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Laboratorio de Biologa Molecular Prcticas 3 a 5 Extraccin de Protenas, Visualizacin en Gel de Poliacrilamida y Tincin Introduccin La protemica que comprende el estudio

del proteoma (totalidad de las protenas codificadas por un genoma) de un organismo, requiere de tcnicas empleadas para la extraccin y separacin de todas o determinadas protenas producidas por un organismo durante su ciclo vital. La extraccin y purificacin de las protenas producidas por una clula o un tejido es un proceso de gran importancia debido a que a partir de este procedimiento se puede proseguir con otros procesos como son la caracterizacin estructural y funcional de las mismas. Se han descrito diferentes mtodos para la extraccin y purificacin de protenas: o Mtodos cromatogrficos o Diferenciacin por solubilidad o Precipitacin proteica con sales o Mtodos de determinacin de concentracin proteica (Ensayo Bradford de protenas) o Electroforesis bajo condiciones denaturantes y no denaturantes La electroforesis en gel puede dar informacin sobre el peso molecular, la carga, las subestructuras de las protenas, el grado de pureza de determinadas preparaciones de protenas. Bajo ste mtodo es posible separar protenas que difieren en pocos cientos de Dalton en menos de 0.1 unidades de pH en su punto isoelctrico. La electroforesis en gel comprende muchas tcnicas, entre ellas el mtodo SDS-PAGE (Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis), el cual permite estimar el nmero de polipptidos en una muestra, as como comparar el contenido proteico de muestras de diferente origen. Esta tcnica requiere que las protenas sean denaturadas para poder ofrecer informacin sobre el peso molecular de las protenas, la nica variable que influir en la movilidad electrofortica (tasa de la migracin de una protena por unidad de fuerza del campo elctrico aplicado) de las protenas que migran por el gel de esta electroforesis. Objetivos. Comprender los principios involucrados en el proceso de extraccin de protenas. Realizar la extraccin y purificacin de protenas a partir de diferentes especies de bacterias. Comprender el principio de separacin de protenas bajo el mtodo de electroforesis vertical. Visualizar exitosamente las protenas extradas en gel de poliacrilamida. PRCTICA 3 Extraccin de protenas bacterianas a) La bacteria se crece ON (Over Night) en caldo LB a una agitacin de 250 rpm. b) Marcar eppendorf con cada uno de los nombres de las cepas a trabajar c) Medir 1 ml de medio de cultivo y aadirlo al eppendorf correspondiente.

d) e) f) g)

Centrifugar por 5 min a 13000 rpm. Descartar 800 ul de sobrenadante en hipoclorito diludo. Realizar vortex para resuspender. Agregar la mitad del volumen de Buffer de muestra (que deba estar en bao de mara), es decir si tiene 200ul de muestra agregar 100ul de Buffer de muestra. Observar pellet, si esta muy mocoso, agregar 20ul mas de Buffer de muestra. h) Colocar las muestras en la plancha trmica a 100C (hacer perforaciones a las tapas de los tubos eppendorf) por 5 minutos. i) Centrifugar 13000 rpm por 5 minutos. j) En el sobrenadante estn las protenas. (quitar el moco).

PRCTICA 4 Electroforesis en geles de poliacrilamida Preparacin del gel de separacin Para separar protenas de 60 a 200 kDa use un gel del 5%, para protenas de 16 a 70 kDa use uno de 10% y uno de 15% para separar protenas de 12 a 45 kDa. Preparar una solucin de persulfato de amonio (fresca diariamente) al 10 % (50 mg en 0.5 ml H2O o 25 mg en 0.25 ml H2O). Mida 1 cm por debajo de los peines en el montaje, hasta este punto llenar as es que mrquelo. En un beaker de 50 ml mezcle 2ml de solucin de poliacrilamida 1,25ml de solucin pH 8.8 1,75 ml de H2O Adicione 50 ul de Persulfato de Amonio al 10% preparado en fresco y 8 ul de TEMED. Agite gentilmente para mezclar y use de inmediato. Al haber alcanzado el nivel mximo marcado, cubra la solucin rpidamente con agua desionizada. Hgalo con cuidado para que las dos soluciones no se mezclen. Una vez polimerizado (+/- 30-45 minutos) remueva el agua volteando todo el montaje. Preparacin del gel de stacking a) En un beaker de 50 ml mezclar 325 ul de mezcla de poliacrilamida 625 ul de solucin pH 6.8 1525 ul de H2O. Adicionar 25 l de Persulfato de amonio 10% y 5L TEMED. Agitar bien para mezclar. Usar inmediatamente y dejar polimerizar. Corrido de extractos de protena celular bacteriana en electroforesis denaturante SDS-PAGE a) Realice el montaje de la cmara de electroforesis, llene la cmara interna con buffer de electroforesis 1X hasta que cubra los pozos y el resto en la cmara externa. Asegrese de que la cmara externa esta aislada de la interna, para eso lea cuidadosamente las instrucciones de ensamblaje. b) Siembre 8 L de cada una de las muestras, anote en su cuaderno de laboratorio el orden de siembra en los pozos del gel. c) Cierre la cmara de electroforesis y conecte a la fuente de poder. Programe el corrido de electroforesis a 150 V por 90 minutos.

a) b) c)

d)

Fijado a. En una botella de vidrio con tapa y en campana de extraccin prepare 100 ml de la solucin de fijado, agregando los reactivos en el orden establecido: 50% de etanol (50 ml) 10% de cido actico (10 ml) 40% de agua des ionizada (dH2O; 40 ml) b. Una vez terminada la electroforesis, vierta la solucin de fijado en las cubetas de tincin suministradas con el kit. c. A paso seguido, apague y desconecte la cmara de electroforesis vertical de la fuente de poder. Retire el montaje de los vidrios y a continuacin, los vidrios, teniendo siempre presente el pozo nmero uno de sembrado. Con la ayuda de las esptulas verdes de plstico previamente humedecidas con la solucin de fijado, separe cuidadosamente los dos vidrios, procurando que el gel quede en el vidrio ms delgado. Separe y descarte el gel de stacking, y haga un pequeo corte en la esquina superior del gel de separacin en el lugar correspondiente del primer carril de sembrado. d. Deposite el gel en la cubeta con la solucin de fijado, y guarde la cubeta en una bolsa Ziplock a 4C hasta por 15 das para la tincin, de lo contrario deje el gel en esta solucin por 30 min.

PRCTICA 5 Tincin con Azul de Coomasie Al igual que la tincin con plata, el mtodo de Azul de Coomasie consta de 3 pasos bsicos: fijado, tincin y destincin. Cada paso utiliza diferentes soluciones que se describen a continuacin. Tenga en cuenta que las cantidades dadas son para la tincin de un gel en las cubetas que vienen con el kit de tincin plata. a. En una botella de vidrio con tapa y en campana de extraccin prepare 100 ml de la solucin de tincin, agregando los reactivos en el orden establecido: 50% de Metanol (v/v; 15 ml) 10% de cido actico (v/v; 3 ml) 40% de agua des ionizada (v/v; 12 ml) Coomasie 0.05% (w/v; 0.015g) b. Deje en agitacin continua de aprox. 60 rpm a 37C por 45 min. 3. Destincin a. Prepare con el mismo cuidado del paso anterior 100 ml de solucin de destincin agregando en orden estricto los siguientes reactivos: 50% de metanol (v/v; 50 ml) 10% de cido actico (v/v; 10 ml) cido actico 40% de dH2O (v/v; 40 ml) c. Descarte la solucin de tincin en un recipiente de vidrio con tapa, con cuidado de no botar el gel. A continuacin haga un enjuague con Agua desionizada d. A continuacin, agregue 30 ml de la solucin de destincin. Deje el gel en agitacin constante de aprox. 50 rpm a 37 C por 10 minutos. Revise peridicamente su gel hasta obtener la intensidad de bandas deseada. Si al cabo de los primeros minutos

an encuentra un elevado background (es decir, coloracin azul de fondo que compite con las bandas), reemplace la solucin de destincin por una nueva. e. Cuando obtenga el bandeado esperado, el gel que est listo para ser fotografiado o secado en papel celofn en fro.