UNIVERSIDAD PEDAGÓGICA Y TECNOLÓGICA DE COLOMBIA

Extracción de DNA en plantas - BIOLOGÍA MOLECULAR

Leopoldo Arrieta Violet
1. INTRODUCCIÓN O MARCO TEÓRICO: Máximo 2 hojas en las cuales revises lo que
se ha publicado en años anteriores, sobre el tópico del laboratorio (lo pertinente) y
que te sirva para discutir los resultados que obtengas.

2. OBJETIVOS: Conocer los fundamentos de la extracción de DNA en tejidos

vegetales.

3. PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN: ¿Cuál es la función de la solución de

extracción?

4. HIPÓTESIS: Construye una hipótesis que te permita responderá la pregunta de

investigación.

5. DISEÑO METODOLÓGICO: En pocas palabras en que consiste el experimento.

5.1. Variable independiente. 5.2. Variable dependiente.

6. MATERIALES Y MÉTODOS:
6.1. Material Biológico: Hojas frescas de haba y arveja.

6.2. Equipos: Microcentrífuga, nevera, baño maría, agitador vortex, balanza,

congelador, autoclave, ultracentrífuga, micropipetas de 1 a 10 µL, 10 a 100 µL y 100
a 1000 µL, puntas azules, amarillas y blancas, termo de Nitrógeno líquido, flotador
para eppendorf, espátula metálica fina, pinza metálica, toalla secante, guantes
estériles, tapabocas, 20 tubos eppendorf de 2 mL estériles y bata limpia.

6.3. Reactivos: Tris-HCl pH: 8 - 1 M, EDTA pH: 8 – 0.5 M, NaCl 5 M, B-Mercaptoetanol

1 M, PVP-360000 100%, agua destilada, Agua desionizada, SDS 20%, acetato de
Potasio 5 M, etanol al 70% y 1 litro de nitrógeno líquido.

6.4. Preparación de reactivos: PREPARACIÓN DE LA SOLUCION DE EXTRACCIÓN:

REACTIVO CONCENTRACIÓ CONCENTRACIÓ VOLUME
N DEL STOCK N FINAL N PARA
25 mL
Tris HCl pH 8.0 1M 100 mM
EDTA pH 8.0 0.5 M 50 mM
NaCl 5M 500 mM
B-Mercaptoetanol 1M 10 mM
Polyvinyl – Pyrrolidone (PVP) 100% 1% (p/v)
360.000
Agua destilada ------- ---------
Esterilizar en autoclave la solución de Tris HCl, EDTA y NaCl antes de
agregar el B-Mercaptoetanol y el PVP.
 PREPARACIÓN DE LA SOLUCION DE RESUSPENSIÓN TE/ARNasa:
REACTIVO CONCENTRACIÓN CONCENTRACIÓ VOLUMEN
DEL STOCK N FINAL PARA 5 mL
Tris HCl pH 8.0 1M 10 mM
EDTA pH 8.0 0.5 M 1 mM
ARN/asa 5 mg/mL 25 µg/mL
Agua desionizada ------- ---------
Esterilizar en autoclave la solución conteniendo Tris y EDTA antes de agregar
ARN/asa.

6.5. Procedimiento
A. Depositar en un mortero 5 gr de tejido vegetal fresco fragmentado en pedazos
pequeños.

B. Agregar Nitrógeno líquido al material vegetal y rápidamente triturarlo hasta

obtener un polvo fino.

C. Depositar rápidamente el tejido vegetal pulverizado en un tubo falcón de 15 ml,

evitando su rehidratación.

D. Depositar en un eppendorf de 2 mL 500 mg de tejido vegetal pulverizado

(equivalente a un volumen de 0,5 mL dentro del eppendorf)

E. Añadir con pipeta 1,2 mL o con micropipeta 1200 µL de solución de extracción,

precalentada a 65oC en baño maría.

F. Mezclar completamente empleando el agitador vortex durante 5 s. a máxima

velocidad.

G. Añadir con micropipeta 85 µL de SDS 20%. Mezclar completamente empleando el

agitador vortex durante 5 s. a máxima velocidad.

H. Incubar en baño maría a 65°C, durante 10 minutos. Agitar con vortex el

eppendorf durante 5 s., a máxima velocidad, al comienzo de la incubación, a los 5
min. y al final de la incubación.

I. Retirar el eppendorf del baño maría y añadir 390 µl de Acetato de Potasio 5 M

J. Mezclar completamente empleando el agitador vortex durante 5 s. A máxima

velocidad. Centrifugar a 10000 rpm, durante 10 min.

K. Retirar cuidadosamente el sobrenadante con micropipeta de 1000 µL y pasarlo a

un nuevo eppendorf, evitando que pasen grumos o pedazos de tejido.

L. Añadir 1 mL de Isopropanol frio (-20 oC) y agitar por inversión suavemente, pero
firme unas seis veces, observar el DNA insolubilizado.
M. Incubar a –70oC durante 20 min. También se puede incubar a -20 °C durante un
tiempo mínimo de 1 hora o máximo de toda la noche.

O. Incubar a –70oC durante 20 min. También se puede incubar a -20 °C durante un

tiempo mínimo de 1 hora o máximo de toda la noche.

P. Centrifugar a 14000 rpm durante 15 minutos. Descartar el sobrenadante.

Q. Añadir 400 µl de etanol al 70%, Centrifugar a 14000 rpm durante 3 minutos y

descartar el sobrenadante, conservar el botón

R. Dejar secar el botón de DNA a temperatura ambiente por 15 minutos y

resuspender en 350 µL de solución de TE/RNAsa e incubar a 37°C durante 15
minutos.

S. Guardar a -20°C hasta verificar por electroforesis y Chequear extracción

mediante electroforesis en gel de agarosa al 0.7 %

7. DATOS BRUTOS: Resultados registrados en el laboratorio (Variable dependiente

e independiente).

8. PROCESAMIENTO, PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE DATOS: Las tablas, gráficas,

fotos (debidamente rotuladas y con leyenda) producto de la manipulación de los
datos brutos y su respectiva discusión (El análisis y comparación de tus resultados
con los de otros autores, para poder llegar a una conclusión valida.).

9. CONCLUSIONES: La aceptar o rechazar la hipótesis planteada, con argumentos

de PPD.

10. LITERATURA CITADA: La literatura usada para discutir los resultados.

NOTA: Presentar el informe de laboratorio sólo con: Pregunta de

investigación, hipótesis, variables (independiente y dependiente), PPD y las
conclusiones