SESION 8

INCLUSIÓN:

Los pasos a seguir para la inclusión de las muestras en parafina son:

a) Deshidratación

b) Impregnación en el solvente (a este paso también se le denomina aclaración o

diafanización)

Diafanización. Las muestras deshidratadas se encuentran totalmente embebidas en alcohol

etílico absoluto; pero la parafina tampoco es soluble en alcohol por lo que es necesario
reemplazarlo por sustancias que sean capaces, simultáneamente, de mezclarse con el alcohol y
disolver la parafina. Estas se denominan líquidos diafanizadores o intermediarios. Ejemplos:
xilol, tolueno, benceno, y el cloroformo.

c) Inclusión y formación del bloque de parafina

Comprende impregnar los tejidos con un medio que llene todos los intersticios y cavidades e
intercelulares que tenga consistencia firme para realizar cortes histológicos muy finos sin
causar daño tisular, se incluye en bloques con celoidina, parafina y gelatina, para cortes finos
es mejor la parafina, la celoidina es adecuado para especímenes que contienen grandes
cavidades o espacios huecos (ojos y embriones grandes), causa menos encogimiento y
distorsión, solo es lento y tedioso.

El tiempo que permanezcan las muestras dentro de los recipientes de parafina dependerá de
la naturaleza del tejido y el tamaño de las muestras. Se sugieren los siguientes lapsos:

Primer baño de parafina------------------1 a 1.5 horas

Segundo baño de parafina----------------1 a 1.5 horas

Tercer baño de parafina-----------------30 a 60 minutos

La inclusión o formación del bloque de parafina se efectúa empleando moldes de diversos

materiales y diferentes áreas y profundidades. Pueden ser de papel, metal o plástico. El bloque
de parafina debe contener la muestra correctamente orientada para facilitar la obtención de
las secciones o “cortes”.

CORTE DE TEJIDO:

MICROTOMOS.-Existe una variedad de equipos para realizar cortes muy finos de tejidos,
tenemos:

1) De deslizamiento.- De cuchilla móvil el que puede saltar si choca en algo duro

2) Rotatorios: Es de costo elevado no corta bloques grandes como el anterior
3) De balanceo: La cuchilla es fija y corta por balanceo, bueno en cortes seriados
4) De congelación: Corta como perforando y luego lo congela inmediatamente
5) Para cortes ultra delgados para microscopia electrónica. Son más complejos
Las secciones delgadas o “cortes” se obtienen utilizando instrumentos mecánicos diseñados
para que en forma más o menos automática, seccionen el bloque de parafina en cortes
delgados y de grosor uniforme. Los instrumentos se denominan “micrótomos”

El sistema de funcionamiento de los micrótomos consta de cuatro mecanismos principales:

 sujeción del bloque de parafina.

 sujeción de la navaja.
 El que permite que el filo de la navaja seccione al bloque en cortes delgados y de
grosor uniforme.
 El de avance del bloque en un número determinado de micrómetros después que
se ha obtenido un corte.

Obtención de los cortes. Para alcanzar este propósito se deben seguir los siguientes pasos.

a) Sujetar firmemente el bloque con el sistema de abrazaderas y la muestra orientada

correctamente.

b) Alinear el sistema de sujeción de la navaja y el filo de la misma, con la superficie de corte

del bloque.

c) Desgastar la superficie del bloque de parafina hasta alcanzar el tejido y se tenga la certeza
de abarcar toda el área que se desea seccionar.

d) Marcar en el dial del micrótomo, el número de micrómetros de grosor que deben alcanzar
los cortes.

e) Accionar la manivela que desplaza la abrazadera con el bloque de parafina para obtener los
cortes (aislados o seriados). Obtenidos los cortes se recogen cuidadosamente con unas pinzas
o pinceles finos.

Extensión y adhesión de los cortes al portaobjetos. los cortes obtenidos, aislados o en forma
de cintas, generalmente se presentan arrugados y muestran una área menor que la que
poseen en la inclusión, por lo que es necesario extenderlos y luego adherirlos a las láminas
portaobjetos ( esto facilita su manipulación posterior). Los cortes se extienden al depositarlos
sobre la superficie del líquido extendedor contenido en un recipiente denominado “baño de
flotación” (éste mantiene la temperatura entre 40ºC a 45ºC). Las secciones se depositan en el
líquido procurando que la superficie brillante (aquella correspondiente al filo de la navaja) se
ponga en contacto con el líquido caliente. En caso que ciertas arrugas persistan, se emplean
unas pinzas finas o un pincel de pelo de camello, para ejercer una ligera tracción entre los
extremos de los cortes y así desarrugarlos totalmente.

Para garantizar una mejor adhesión de los cortes a los portaobjetos, se recomienda incorporar
sustancias adherentes al líquido extendedor o, en ciertos casos, al portaobjetos. Estas
sustancias suelen emplearse de dos maneras:

a) Extensión previa de la sustancia adherente a una de las superficies de la lámina

portaobjetos, por ejemplo, la albúmina de Mayer, constituida por partes iguales de
glicerina y clara de huevo, a la mezcla se le añaden algunos cristales de timol como
 ingrediente conservante. La mezcla se filtra y se guarda en refrigeración. Se le utiliza
extendiendo una gota de la mezcla en el portaobjetos y se deja secar. Los cortes se
recogen cuidadosamente sumergiendo, por debajo de ellos, el portaobjetos en forma
oblicua. Otra sustancia adherente que se emplea del mismo modo es la poliL-lysina
(solución de 25 miligramos de la sustancia en 25 ml de agua destilada). Una gota de la
solución se extiende en el portaobjetos y éstos se secan a 50ºC – 55ºC. durante toda la
noche y está lista para su uso.
b) Al líquido de flotación se le añaden sustancias adherentes. Uno de los procedimientos
más sencillos es el que consiste en disolver, en el agua ya caliente del baño de
flotación (dos litros) 0.5 g de gelatina. En otros casos se emplea una solución que
posee los ingredientes siguientes:
- agua destilada --------------------------------- 1,000 ml
- bicromato de potasio--------------------------0.2 gramos
- gelatina -----------------------------------------0.2 gramos
El agua destilada se calienta a 60o C para disolver en ella la gelatina y el bicromato de
potasio, sucesivamente. Se filtra y está lista para su uso. Este líquido previamente
filtrado se puede utilizar varias veces. (Se recomienda guardarlo en el refrigerador).

COLORACION O TINCION. Los cortes de los tejidos adheridos a los portaobjetos están listos
para ser coloreados.

El procedimiento de coloración o tinción consiste en que una estructura celular o tisular

adquiere específicamente un color bajo la acción de una sustancia colorante.

Se denomina sustancia colorante a aquella que puede transferir su color a otro cuerpo.

Teoría de la coloración. Existen dos teorías que explican el procedimiento de la coloración

a) Teoría física. La coloración es un proceso físico de adsorción. Así, las partículas de las
sustancias colorantes disueltas penetran en los espacios intra e intercelulares en los
que se mantienen adheridas en razón de la cohesión molecular. Ejemplo, la coloración
de las grasas o lípidos es una tinción por adsorción; los Sudanes III o IV tiñen las grasas
por la facilidad que tienen para disolverse en ellas.
b) Teoría química. El colorante se une a la sustancia coloreable combinándose con ella
íntimamente debido a la presencia de agrupaciones moleculares ácidas o básicas en
los componentes celulares o tisulares que se unen respectivamente a los cromógenos
básicos y ácidos de los colorantes, formando sales insolubles. Permanentes.
c) De acuerdo a esta teoría los colorantes se unen (ligan) a los tejidos por enlaces iónicos,
covalentes o de hidrógeno.

Colorantes naturales, se extraen de:

1) Animales. Como el carmín, que se extrae de la cochinilla, artrópodo parásito de los tallos del
nopal (tuna). El carmín (de color rojo intenso) es un colorante más empleado en la industria
alimentaria y cosmética. En técnica histológica se utiliza el carmín de Best para demostrar
glucógeno, el carmín de Mayer para demostrar mucina; las células fagocíticas se evidencian
con el carmín de litio (colorante vital).
2) Vegetales. Como la hematoxilina, obtenida de la corteza de un árbol, el “palo de campeche”
(Haematoxilum campechanum), la safranina que se extrae de una liliacea (pistilos de la flor de
azafran) o la orceína que se obtiene de un liquen.

Colorantes artificiales o sintéticos. Son productos derivados de la destilación de la hulla o

carbón. Conocidos como colorantes derivados de la anilina. Los colorantes artificiales son
sales. Son compuestos orgánicos formados por las modificaciones que experimenta el anillo
bencénico cuando se reemplazan dos átomos de H por un átomo de O o con otro átomo o por
un grupo químico que tenga enlaces de doble valencia en vez de uno.

COLORACION DE HEMATOXILINA –EOSINA

La coloración de hematoxilina - eosina se considera como la técnica de tinción de uso más

frecuente en el estudio de células y tejidos, a través del microscopio fotónico.

Consiste en la tinción de:

a) los núcleos mediante una hematoxilina, previamente oxidada y transformada en hemateina

a la que se le añade una sustancia mordiente para formar una laca (para tal fin se usan sales
metálicas de aluminio, plomo o fierro). Los núcleos se colorean de azul, azul morado, violeta,
pardo oscuro o negro, dependiendo de los agentes oxidantes y mordientes que se utilizaron.

b) el citoplasma y material extracelular utilizando la eosina que les confiere diversos grados de
color rosado.

PROCEDIMIENTO:

1. Desparafinar los cortes en

- xilol -------------------------- 3 minutos

- xilol -------------------------- 3 minutos

2. Hidratar los cortes en baños decrecientes de alcohol

- alcohol absoluto (100o ) ------3 minutos

- alcohol absoluto (100o ) ------ 3 minutos

- alcohol de 95o ---------------- 3 minutos

- alcohol de 95o ----------------- 3 minutos

- alcohol de 70o ----------------- 3 minutos

- agua corriente ----------------- 5 minutos.

- agua destilada (2 baños)-------1 minuto (cada uno)

3. Colorear con la solución de hematoxilina. En este paso es conveniente respetar el tiempo de

coloración que recomienda cada tipo de solución de hematoxilina. Dependiendo de la fórmula
de preparación el tiempo puede variar de 3 a 20 minutos. La hematoxilina de uso más
frecuente es la hematoxilina alumínica de Harris -------3 a 5 minutos

4. Lavado en agua destilada (2 baños)------un minuto cada uno.

5. Diferenciar, para eliminar el exceso de colorante, se emplea el alcohol ácido, hasta que los
núcleos y los componentes basófilos de las células sean lo únicos que permanezcan teñidos -
lavar en agua corriente----------------- 2 minutos

6. Virar al color azul, empleando soluciones de:

 Solución de bicarbonato de sodio al 2%

 Carbonato de litio al 1%.

- lavar en agua corriente -------------------- 5 minutos

- lavar en agua destilada (2 baños ) -------1 minuto c/u.

7. Colorear con una solución alcohólica o acuosa de eosina------------------------------------------ 3 a

5 minutos

8. Deshidratar en baños crecientes de alcohol etílico

- alcohol de 70o ------------------------------- 1 minuto

- alcohol de 95o -------------------------------1 minuto

- alcohol de 95o --------------------------------1 minuto

- alcohol absoluto (100% ) --------------------1 minuto

- alcohol absoluto (100% ) ---------------------2 minutos

9. Diafanizar o aclarar empleando xilol

- xilol ------------------------------------------- 1 minuto

- xilol ------------------------------------------- 2 minutos

Los tejidos están preparados para realizar en ellos el montaje.

MONTAJE:

Este procedimiento consiste en colocar encima del corte coloreado y diafanizado una gota de
una sustancia adherente, diluida, generalmente en xilol (resina natural como el bálsamo de
Canadá o resinas sintéticas, cuyos índices de refracción son similares a los del vidrio) y encima
de ellos, una laminilla cubreobjetos, cuidando que no queden burbujas de aire entre la resina.

A continuación se deja que el xilol se evapore, y la resina adquiera solidez suficiente; para ello
las láminas se colocan en una platina caliente ( 45o 50o C) durante 24 a 48 horas y estarán
listas para ser observadas.