la industria del pato. Hasta la fecha, los principales virus que infectan a los patos
incluyen el virus de la hepatitis 1 (DHAV-1), el virus de la peste del pato (DPV), el
virus Tembusu del pato (DTMUV), el parvovirus del pato moscovy (MPDV), el
reovirus del pato moscovy (ARV) y el pato Virus de la influenza aviar de baja
patogenicidad H9N2 (H9N2) (Gao, 2016). Una preocupación importante en la
industria del pato es la construcción de un método de detección rápida de estas
infecciones virales para que las medidas preventivas se puedan implementar lo
antes posible y se puedan reducir las pérdidas económicas.
Los métodos para la detección de estas infecciones virales incluyen aislamiento de
virus, identificación de virus, detección serológica, microscopía inmunoelectrónica,
ELISA y técnicas de PCR (Tang et al., 2015; Wu et al., 2001; Li, 2006; Li et al. .,
2016; Xu et al., 2012; Wan et al., 2016). El aislamiento y la identificación del virus
requieren mucho tiempo, mientras que la detección serológica y el ELISA
requieren mucho tiempo y un trabajo agotador. La microscopía de
inmunoelectrones requiere un equipo costoso y un alto nivel de purificación de
virus, lo que limita su posible aplicación en el diagnóstico clínico. La PCR se
puede utilizar para la detección de virus sin aislamiento de virus. Se ha informado
de la aplicación de PCR en tiempo real, LAMP y PCR regular en la detección de
DHV, ARV, MPDV, DPV y el virus de la influenza del subtipo H7 (Li et al., 2016; Xu
et al., 2012; Wan et al. ., 2016; Ji y Wang, 2016; Cheng et al., 2007; Hu et al.,
2004; Hu et al., 2015; Xu, 2012), y muestra las ventajas de alta sensibilidad, alta
velocidad y seguridad. Sin embargo, estos enfoques no pueden usarse para
identificar o diagnosticar seis virus en una prueba. La PCR multiplex (m-PCR) se
refiere a las reacciones de PCR en las que se agregan dos o más pares de
cebadores al mismo sistema de reacción de PCR y se amplifican múltiples
fragmentos de ácido nucleico. Este método sigue el mismo proceso y principios
que la PCR regular, pero con ventajas incomparables sobre la PCR regular
(Chamberlain et al., 1988; Henegariu et al., 1997). En términos de detección de
enfermedades virales y diagnóstico diferencial, la m-PCR puede superar el cuello
de botella de LAMP solo puede detectar un solo virus en una reacción, que puede
detectar e identificar simultáneamente varios virus (Zheng et al., 1995; Kirschberg
et al., 2004; Zen et al., 2016; Shi et al., 2016; Xu et al., 2012; Zhang et al., 2015;
Zeng et al., 2014; Ren et al., 2016). También es un método eficaz para el
diagnóstico rápido de infección por virus mixtos en la práctica clínica. Hasta la
fecha, la m-PCR de las enfermedades virales comunes del pato no se ha
informado local o internacionalmente. Mediante la comparación de las secuencias
de los genes relacionados con diferentes proteínas virales y el diseño de
cebadores de PCR específicos sin amplificación cruzada en la región conservada,
este estudio tiene como objetivo desarrollar un método de detección rápida de m-
PCR para la infección viral de pato.

2. Materiales y métodos
2.1. La colección de cepas de virus y muestras clínicas DHAV-1 -SH, DPV-F34,
DTMUV-JS804 y MPDV-FJM3 fueron suministradas por el Instituto de
Investigación Veterinaria de Shanghai de la Academia China de Ciencias
Agrícolas. ARV-HNF fue suministrado por la Academia de Ciencias Agrícolas de
Fujian. H9N2-C / SH / F / 98 fue suministrado por el Colegio de Medicina
Veterinaria de la Universidad de Yangzhou. Los embriones de pato SPF se
compraron en el Harbin Veterinary Research Institute. El ARV-HNF con la
inoculación del saco vitelino se amplificó utilizando embriones de pato de 4 días.
DHAV-1-SH, DTMUV-JS804, DPV-F34, H9N2- / SH / F / 98 y MPDV-FJM3 con la
inoculación de la cavidad alantoidea se amplificaron utilizando embriones de pato
de 9 días de edad. Las muestras clínicas fueron patos enfermos de granjas de
patos en Jiangsu y Zhejiang.

2.2. Reactivos e instrumentos

El dNTP, el inhibidor de la enzima ARN y el kit de extracción viral ARN / ADN
fueron de TaKaRa (Dalian, China). El marcador de peso molecular 2 × Taqmix y
ADN era de Beijing ComWin Biotech Co. Ltd. (China). Kit de extracto de ADN
plasmídico y la transcripción inversa MMLV
Kit eran de BBI (EE. UU.). El tampón HCI, el inyector, la pipeta de succión, el tubo
de dedo y la cera de parafina estaban disponibles comercialmente. El
termociclador de PCR y la centrífuga refrigerada a baja temperatura eran de
Eppendorf. El espectrofotómetro era de BIO-RAD. El aparato de electroforesis y el
sistema automático de procesamiento de imágenes en gel eran de Shanghai
Tanon Science & Technology Co. Ltd.

2.3. Preparación del genoma viral.

De acuerdo con las instrucciones del fabricante para el ARN / ADN viral
Kit de extracción, los genomas ARN / ADN de los seis tipos de virus fueron
extraído y disuelto con agua de enzimas de ácido no nucleico. La concentración y
la pureza de cada genoma se midieron por espectrofotometría. Los ARN de
DHAV-1, DTMUV, ARV y H9N2 se transcribieron inversamente en ADNc por
MMLV. El ADN / ADNc se almacenó a -80 ° C para uso futuro.

2.4. Diseño y síntesis de imprimaciones.

Las secuencias proteicas publicadas de DHAV-1, DPV, DTMUV, MPDV,
ARV y H9N2 en Genbank se compararon con las secuencias de proteínas de los
virus conservados en nuestro laboratorio. Primer Premier V5.0 y Oligo V6.22 se
utilizaron para evaluar y detectar cebadores en el dominio conservado. Los
cebadores específicos se diseñaron como se enumera en la Tabla 1. Los
cebadores fueron sintetizados por Invitrogen Trading (Shanghai) Co., Ltd.

2.5. Detección de especificidad de cebador

El ADN genómico / ADNc de los DHAV-1, DPV, DTMUV, MPDV, ARV y H9N2
existentes se usaron como plantilla para amplificar los fragmentos diana
correspondientes. El volumen total de cada sistema de reacción fue de 50 μl, que
contenía 5 μl de la plantilla de virus único, 1 μl del cebador directo, 1 μl del
cebador inverso, 25 μl de la enzima 2 × Taqmix y 18 μl de agua. . La amplificación
por PCR se realizó de la siguiente manera: desnaturalización inicial a 94 ° C
durante 4 min, seguida de desnaturalización a 94 ° C durante 30 s, recocido a 52 °
C durante 45 s, extensión a 72 ° C durante 1 min, durante 30
ciclos, con una extensión final a 72 ° C durante 10 min. Al final de la reacción, se
usó una muestra de 5 μl del producto para la electroforesis en agarosa al 1,5%.
Después de la purificación, los productos se clonaron en pMD19-T, denominado
pMD-DHAV-1, pMD-DPV, pMD-DTMUV, pMD-MPDV, pMD-ARV y pMD-H9N2,
que se enviaron a Invitrogen Trading (Shanghai) Co ., Ltd. para la secuenciación
para verificar la precisión del producto amplificado. Mientras tanto, también se
preparó el grupo de control en blanco sin ADN.
Las mezclas de ADN / ADNc de seis genomas virales se usaron como plantillas
para amplificación por PCR. Cada sistema de reacción de 50 μl contenía 23 μl de
la mezcla de ADN / ADNc (en cantidades suficientes), 1 μl del cebador directo, 1 μl
del cebador inverso y 25 μl de la enzima 2 × Taqmix. El procedimiento de reacción
y la electroforesis fueron como se describió anteriormente.

2.6. Construcción del sistema m-PCR

Se mezclaron los seis pares de cebadores de PCR, y luego se usó la mezcla de
ADN / ADNc de los seis genomas virales (en cantidades suficientes) como
la plantilla. El sistema y el procedimiento de PCR única establecidos, así como las
condiciones optimizadas nuevamente, se usaron para configurar los sistemas de
reacción de 25, 50 y 100 μl, con una concentración final de cebadores de 0.1, 0.2
y 0.5 μM, así como el recocido temperaturas de 48, 50, 52 y 54 ° C, durante 15,
20, 25 y 30 ciclos. Los productos de PCR se analizaron mediante electroforesis en
gel de agarosa al 1,5% para compararlos con el tamaño de fragmento esperado.

2.7. Especificidad de m-PCR

Con ADN / ADNc de varios genomas virales como plantilla, se usó el método de
m-PCR establecido para la amplificación por PCR. El sistema de reacción de 50 μl
contenía 5 μl de la plantilla de virus único, 12 μl de la mezcla de seis pares de
cebadores, 25 μl de 2 × Taqmix y 8 μl de agua desionizada. Las condiciones de
reacción fueron las siguientes: desnaturalización previa a 94 ° C durante 4 min,
desnaturalización seguida a 94 ° C durante 30 s, recocido a 52 ° C durante 45 s, y
extensión a 72 ° C durante 1 min, durante 25 ciclos , con una extensión final a 72 °
C durante 7 min. El producto de PCR se analizó mediante electroforesis en gel de
agarosa al 1,5%. Se usó agua desionizada como control en blanco.

2.8. Evaluación de la sensibilidad de m-PCR

El plásmido recombinante correspondiente a los seis genes virales se extrajo
mediante un kit de extracción de ADN plasmídico. Entre ellos, pMD-DHAV-1,
pMD-DTMUV, pMD-ARV y pMD-H9N2 se transcribieron a ssRNA en
in vitro basado en la literatura [Xie et al.]. La concentración de cada ssRNA
o el plásmido se calibró a 106 copias / μl, y se usó para medir la sensibilidad de m-
PCR mediante dilución de gradiente de 10 veces. También se usaron mezclas de
las seis plantillas con una concentración final de 106 copias / μl para medir la
sensibilidad de m-PCR mediante dilución de gradiente de 10 veces. El resultado
se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5%.
2.9. Aplicación inicial de m-PCR

2.9.1 Simulación de infección por virus mixtos.

Se inoculó una mezcla de los seis virus en la cavidad alantoidea.
de cinco embriones de pato SPF de 9 días de edad (100 EID50 por cada cepa).
Se recogieron embriones y líquidos alantoideos respectivamente 72 h después de
la inoculación. Seguido de un corte y rectificado aséptico, un adecuado
Se añadió una cantidad de PBS para la preparación del homogeneizado. El
homogeneizado se centrifugó a 5000 rpm durante 10 minutos después de
congelar y descongelar tres veces. El sobrenadante se succionó y se usó como
muestra para infección mixta. El genoma total de cada muestra se extrajo según lo
estipulado en la Sección 2.3. Después de la transcripción inversa, se aplicó el
método establecido de m-PCR. El producto amplificado se analizó mediante
electroforesis en gel de agarosa al 1,5%. Los embriones de pato no infectados se
establecieron como controles en blanco. Se estableció una mezcla de los seis
virus como control positivo.

2.9.2 Detección de muestras clínicas.

Se recogieron un total de 87 muestras viscerales clínicas de patos en
Jiangsu y Zhejiang provincias y homogeneizado en PBS después de la trituración
y molienda aséptica. El homogeneizado se preparó luego mediante el método
2.9.1 para la extracción de ADN / ARN del genoma como se describe en la
Sección 2.3. Después de la transcripción inversa, se usó el método establecido
para la amplificación por PCR. El producto amplificado se analizó mediante
electroforesis en gel de agarosa al 1,5%. Los productos de amplificación por PCR
única con resultados positivos se enviaron a Invitrogen Trading (Shanghai) Co.,
Ltd. para su secuenciación. PBS se estableció para el control en blanco.

3. Resultados

3.1. Detección de especificidad de cebador

Se usaron pares específicos de cebadores para amplificar el gen objetivo de
ADN / ADNc de DHAV-1-SH, DPV-F34, DTMUV-JS804, MPDV-FJM3, ARV-HNF o
H9N2-C / SH / F / 98 por método de PCR. El resultado mostró que los fragmentos
con los tamaños esperados pueden amplificarse, mientras que negativos el control
no se amplificó (Fig. 1). Plásmido recombinante que contiene Los resultados de
secuenciación del producto de PCR mostraron que las 6 secuencias de genes
amplificadas eran completamente consistentes con las secuencias de genes de
propósito. La amplificación de la mezcla de ADN / ADNc con un único cebador se
muestra en la Fig. 2. Cada par de cebadores solo puede amplificar una banda
específica esperada sin ninguna amplificación no específica.
3.2. Construcción del sistema m-PCR
Las condiciones de m-PCR se optimizaron de acuerdo con el sistema y
procedimiento de PCR única.

Fig. 1. Detección de virus único por PCR simple.

1, control en blanco; 2, productos de PCR de varios virus; M, escalera de ADN de
100 pb.

Fig. 2. Detección de combinaciones de 6 virus por PCR simple.

Las mezclas de ADN / ADNc de seis genomas virales se usaron como plantillas
para la amplificación por PCR.
M, escalera de ADN de 100 pb; 1, producto de PCR amplificado por cebador DPV;
2, producto de PCR amplificado por cebador ARV; 3, producto de PCR amplificado
por cebador MPDV; 4, producto de PCR amplificado por cebador DHAV-1; 5,
producto de PCR amplificado por cebador DTMUV; 6, producto de PCR
amplificado por cebador H9N2.
90/5000
Fig. 3. Electroforetograma de los productos de m-PCR.
1, productos de m-PCR; M, escalera de ADN de 100 pb.

Cuando la concentración de cebador fue de 0.2 μM y la temperatura de recocido

fue de 52 ° C, en un sistema de reacción de 50 μl con 25 ciclos, la banda
específica esperada de cada virus puede ser claramenteobservado basado en el
análisis electroforético (Fig. 3). Otras condiciones fueron exactamente lo mismo
que la PCR simple.

4. Discusión
En los últimos años, una variedad de virus ha infectado a los patos debido a
el crecimiento de modelos de cultivo mixto, movilidad mejorada de humanos y
animales, y contaminación ambiental; Estos virus incluyen DHAV-1, DPV, DTMUV,
MPDV, ARV, H9N2 o una infección mixta de estos patógenos. En la actualidad,
aislamiento e identificación de virus, detección serológica, microscopía
inmunoelectrónica, ELISA, PCR en tiempo real, LAMP,
PCR regular y otras tecnologías se han aplicado para la detección de estos virus.
Sin embargo, no se ha informado de la detección rápida de seis virus
simultáneamente. En este estudio, seleccionamos el gen vp1 de DHAV-1, el gen
ul6 de DPV, el gen e de DTMUV, el gen vp1 de MPDV, el gen c de ARV y el gen
ha de H9N2, y diseñamos los cebadores de acuerdo con las regiones
conservadas. Cada par de cebadores se utilizó para amplificar el virus individual
correspondiente o una mezcla de los seis virus. y solo una única banda específica
podría amplificarse. Los resultados de secuenciación fueron idénticos a la
secuencia del gen diana, lo que demuestra la buena especificidad de los
cebadores. Además, debido a la pequeña diferencia entre la temperatura de
recocido de los cebadores y la facilidad de operación de la mezcla comercial 2 ×
Taq, las condiciones de m-PCR pueden optimizarse fácilmente. Cuando se
utilizaron seis pares de cebadores para la amplificación por PCR de ADN / ADNc
de cada virus o mezcla en condiciones optimizadas, solo se puede detectar el
fragmento esperado para el virus correspondiente y sin ninguna banda adicional.
Por lo tanto, el método desarrollado de m-PCR muestra buena especificidad. La
prueba de sensibilidad muestra que se pueden detectar seis virus
simultáneamente cuando la concentración mínima de ADNc / ADN es de 102
copias / μl. Por lo tanto, en condiciones experimentales normales (Wan et al.,
2016; Zeng et al., 2014; Meng et al., 2015), no hay necesidad de preocuparse por
los resultados falsos negativos causados por una plantilla insuficiente. Para
verificar la viabilidad y precisión de la m-PCR propuesta en aplicaciones clínicas,
diseñamos un experimento de simulación de infección de embriones de pato e
hicimos alguna detección clínica. Los resultados de la prueba de simulación
mostraron que la m-PCR puede detectar secuencias genéticas específicas en
coinfectados
embriones de pato. PCR simple y m-PCR se utilizaron para detectar 87 muestras
clínicas. Los resultados de secuenciación para una banda específica de PCR
única fueron idénticos a los resultados de la amplificación de m-PCR. Entre las
muestras clínicas, 53 estaban individualmente infectadas, 32 estaban coinfectadas
y 2 muestras fueron infectados por otros virus. Estos resultados indican que el
método establecido de m-PCR es de alta precisión en el diagnóstico de muestras
clínicas y puede usarse como un método de detección independiente para el
diagnóstico de enfermedades virales comunes en patos.
Dado que DHAV-1, DTMUV, ARV y H9N2 son virus de ARN, mientras que DPV y
MPDV son virus de ADN, seleccionamos el kit de ARN / ADN viral para la
extracción de ácido nucleico, utilizando el kit de transcripción inversa que no tiene
impacto en el ADN para la transcripción inversa . para adaptar la detección rápida
de muestras desconocidas Los resultados de la prueba de simulación y la
detección clínica también confirman la viabilidad de esta operación. En resumen,
este estudio establece un método de m-PCR para la detección rápida y el
diagnóstico de seis virus comunes en patos en un sistema de reacción única. El
método propuesto se puede utilizar ampliamente en el diagnóstico rápido de
infecciones virales de pato en poco tiempo con buena especificidad, buena
precisión y alta sensibilidad.