Tecnologico Nacional de México

Instituto Tecnologico de Chetumal

TÉCNICAS HISTOLÓGICAS
Biología Celular
Profesor: Dr. Marco Antonio Dominguez Galera
Participantes:
Ma. Lucía Gómez Alvarado
Lurvin Yereni Martin Hernández
Maria Schalia Carrillo Madariaga
Pech Poot Sheyla Aracely
Balam González Sheila Vanessa
 Introducción
La mayoría de las técnicas histológicas van encaminadas a preparar el tejido para su observación con el
microscopio, bien sea éste óptico o electrónico. debido a que la composición de los tejidos, no tienen
contraste ni colores que permitan diferenciar sus estructuras de una manera clara mediante la observación
directa con los microscopios.
Por ello hay que procesar las muestras, primero para que no se deterioren y después para resaltar sus
estructuras y poder estudiarlas en detalle.
Los tejidos animales son en su gran mayoría incoloros, excepto aquellos que poseen algún tipo de pigmento
como la hemoglobina de la sangre o la melanina de la epidermis. En las plantas, sin embargo, existe una
mayor variedad de pigmentos naturales que permiten su observación directa con el microscopio óptico, a lo
que también ayuda la presencia de las paredes celulares, las cuales facilitan la delimitación celular y la
discriminación entre diferentes tejidos
Con la llegada de la biología molecular se han puesto en marcha otras técnicas mucho más sofisticadas
para observar elementos celulares, entre las que se pueden destacar aquellas que usan anticuerpos,
inmunocitoquímicas, las que usan sondas de ADN o ARN, hibridaciones "in situ", o más sofisticadas aún
como las que mediante el diseño de animales transgénicos permiten identificar y observar a las células que
expresan un determinado gen, incluso en el organismos vivo, gracias a la fluorescencia de la proteína verde
fluorescente (GFP).
 ¿Qué es un proceso histológico

El proceso histológico a una serie de

métodos y técnicas utilizados para
poder estudiar las características
morfológicas y moleculares de los
tejidos. Hay diversos métodos y
técnicas empleados para su
observación; con microscopio óptico o
electrónico. Existiendo variantes y su
elección dependerá del resultado que
queramos obtener.

Esquema de métodos y técnicas

 Fijación
Fijar un tejido es preservar sus características morfológicas y moleculares lo más parecidas posibles a las que poseía en
su estado vivo. Los fijadores evitan la autolisis, protegen de ataques bacterianos, insolubilizan elementos solubles que se
quieren estudiar, y evitan distorsiones y retracciones tisulares que afecten al volumen o a la morfología.
Hay fijadores químicos (calor y congelación), y químicos, que son aquellos que forman enlaces químicos con moléculas
del tejido

Físicos Crioprecipitación, o
• La congelación rápida (Criopreciptación) es un buen crioconservación.

método de preservación Las temperaturas utilizadas

ven de -70°C hasta -268°C (hielo seco y acetona, y
hielo liquido) respectivamente.

• La fijación por calor no es frecuente en histología,

puesto que produce deterioros de los tejidos. Su
efecto es la coagulación de proteínas y disolución de
lípidos. Se emplea incluso para la observación de
microorganismos, ya que preserva la forma de éstos
y sirve para su identificación
Técnica básica:
fijación por calor
 Fijación
• Métodos Químicos. En estos métodos se utilizan soluciones acuosas compuestas por moléculas fijadoras que
establecen puentes entre las moléculas del tejido, manteniéndolas en sus lugares originales e impidiendo su
degradación. Los fijadores químicos afectan al tejidos tanto física como químicamente.

• Inmersión. Las piezas de tejido se sumergen en la

solución fijadora. En algunos casos se necesitan fijar Fijación por Inmersión
extensiones de sangre o cortes por congelación sin
fijación previa. En estos casos siempre se fijan por
inmersión en la sustancia fijadora. Teniendo en
cuenta algunas precauciones.
• Perfusión. En este procedimiento la solución
fijadora se introduce a través del sistema circulatorio
por el cual accede a todas las células del tejido
gracias a la red de capilares. Es mucho más efectivo
que el de inmersión ya que la solución fijadora llega
rápidamente a escasa distancia de todas las células
de la estructura perfundida. Este requiere conocer la
presión a la que se va a introducir la solución fijadora
en el animal o estructura, la cual debe ser similar a la
Fijación por perfusión
que posee la presión sanguínea normal en estado
vivo.
 Fijadores
Existen multitud de fijadores en los manuales de técnicas histológicas. Los fijadores se pueden clasificar en dos
grandes grupos según su acción sobre el tejido: los coagulantes y los que establecen enlaces cruzados. Los
primeros, al extraer agua de los tejidos producen coagulación y desnaturalización de las proteínas, sobre todo
las de la matriz extracelular, mientras que los segundos establecen enlaces químicos entre moléculas del tejido.
Otra clasificación de los fijadores es la de que sean aditivos o no aditivos. Los aditivos tienen moléculas o iones
que se combinan con las moléculas del tejido y formarán parte de él durante el procesamiento. Los no aditivos
son aquellos que tras llevar a cabo su función son eliminados en pasos posteriores, como es el caso del alcohol
o el ácido acético.

Fijadores simples Mezclas fijadoras

• Etanol, metanol, • Líquido de Bouin

acetona • Solución de Clarke
• Ácido acético • Carnoy
• Cloruro o sulfato de zinc • Mezclas con
• Ácido pícrico formaldehído
• Formaldehído • Glutaraldehído-tetróxido
• Glutaraldehído Etanol: CH3-CH2-OH de osmio
• Tetróxido de osmio
 Inclusión
Una vez fijado el tejido tenemos que procesarlo para su observación con el microscopio. Se procede al
endurecimiento de la muestra para poder obtener dichas secciones. La regla general es que cuanto más delgada
queramos una sección más consistente debe ser la muestra de la que se obtiene. Esto se obtiene de dos formas:

La congelación de los tejidos previamente fijados

permite la obtención de secciones que pueden ir
desde unas 50 µm hasta decenas de nm de grosor,
para esto se utilizan: micrótomo de congelación para
secciones de decenas en micrómetros (µm),
criostato para secciones de entre 5 y 20 µm y
ultracriotomo para secciones ultra finas en nona
metros (nm).

La inclusión es el método más común de endurecer

el tejido y consiste en infiltrar la muestra con
sustancias líquidas que tras un proceso de
polimerización o enfriamiento se solidifican, sin
afectar a las características del tejido.
 Inclusión en parafina
Para la inclusión de muestras que han de observarse
con el microscopio óptico se utiliza sobre todo la
parafina, y en menor medida la celoidina, como medio
de inclusión.

La parafina es una sustancia de aspecto ceroso que

está formada por mezclas de hidrocarburos saturados.
No es miscible con agua, mientras que todos los
tejidos están formados principalmente por agua. la
mayoría de los fijadores son soluciones acuosas. Para
que la parafina líquida pueda penetrar completamente
en el tejido este debe deshidratarse, empleando un
solvente orgánico; como el etanol.

Por último se pasa el tejido a parafina previamente

licuada en una estufa regulada a la temperatura
apropiada. Se dan tres pasos por parafina líquida para
favorecer una completa sustitución del líquido
intermediario por la parafina.
 Inclusión en resina
Para la observación de la ultraestructura celular es necesario
hacer secciones de tejido muy delgadas, del orden de
nanometros, denominadas ultrafinas. La obtención de
secciones ultrafinas implica que tenemos que endurecer
enormemente el tejido. Esto se puede conseguir mediante
congelación, obteniendo entonces la secciones con un
ultracriotomo. Sin embargo, lo más frecuente es incluir el
tejido en un material de alta dureza como son las resinas de
tipo epoxy, o en menor medida las resinas acrílicas como el
metacrilato.

El procedimiento estándar de inclusión en resinas tipo

epoxy es similar al descrito para la parafina con algunas
modificaciones. Así, los pasos que se siguen son fijación de
las muestras por inmersión o perfusión, deshidratación,
líquido intermediario, infiltración y polimerización en el medio
de inclusión

Esquema de la inclusión en
resina de tipo epoxy.
 Corte y micrótomos
Los aparatos mecánicos para hacer secciones de un grosor de micrómetros se denominan microtomos y existen diferentes
tipos según el grosor que queramos conseguir en nuestras secciones, según el medio de inclusión en el que se encuentre el
tejido y según el proceso de endurecimiento de la muestra.

Tipos de Funcion/corte
micrótomos

Micrótomo Estos son los más usados, existen dos

para parafina tipos: de rotación y de deslizamiento. Se Micrótomo de Micrótomo de
utiliza principalmente para obtener rotación deslizamiento
secciones de 5 a 20 µm de grosor.

Micrótomo Los cortes se realizan a mano con una

manual cuchilla. Este micrótomo se usa
prácticamente sólo para tejidos
vegetales. Hace cortes gruesos, 100 µm
o más
Vibratomo Corta material no incluido, aunque sí
fijado o duro, en secciones que pueden ir
Vibratomo;
desde 30 hasta centenares de µm
vista lateral
 Corte y micrótomos
Tipos de Funcion/corte
micrótomos
Micrótomo de Son los más usados para realizar cortes por
congelación congelación (de -30°C a -40°C). Se consiguen
secciones de 30 a unas 100 µm de grosor a partir de
material congelado

Criostato Consigue secciones a partir de material congelado y se Micrótomo Criostato

obtienen grosores de 10 a 40 µm

Ultramicrotomo. Se corta material incluido en resinas y se obtienen

secciones habitualmente de una pocas decenas de
nanometros de grosor, pero también entre 0.5 y 1 µm

Ultracriotomo Su uso no está muy extendido pero se suele emplear

cuando se necesitan secciones del orden de
nanometros de material que no se debe incluir
Ultra micrótomo
 Tinción
• Las técnicas más comunes que suelen emplear en laboratorio, para el estudio de los tejidos, se dividen en
cinco categorías:
• Tinciones generales. Aquellas que usan sustancias coloreadas que se unen a componentes tisulares por
afinidad electro-química.
• . Histoquímica. Son aquellas técnicas de tinción que implican la modificación química de algunas
moléculas tisulares para posteriormente ponerlas de manifiesto con colorantes
• Lectinas. Las lectinas son dominios de proteínas, como las selectinas, que son capaces de reconocer
glúcidos que forman parte de polisacáridos. Tienen una gran especificidad y se usan para determinar el
tipo de glúcido que aparece en las glicoproteínas de las células o de la matriz extracelular, asi como
marcadores de estructuras tisulares.
• Inmunocitoquímicas o inmunohistoquímicas. Son técnicas histológicas muy potentes basadas en la
alta especificidad de la unión de los anticuerpos a los antígenos contra los que se produjeron.
• Hibridación. Son técnicas basadas en la unión complementaria de las bases de ácidos nucleicos. Esto
hace que dos cadenas complementarias de ácidos nucleicos se unan entre sí de forma muy específica, es
decir, hibriden. Siguiendo este principio se pueden sintetizar sondas marcadas, cadenas de ADN o ARN
con una secuencia de bases determinada que llevan una molécula unida para poder detectarlas. La
secuencia de bases de la sonda es complementaria a otra que está presente en la célula, normalmente en
forma de ARN mensajero. Así, podemos observar qué células expresan un determinado gen.
 Observación
El último paso de todo proceso histológico es la observación del resultado producido por la técnica realizada. Es
decir el uso de microscopio, ya sea óptico o electrónico.

Microscopio óptico Microscopio electrónico

Los microscopios ópticos, o de campo claro, utilizan
la luz visible y lentes de cristal que permiten un
aumento de las muestras de unas 1000 veces, con
un poder de resolución de unos 0,2 micrómetros.
Estos microscopios se usan para observaciones
generales, características celulares y tisulares, y
están presentes en todos los laboratorios de
histología.
Los microscopios electrónicos se basan en la alta
frecuencia de los electrones para conseguir un
poder de resolución de 1 nanometro. Se usan para
observar la ultraestructura de la célula y los tejidos,
es decir, para estudiar el nivel subcelular, como
orgánulos, membranas u organizaciones
moleculares (ribosomas). Hay dos tipos de
microscopios electrónicos: los de transmisión, que
se usan para estudiar la ultraestructura de la célula
en secciones muy finas, y el de barrido, que permite
estudiar superficies.
 Conclusiones

El uso de técnicas para la observación de los diferentes componentes histológicos, desde tejidos por medio de
cortes, en organismos tanto vegetales como animales, no permiten conocer, estudiar e identificar las diferentes
estructuras de estos organismos a nivel micrométrico, con al uso de equipos, tinciones y procesos variados y
especiales cono la congelación y cortes micrométricos para este fin.
Las aplicaciones reales pueden ser en el área médica para realizar una biopsia u otros estudios que son
importantes día a día para nosotros ya que nos ayuda en múltiples descubrimientos e investigaciones en cómo
se van estudiando y observando mediante estas técnicas.

Referencias
Atlas de Histología Vegetal y Animal Atlas de Histología Vegetal y Animal
Depto. de Biología Funcional y Ciencias de la Salud.
Facultad de Biología.
Universidad de Vigo
España