AGROBIOTECNOLOGIA

Micropropagación comercial

Micropropagación Vegetal

Dra. Karla Quiroz

Universidad Católica del Maule
2022

Automatización para
propagación a gran escala

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 SISTEMAS DE CULTIVO DE
TEJIDOS

• HETEROTROFICO (CONVENCIONAL)

• AUTOTROFICO

SISTEMA HETEROTRÓFICIO
• Adición de azúcar como fuente de C en el medio de
cultivo, incrementado la contaminación biológica.
• El uso de reguladores de crecimiento son siempre
necesarios para la regeneración de plantas.
• El aire dentro del recipiente está saturado con vapor de
agua y concentraciones de CO2 y etileno, lo que
muchas veces conduce a anormalidades o a un
deficiente crecimiento.
• Alta mortalidad en la aclimatación, del 20 al 50%

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 Principales limitantes de los
protocolos de micropropagación
convencional
• bajos coeficientes o tasas de multiplicación,
• alto costo de la mano de obra y
• escasa posibilidad de automatización.
Estos factores repercuten negativamente en el precio unitario
de la planta obtenida a través de este proceso.
Estas razones han limitado el empleo masivo de la
micropropagación a escala comercial, convirtiéndose en
una técnica factible de aplicar sólo a aquellas especies en
las cuales el valor unitario de la semilla es muy alto o
cuando se desea masificar la producción de clones de alto
valor genético.

AUTOTROFICO
1. Bajo condiciones naturales la plantas son autotróficas
y la fuente de carbono es el CO2 atmósferico
2. Bajo condiciones de CTV, los carbohidratos en el
medio y el CO2 en el ambiente del envase
(mixotróficas). Se ha detectado una baja tasa
fotosintética
Una total autotrofia bajo condiciones de CTV requiere
extra CO2 y la posibilidad de que el mismo ingrese a los
envases
También una alta intensidad lumínica (250 µmol.m-2.s-1).
Baja concentración de azúcar.
Sin embargo, las plantas autotróficas no son mejores que
las mixotróficas.

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 Sistema Autotrófico
hidropónico INTA EEA, Argentina
(SAH)1
• Producción de plántulas autotróficas por sistema
hidropónico de alta sanidad
Basado en:
• Capacidad fotoautotrófica de las plántulas
• Conceptos de hidroponía
• Manejo de los factores ambientales
• Micropropagación

Combina las técnicas de

micropropagación y de multiplicación
autotrófica.
1 Susana Rigato, Adriana González y Marcelo Huarte

VENTAJAS

• – MEJOR CALIDAD
DE PLÁNTULAS
• Mayor tamaño
• Mejor funcionamiento
fisiológico
• Crecimiento uniforme

•Aumento de la productividad
•Disminución de pérdidas por contaminaciones
•Disminución del shock de transplante
•Mayor cantidad de plántulas en menor tiempo

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 VENTAJAS-SAH
A partir de 100
plántulas en tubos de
ensayos:

10.000 plántulas rustificadas en un mes

VENTAJAS-SAH
Disminución de los costos
Utilización de materiales económicos
Disminución de etapas de alto consumo de mano de obra
Simplicidad y rapidez en el transplante
Excelente adaptación y rápido crecimiento luego del transplante
Ciclo más corto en invernadero
– Mayor aclimatación en condiciones de invernadero.
– Aumento de rendimiento en un 25%.

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 SISTEMAS DE INMERSION
TEMPORAL
y BIORREACTORES
SIT/RITA/TIB

• El costo de mano de obra representa el 65-85 % de los costos

totales.
• La automatización puede reducir los costos.
• Scaling-up en la micropropagation puede incrementar el número
de explantos a manejar y reducir los costos de mano de obra.
Puede alcanzarse de diferentes maneras:
1) Homogenización del tejido en mezcladores en vez de cortar a mano
2) Automatización mediante el uso de cultivo en medio líquido y
biorreactores
3) Robotización
Los sistemas en medio líquido pueden ser de dos tipos:
1) Sistema de inmersión temporal.(Temporary immersion systems)
2) Inmersión permanente de las células o tejidos lo que requiere
suplementar con oxigeno. (Permanent submersion of the plant
cells/tissue): shakers o biorreactores
Los embriones somáticos y los brotes pueden crecer en medio líquido.
La ES mediante el sistema de Semilla sintética es el modelo para automatizar

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 Existen diversos modelos de biorreactores para
la propagación masiva

Propagación de eucaliptus
en sistemas de inmersión temporaria

Multiplicación de plántulas de arroz en biorreactores RITA

Sistema de Inmersión Temporal

SIT
Consiste en colocar en un contenedor
yemas nodales, (nudos) que se
ubican en el tallo de la planta y que
se activan fisiológicamente
generando nuevas ramas, y en otro,
un medio de cultivo líquido que se
transfiere en forma automática
hacia el primer recipiente, con
tiempo y frecuencia de inmersión
determinado para cada especie o
variedad, lo que permite la
multiplicación masiva de los brotes.

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 1

3 2
Air pump
Regulator valve
Solenoid valve
Hydrophobic air filter

Operating cycle of the TIB. (1) emersed stage, shoots are culture in one
vessel and the second for the liquid culture medium. (2) beginning of the
immersed stage the medium is pushed up into the plant container,
immersing the shoots (3) End of the immersed stage, second solenoid valve
is opened and the culture medium is carried out to its container.

Summary of pineapple micropropagation

using temporary immersion bioreactor.

8 buds 6 weeks 16 weeks

600 shoots
Establishment Three Subculture
Proliferation (4 weeks)

Aclimatization
(16 weeks)
30000 shoots
(>4.0 cm)
Commercial
30000 shoots Elongation Pre-elongation laboratory
(<4.0 cm) (3 weeks) (1 week)

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 Scaling –up pineapple plant propagation using
Temporary Immersion Bioreactor TIB(Cuba)

PROTOCOL TO PROLIFERATION OF PLATAIN Musa (AAB) CLON

CEMSA ¾ IN TIB

TIB Immersion frequency

4 min / 5 h

In vitro Conventional
establishment micropropagation
. 3 subcultures in semi-solid 60 ml / shoots
medium

MS + 4.44 µmol/L meta-topolina

5 shoots
28 d

Subculture
x 3 times

Elongation
21 d
ACCLIMATIZATION

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EXPLANTS
8 weeks 45 d

Establishment Callus 4th subculture

MS
Regenerations
0,36 µmol L 2,4-D MS 24 weeks
4,4 µmol L BA 8,9 µmol L BA

Acclimatizacion Elongation Proliferation

(30 d) (45 d)
MS MS

1 µmol L GA3 BA+Pectimorf

BA+C-751

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 LifeReactor TM
Presterilized, Disposable Bioreactor1
• Es simple, económico?, con
recipientes descartables.
• Es utilizado para cultivos
organogénicos como nódulos,
meristemas, o clusters de
brotes, embriones somáticos,
células, y para crecer bulbos,
cormos y microtubérculos.
• El sistema produce 1000 plántulas
por litro de medio líquido.
– Banana, Pineapple, Potato
microtubers, Anthurium ,
Boston Fern, Orchid ,Pine

Professor Meira Ziv, of the Hebrew University Faculty of Agriculture, and Dr. Robert Levin, of
Osmotek Ltd. http://www.osmotek.com/BioReactor.html

LifeReactor TM

Product Name : Multiple Bioreactor Stand and Vessels

Description : Holds (12), 5L bioreactor vessels and accessories US$10,000.00
Product Name :LifeReactorR BIOREACTOR KIT US$: 920.00

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 RITA®, temporary immersion
system (CIRAD)

«RITA» Inmersion Temporary

• Consiste en sumergir en
un medio líquido
durante breves períodos
de tiempo los explantes
para acelerar la
aparición de brotes.
• Se incorpora un alto
grado de
automatización, se
mejora la calidad y se
disminuyen los costos.

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 Funcionamiento

Características
• Fácil de manejar
• Mejora la nutrición: la planta
esté en íntimo contacto con el
medio durante la inmersión,
y está cubierto por un film
durante el período de
retroceso
• Reducción de la asfixia
• Renovación completa de la
atmósfera del cultivo en cada
inmersión.
• Control de los procesos
morfológicos por la
modificiación de la frecuencia
y duración de la inmersión

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 Instalación

Plantines de caña de azúcar creciendo en biorreactores

La inmersión
temporaria sirve
como alternativa
durante la
Etapa II para
incrementar
la calidad y
bajar los costos

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 VENTAJAS
• es un sistema eficiente, ya que reduce el uso de mano de
obra, reactivos, material fungible, niveles de
contaminación, manipulación de brotes, y el tiempo de
producción de las plantas.
• Mediante su aplicación se elevaron las tasas de
multiplicación de plantas, el porcentaje, de
enraizamiento y su sobrevivencia en la etapa de
climatización, así como la producción masiva por metro
cuadrado.
• Estos factores tienen incidencia directa en la disminución
de costos de producción, que en algunos casos asciende al
50 por ciento, comparado con el sistema de propagación
convencional.

Cambios que pueden realizarse a lo largo de

los subcultivos para estimular el crecimiento
de los plantines in vitro:

• Cultivo en doble fase:

Otras
alternativas - Agregado de medio de cultivo líquido sobre
el agar
para optimizar
la productividad • Alternancia de medios de crecimiento:
de la Etapa II
- Cambios en el balance de citoquininas
- Modificaciones del medio basal

• Cambios físicos en el microambiente del

plantín en crecimiento.

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 • Crecimiento fotoautotrófico: cultivos que pueden
crecer sin agregado de azucar.

- No es útil para explantos pequeños.

- La morfogénesis y embriogénesis requieren azúcar.
La automatización - Se encuentra aún en etapa experimental.
es una
herramienta que • Pasos que han sido robotizados:
se utiliza
en unos pocos - Selección del recipiente
cultivos y que se - Apertura del recipiente
encuentra aún - Extracción de los plantines
en
- Identificación y remoción de material necrótico
experimentación
- Corte de los explantos
- Transferencia a nuevo medio de cultivo

• La robotización resulta en pérdida de cantidad

y calidad de vástagos.

Referencias 1. Murashige, T. Plant propagation through tissue cultures. Annual Review of

Plant Physiology, 25:135-166, 1974.
2. Debergh, P.C. and Maene, L.J. A scheme for the commercial propagation
of ornamental plantas by tissue culture. Scientia Horticulturae, 14:335-345,
1981.
3. Franclet, A. Biotechnology in “rejuvenation”: hope for the micropropagation
of difficult woody plants. Acta Horticulturae, 289:273-282, 1991.
4. Johnson, K.A. Liquid medium addition to improve shoots elongation of
Blandfordia grandiflora in vitro. Acta Horticulturae, 325:453-460, 1992.
5. Kozai, T. Phtoautotrophic growth of strawberry plantlets in vitro and
changes in nutrient composition of the medium. Plant Cell Tissue and Organ
Culture, 25:107-115, 1991.
6. Levin, R. and Vasil, I.K. Progress in reducing the cost of micropropagation.
IAPTC Newsletter, 59:2-12, 1989.

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