BIOTECNOLOGIA VEGETAL

Isidro E. Suárez, Ph. D.

UNIVERSIDAD DE CORDOBA
FACULTAD DE CIENCIAS AGRICOLAS
DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA AGRONÓMICA Y DESARROLLO
RURAL
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGÍA APLICADA PARA EL CARIBE - IBAC
2020
MICROPROPAGACION DE PLANTAS
MÉTODOS DE MICROPROPAGACIÓN

• Cultivo de explantes con meristemos pre-existentes (yemas).

• Organogénesis (Explantes sin meristemos pre-existentes -

Caulogénesis).

• Embriogénesis somática (Embriogénesis no zigótica).

 CULTIVO DE EXPLANTES CON
MERISTEMOS PRE-EXISTENTES
• Meristemos

– Puntos organizados de
crecimiento activo y desarrollo
celular formado por células
meristemáticas.

– Se encuentran en los ápices y

axilas foliares.

– Cada uno consiste de una

zona de células
meristemáticas rodeada de
primordios foliares.
 CULTIVO DE EXPLANTES CON
MERISTEMOS PRE-EXISTENTES

• Producción de nuevos brotes

caulinares a partir de la
elongación de las yemas
axilares presentes en un
explante.

• Interrupción de la dominancia
apical e inducción del
crecimiento repetitivo de los
meristemos laterales.

• Ocurre en unmedio de cultivo

adicionado generalmente con
citocininas.
 CULTIVO DE EXPLANTES CON
MERISTEMOS PRE-EXISTENTES
• Multiplicación: Subcultivos a medio fresco
cada 4-6 semanas, con un una
producción de 4-8 nuevos crecimientos
por transferencia.

• Resulta en mas de 4,3 x 107 nuevos

individuos por año a partir de un sólo
explante.

• Los brotes multiplicados son

seguidamente enraizados en condiciones
in vitro o transferidos directamente a
condiciones ex vitro para su adaptación.

• Es el método más utilizado en la

micropropagación comercial por sus altas
tasas de multiplicación y estabilidad
genética.
 PROTOCOLO DE MICROPROPAGACIÓN A
PARTIR DEL CULTIVO DE EXPLANTES CON
MERISTEMOS PRE-EXISTENTES

– Debergh y Maene (1981)

Etapas
– 0 Preacondicionamiento de plantas madres
– I Establecimiento in vitro
– II Multiplicación de propágulo
– III Enraizamiento in vitro
– IV Adaptación ex vitro
 ESTADOS
ESTADO 0 ESTADO I

Selección y adaptación Desinfección de explantes Establecimiento

de plantas madres

ESTADO IV ESTADO III ESTADO II

Adaptación ex vitro Enraizamiento Multiplicación

 ETAPA I
ESTABLECIMIENTO DE UN CULTIVO ESTERIL

• Objetivo: Adaptar
fisiológicamente los
explantes a las
condiciones in vitro.

• Condiciones:
– Explantes de buena
calidad.
– Ausencia de microbios.
 ETAPA I
ESTABLECIMIENTO DE UN CULTIVO
ESTERIL

• Actividades:
• Selección de explantes.
• Desinfección superficial.
• Establecimiento en medio de cultivo.
 ETAPA I
ESTABLECIMIENTO DE UN CULTIVO ESTERIL
• Condiciones:

– Tejidos en crecimiento activo.

– Ausencia de microbios
(externos y sistémicos).

– Condiciones ambientales
adecuadas (medio de cultivo,
luz, temperatura).

– Manejo.
 ETAPA I
ESTABLECIMIENTO DE UN CULTIVO ESTÉRIL
• Primer estado (Aislamiento)
– Alto estrés por la alteración del
metabolismo y adaptación a las
condiciones in vitro (rápido
crecimiento).
– Alta emisión de fenoles.

• Segundo estado (Estabilización):

– Crecimiento variable e impredecible
de órganos (Tamaño
desproporcionado).

• Tercer estado (Producción):

– Fenoles se reducen y coloración de
los tejidos acorde con su anturaleza.
– Tejidos crecen proporcionalmente.
– Multiplicación es consistente.
– Crecimiento y desarrollo responde a
efecto de RCV.
 ETAPA I
ESTABLECIMIENTO DE UN CULTIVO ESTÉRIL
• Etapa de duración variable y
resultados impredecibles.

• Reducir al máximo introducción de

material in vitro.

• Multiplicación inicia con cultivos

adaptados.

• Bloque Madre: Set de cultivos

indexados y estabilizados (Adaptados)
que se multiplican de forma lenta.
– Fuente de explantes para multiplicar.
– Aumenta eficiencia.
 ETAPA II
MULTIPLICACIÓN DE PROPÁGULO

• Objetivo:

– Multiplicación masiva, rápida y sostenida de propágulos.

 ETAPA II
MULTIPLICACIÓN DE PROPÁGULO
• Objetivo: Multiplicación masiva
de propágulos establecidos.

• Producción repetida de nuevos

tallos a partir de las yemas
axilares presentes en el
explante.

• Medio de cultivo con

citocininas: kinetina, BAP, 2iP,
zeatina, thidiazuron.

• Citocininas: Interrumpen la
dominancia apical e inducen el
crecimiento de yemas
laterales.
 ETAPA II
MULTIPLICACIÓN DE PROPÁGULO

– Cual citocinina? Que dosis? Cuantos subcultivos? Que tipo

de explante?

– Evaluación:
– Tasa de multiplicación (número y constancia).
– Longitud de los tallos producidos (≥10 mm).
– Posibilidades de generar variabilidad genética.
– El efecto posterior en el enraizamiento y supervivencia.
– Evitar la formación de callos y tallos adventicios.
– Efectos combinados de citocininas con otros RCV???
 ETAPA II
Efecto de citocininas en multiplicación in vitro de caña flecha
(Gynerium sagittatum) Var. Criolla
30 6

25 5

Longitud de Brotes (cm.)

Número de Brotes

20 4

15 3

10 2

5 1

0 0
1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6
Tratamientos Tratamientos

T1=0.0, T2=0.1 (ANA) + 0.3, T3=0.5, T4=1.0, T5=2.0, y T6=4.0 mg L-1 de BAP
 ETAPA II
MULTIPLICACIÓN DE PROPÁGULO

• Nuevos tallos deben subcultivarse (transferirse a medio

fresco) cada 4 – 6 semanas.

• Número de subcultivos posibles depende de:

– Genotipo.

– Frecuencia de variabilidad genética.

– Formación de crecimientos adventicios.

 ETAPA III
PRETRANSPLANTE O ENRAIZAMIENTO

• Objetivo:

– Producir un sistema radical que garantice la

supervivencia del material micropropagado una vez sea
transferido a las condiciones ex vitro.

– Sistema radical: Toma de agua y nutrientes, y anclaje.

 ETAPA III
PRETRANSPLANTE O ENRAIZAMIENTO
• Objetivo: Inducir formación de
raíces adventicias.
• Producción de un sistema
radical que garantice toma de
agua y nutrientes en etapa IV
sin un suplemento adicional
de carbohidrato.
• Medio de cultivo
suplementado con auxinas:
IAA, IBA, NAA.
• ANA = mas utilizada, IBA =
mejores resultados en plantas
leñosas, AIA = sensible al
calor y la luz.
 ETAPA III
PRETRANSPLANTE O ENRAIZAMIENTO

• La selección del tipo y cantidad de

auxina depende de:

– Genotipo.

– Porcentaje de enraizamiento
(>90%).

– Tipo y cantidad de raíces

producidas (cortas, gruesas y
numerosas >10 por tallo).

– Sobrevivencia de las plantas en

condiciones ex vitro (>80%).
 ETAPA III
PRETRANSPLANTE O ENRAIZAMIENTO
Diferentes niveles de ANA en el enraizamiento de plantas de caña flecha.

25

20
N° de Raíces

15

10

0
1 2 3 4 5 6
Tratamientos

T1=0.0, T2=0.5, T3=1.0, T4=2.0, T5=3.0 y T6=4.0 mg L-1 de ANA

 ESTADO IV
TRANSPLANTE EX VITRO