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Histología. Biología celular y tisular. Instructivo de laboratorio, 6e

CAPÍTULO 2: Técnica histológica

Introducción

Competencias

1. Analiza los procedimientos fisicoquímicos de la técnica histológica.

2. Explica los efectos de los agentes químicos (fijadores, deshidratantes, aclarantes, agentes de inclusión, colorantes y resinas) sobre los tejidos.

3. Explica la función del histoquinete, micrótomo y crióstato.

4. Define los términos tinción vital, cromofilia, cromofobia, acidofilia, basofilia, metacromasia e impregnación.

5. Determina la técnica de tinción empleada en las laminillas que observas.

Según se explicó en la práctica anterior, para analizar los objetos al microscopio, éstos deben colocarse en el paso del haz luminoso justo por debajo del
lente ocular, por lo que es necesario tener cortes de los tejidos de un grosor menor al diámetro de las células que lo integran para observar los detalles.

Contesta lo siguiente:

En promedio, ¿cuál es el margen de los diámetros celulares del organismo humano?

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¿Qué observarías si tomaras un trozo de carne fresca, lo cortas en rebanadas muy finas, lo colocas sobre un portaobjetos, lo dejas a la temperatura
ambiente por 48 horas y luego lo analizas al microscopio?

_______________________________________________

_______________________________________________

En conclusión, para ser observados al microscopio los tejidos deben preservarse de tal manera que su estructura morfológica y su composición molecular
se mantengan como cuando estaban vivos, deben ser seccionados finamente y con gran precisión en rebanadas delgadas y sus estructuras deben estar
bien contrastadas; para lograr este objetivo, los tejidos deben pasar por una serie de procesos físico-químicos que en conjunto reciben el nombre de
técnica histológica.

Indicaciones. Lee cuidadosamente la información que se te presenta, discute el contenido con los miembros de tu equipo y elaboren un resumen,
contestando las preguntas incluidas. La técnica histológica se realiza en varios procedimientos que son: obtención de la pieza, fijación, deshidratación,
aclaración, preinclusión, inclusión definitiva, microtomía, adhesión, tinción y montaje final.

Obtención de la pieza
Consiste en la toma de muestras de tejido de los diferentes organismos; una primera condición es que la muestra de tejido se tome de individuos sanos,
vivos y anestesiados, esto se logra con animales de experimentación; en el caso de tejidos humanos, las muestras se obtienen de pacientes que son
sometidos a cirugía y a biopsias, o de cadáveres de muerte reciente, cuidando seccionar sólo órganos y tejidos sanos. La separación de los órganos debe
hacerse con tijeras evitando presionar y macerar los tejidos; una vez fuera del organismo, los tejidos se cortan con un bisturí fino o con una navaja de
afeitar, sin presionar; las piezas de tejido deben medir 1 cm3 de grosor pero deben incluir todos los elementos del órgano.

Observa un corte de encéfalo y tronco encefálico cortado a 1 cm de grosor (fig. 2-1).

Figura 2-1
Corte de encéfalo y tronco encefálico.

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El tratamiento posterior del tejido depende del objetivo del estudio; si se desea estudiar el tejido vivo, la muestra se coloca en medios de cultivo que
permitan mantener a las células vivas durante la observación y someterlas a una tinción vital, esto es, usar un colorante que no cause daño a las células
como el azul de tripano; este colorante derivado del alquitrán de carbón permite identificar a los macrófagos in vivo por que al mezclarse con el agua forma
un coloide, que fagocitan estas células.

Contesta lo siguiente:

¿A qué se le llama tinción vital?

_______________________________________________

_______________________________________________

Fijación
El estudio de la morfología es más factible en células fijadas que mantienen su estructura como si estuvieran vivas; para este propósito los tejidos se
someten al proceso de fijación o insolubilización de las proteínas para detener súbitamente la actividad vital celular, detener los procesos de autólisis post
mortem, proteger a las células del ataque bacteriano y putrefacción y preparar los tejidos para los procedimientos histológicos posteriores.

Los métodos utilizados para la fijación pueden ser físicos o químicos. El método físico consiste en cambios rápidos de temperatura, con calor (poco
recomendable porque produce desnaturalización de las proteínas) y por congelación inmediata sumergiendo el tejido en nitrógeno líquido; esto produce
endurecimiento del tejido dejándolo listo para cortarse (microtomía) en un aparato especial llamado micrótomo de congelación que puede estar montado
en un crióstato, un aparato capaz de mantener el medio ambiente a baja temperatura

Los métodos químicos consisten en exponer el tejido a agentes químicos, para provocar la formación de puentes transversales de unión entre moléculas
adyacentes de proteínas tisulares. Los agentes químicos más usados en microscopia óptica son compuestos simples o puros como el formaldehído al 5% o
el formol al 10% o mezclas de compuestos como el líquido de Bouin (ácido pícrico, formol y ácido acético glacial) o el líquido de Helly (bicromato de
potasio, cloruro de mercurio y formol). En microscopia electrónica, el fijador más empleado es glutaraldehído y tetraóxido de osmio.

Se emplean dos tipos de técnicas para fijación química: la técnica de perfusión y la técnica de inmersión. En la primera se coloca el fijador en una jeringuilla
y se inyecta en el torrente sanguíneo del animal de manera que se distribuya por todo el organismo; una vez fijado podemos disecarlo para obtener el
órgano de interés (fig. 2-2).

Figura 2-2
Técnica de perfusión.

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En la técnica de inmersión se cortan cubos de tejido de 1 cm3, se identifican, se colocan en una cápsula de plástico o metal y se pasan a un recipiente con
fijador; cuidando fijar la muestra lo más rápido posible, dado que algunos tejidos son más lábiles que otros, se recomienda fijar las glándulas de inmediato,
páncreas y riñón no más de 15 min, el intestino no más de 30 min, músculo y hueso no más de 60 min después de la muerte; utilizar un volumen de fijador
50 veces mayor que el tamaño de la muestra y mantenerla en el fijador una hora como mínimo y 24 h como máximo para evitar estropear el tejido (fig. 2-3A
y B, y micrografía 2-1A, B y C).

Figura 2-3
A. Pieza de tejido en el fijador. B. Aislamiento de las piezas en cápsulas.

Micrografía 2-1
Alteraciones del tejido por fijación deficiente. A. Micrografía de autólisis. B. Micrografía de putrefacción. C. Cristales de pigmento causados por eliminación
incompleta de formol.

Cuando ya estamos seguros que se conservará el tejido, el siguiente paso es cortarlo en delgadas rebanadas de 5 μ de grosor o menos, pero el alto
contenido de agua en los espacios celulares es un obstáculo para este propósito; por eso es necesario sustituir el agua de los tejidos por una sustancia

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líquida capaz de solidificar a temperatura ambiente; la parafina tiene esta característica. La sustitución de agua por parafina en los tejidos se realiza en los
siguientes pasos: deshidratación, aclaración e inclusión.

Deshidratación
El propósito de este proceso es eliminar el agua de los tejidos, sometiéndolos a una concentración gradual de soluciones acuosas de un agente
deshidratante, por ejemplo, alcohol etílico o acetona. Se inicia con concentraciones del 50%, luego al 60, al 70, al 80, al 90% para alcanzar de manera
paulatina la concentración de alcohol al 100%. Cambiar de inmediato el tejido de agua a una solución de alcohol al 100% produce una rápida salida del
agua lo cual deforma los tejidos, por lo tanto es necesario mantener los bloques de tejido una hora por lo menos en las diferentes concentraciones
crecientes, de alcohol.

Aclaración o diafanización
Como la parafina no es capaz de mezclarse con el alcohol, la aclaración es un procedimiento intermedio que tiene como propósito eliminar el alcohol de
los tejidos para saturarlos de una sustancia miscible tanto con el alcohol y el solvente de la parafina. La sustancia que se utiliza con mayor frecuencia es el
xileno o xilol. Se coloca la muestra de tejido en un recipiente con alcohol-xilol a partes iguales, luego en xilol absoluto hasta que el tejido se torne claro o
transparente. También se pueden utilizar tolueno, benzol o cloroformo como agentes aclarantes.

Nota: El alcohol y el xileno disuelven los lípidos y causan desnaturalizacion de las proteínas de la célula, por lo que cuando deseamos estudiar lípidos o
enzimas nos auxiliamos con la técnica de congelación de tejidos. Un tejido congelado es lo suficientemente duro para ser cortado en el crióstato.

Preinclusión
La parafina es una sustancia sólida a temperatura ambiente y tiene un punto de fusión de 55 a 60°C. La técnica histológica requiere que esta sustancia
penetre a todos los intersticios intra e intercelulares para darle consistencia al tejido. La preinclusión permite la impregnación de parafina fundida en los
tejidos y se logra pasando el tejido del xilol, a dos baños de parafina fundida, para lograr que el xilol sea sustituido por ésta. El procedimiento se debe
realizar en el calor de un horno para mantener la parafina en estado líquido.

Todos los procesos mencionados se realizan manualmente cambiando de tiempo en tiempo, las muestras de un frasco a otro (fig. 2-4) o bien se
automatizan utilizando un procesador de tejidos llamado histoquinete (fig. 2-5).

Figura 2-4
Procesamiento manual.

Figura 2-5
Procesadores de tejidos (histoquinetes).

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Inclusión
Consiste en mantener al tejido en el centro de un bloque sólido de parafina; por lo general se coloca la muestra de tejido en un molde de papel, plástico o
metal de forma rectangular, se le vierte la parafina fundida a 60°C y se deja solidificar a temperatura ambiente (figs. 2-6, 2-7 y 2-8). Los medios de inclusión
para microscopia electrónica que se utilizan con frecuencia son resinas polimerizadas o epoxi como Epon o Araldita.

Figura 2-6
Moldes de metal para inclusión.

Figura 2-7
Tejido incluido.

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Figura 2-8
Bloques de parafina con tejido incluido.

El bloque ahora se puede cortar en secciones uniformes y lo suficientemente delgadas como para permitir el paso de la luz. En general, las preparaciones
para microscopia óptica tienen un grosor entre 3 a 10 μ. Para elaborar estos cortes se utiliza un micrótomo, aparato que consta de una base sólida, una
cuchilla fija y una barra móvil que sostiene el bloque de parafina y se desliza pasando el bloque sobre la cuchilla para formar una tira de cortes (figs. 2-9 y 2-
10).

Figura 2-9
Micrótomo.

Figura 2-10
Tira de cortes.

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Adhesión
Las tiras de cortes de parafina con el tejido incluido se depositan sobre la superficie de agua caliente en un baño de flotación para eliminar los pliegues y
extender el tejido; luego se separa cada corte con una aguja histológica y se levantan con un portaobjetos limpio que tiene un adhesivo sobre la superficie,
después se ponen a secar en el borde del baño de flotación (fig. 2-11).

Figura 2-11
Baño de flotación con cortes montados en portaobjetos.

Los portaobjetos con el tejido se colocan en las canastillas de tinción, para manipularlas mejor en el siguiente proceso (fig. 2-12).

Figura 2-12
Canastilla de tinción.

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Los errores cometidos durante los procedimientos anteriores, causan alteraciones en los tejidos que reciben el nombre de artefactos.

La deshidratación rápida en altas concentraciones de alcohol o el excesivo calor de la parafina producen retracción, esto es separación de los tejidos que en
vida eran vecinos.

La cuchilla del micrótomo mal afilada, presenta muescas microscópicas que al cortar los tejidos producen líneas de destrucción llamadas estrías o mellas.

Cuando el baño de flotación no tiene la temperatura adecuada, los cortes no se extienden completamente, lo cual provoca dobleces anormales en el tejido
llamados pliegues o arrugas.

Aunque ya se tienen los cortes en el portaobjetos, todavía no están preparados para su examen con el microscopio, puesto que los tejidos se hallan
infiltrados en parafina y carecen de contraste. Los colorantes para los tejidos son compuestos químicos disueltos en agua o alcohol, por lo que previo a la
coloración, se debe eliminar la parafina con calor en el horno con un solvente orgánico, así los cortes de nuevo se sumergen en xilol (figs. 2-13 y 2-14). Los
cortes de tejido también se deben rehidratar haciéndolos pasar por una serie de graduaciones decrecientes de alcohol etílico hasta llegar a una solución
100% de agua.

Figura 2-13
Desparafinado con calor.

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Figura 2-14
Desparafinado con xilol.

Tinción
Las estructuras de los tejidos no teñidos tienen más o menos el mismo índice de refracción, por lo cual es difícil reconocerlos. El propósito de la tinción es
facilitar la visualización de las diferentes estructuras y demostrar las diferencias químicas y físicas entre los componentes celulares y tisulares. La técnica de
tinción es simple, los colorantes se disuelven en soluciones acuosas o alcohólicas según el caso, y las canastillas de cortes se pasan en una serie de
recipientes para hidratar, dar color y lavar los tejidos (fig. 2-15). Sin embargo para interpretar correctamente las estructuras teñidas debemos entender qué
son y cómo funcionan los colorantes.

Figura 2-15
“Tren” de tinción para la técnica de hematoxilina y eosina.

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Clasificación de los colorantes

Un colorante es un compuesto con color capaz de transferirlo a otros cuerpos. Se clasifican, según su origen, en naturales, artificiales y metales, los cuales
se utilizan para impregnar estructuras celulares e hísticas. Los colorantes naturales se obtienen de diferentes organismos como el rojo carmín, que se
obtiene del cuerpo de un insecto, la orceína que se extrae de ciertos líquenes, se usa para teñir cromosomas y fibras elásticas; o la hematoxilina que se
extrae de la madera del palo de Campeche. Este producto requiere primero oxidarse (forma hemateína) y después unirse a un agente intermedio llamado
mordiente o, acoplador, que le permite establecer enlaces químicos con los diferentes elementos celulares e intercelulares; este colorante es insoluble en
agua y otros líquidos; cada mordiente confiere a la hematoxilina propiedades tintoriales diferentes (cuadro 2-1).

Cuadro 2-1

Variedad de mezclas de hematoxilina.

Mordiente o acoplador Nombre de la mezcla Estructura que identifica

Aluminio Hematoxilina alumbre (Gill) Núcleos y ergastoplasma

Hierro Hematoxilina de Heindenhain Mitocondria y fibras elásticas

Ácido fosfotúngstico Hematoxilina fosfotúngstica Bandas de músculo estriado

Bicromato de potasio Hematoxilina de Weigert Fibras nerviosas mielínicas

Cromo Hematoxilina crómica Células beta pancreáticas

Los colorantes artificiales son compuestos producidos por los seres humanos, tienen propiedades físico-químicas que pueden aprovecharse en diferentes
técnicas de tinción, ejemplos: los derivados del alquitrán de carbón como el azul de tripano, colorante vital que se usa para identificar a los macrófagos
vivos, porque al mezclarse con el agua forma partículas coloidales fagocitables por estas células.

Los colorantes ácidos como la eosina, el naranja G o la fuscina ácida tienen carga negativa en la porción coloreada de la molécula que reacciona con los
grupos aniónicos (grupos amino ionizados) de las proteínas en el citoplasma. Cualquier componente de la células que reaccione con colorantes ácidos es
acidófilo y presenta acidofilia.

Los colorantes básicos como el azul de metileno o el azul de toluidina tienen una carga positiva en la porción coloreada de su molécula que reacciona con
los grupos catiónicos (grupos fosfato ionizados) de los ácidos nucleicos en la heterocromatina, los nucleolos y el ergastoplasma. Cualquier componente
celular que reacciona con los colorantes básicos es basófilo y presenta basofilia. La hematoxilina no es un colorante básico, pero al unirse al aluminio como
mordiente, reacciona con los componentes ácidos de la célula, se comporta como colorante básico.

Las moléculas de glucosaminoglucanos sulfatados presentes en la matriz cartilaginosa o en los gránulos de células cebadas, tienen altas concentraciones
de polianiones muy cercanos unos de otros; cuando se tiñen con azul de toluidina, las moléculas del colorante se polimerizan entre sí cambiando sus
propiedades de absorción del color azul al color púrpura, a este fenómeno se le llama metacromasia.

Las sales de los metales pesados, más que teñir, se precipitan en los tejidos y forman precipitados que se depositan en las estructuras celulares
impregnándolas, facilitando la identificación de éstas, las sales que se usan con mayor frecuencia son las sales de plata para demostrar el aparato de Golgi

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y las neurofibrillas en las neuronas; el cloruro de oro para demostrar las terminaciones nerviosas y algunas células de la neuroglia, y el tetraóxido de osmio
que se deposita en los ácidos grasos no saturados para formar un producto oscuro.

La técnica de tinción más común es la de hematoxilina y eosina (H y E) que permite diferenciar en la célula las estructuras basófilas (núcleo,
heterocromatina y ergastoplasma) con un color azul intenso o púrpura, de las estructuras acidófilas (citoplasma), de color rosa a naranja. El uso de
diferentes colorantes según su capacidad de unirse selectivamente a determinadas estructuras celulares permite diferenciar las estructuras hísticas o
estructuras intracelulares en las tinciones especiales; por ejemplo: la técnica de tricrómico de Masson que permite diferenciar el mucinógeno y las fibras
colágenas de color azul en la matriz extracelular. Es posible la identificación de determinadas moléculas en las células y los tejidos mediante la
histoquímica, esto consiste en exponer el tejido a un reactivo específico que reaccione con la molécula de interés, por ejemplo el reactivo de Feulgen para
localizar el DNA (cuadro 2-2).

Cuadro 2-2

Diferentes colorantes y reactivos para tinciones especiales o histoquímicas.

Colorante Estructura Color

Orceína Fibras elásticas Rojo

Colorante de Weigert Fibras elásticas Café oscuro

Sales argénticas de Gomori Fibras reticulares Negro

Metodo argéntico de Verhoe Fibras colágenas Rosado a rojo

Técnicas de histoquímica

Reactivo de Schi (PAS) Glucógeno y carbohidratos Magenta

Reactivo de Feulgen DNA Magenta

Rojo Sudán (Sudán II) Adipocitos Rojo

Negro Sudán (Sudán IV) Lípidos, vainas de mielina Negro

Montaje
Consiste en sellar el tejido para conservarlo por lo que se deben deshidratar los cortes cuando se sacan de los colorantes (eliminar el agua en alcoholes) y
se aclaran en xilol para después ponerles una gota de bálsamo de Canadá o resina y cubrirlos con un cubreobjetos (fig. 2-16A, B y C).

Figura 2-16
Montaje.

Contesta lo siguiente:

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¿Qué es y cómo funciona un fijador?

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¿Qué problema se presenta con los tejidos cuando se usa alcohol o acetona a altas concentraciones como fijadores?

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¿Qué entiendes por aclaración del tejido?

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¿Por qué algunas estructuras hísticas son basófilas y otras son acidófilas?

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¿Cuál es la técnica de tinción más común?

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Investiga la técnica de tinción y los pasos que se siguieron para teñir el tejido de la micrografía 2-2.

Micrografía 2-2

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Investiga cuántos colorantes se utilizan en la tinción del corte en la micrografía 2-3. Explica por qué los núcleos se ven más oscuros.

Micrografía 2-3

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Investiga qué métodos de tinción se emplearon en las micrografías 2-4 a 2-6.

Micrografía 2-4

Micrografía 2-5

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Micrografía 2-6

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