LABORATORIO DE QUÍMICA ORGÁNICA – UNIVERSIDAD DEL VALLE

OBTENICÓN CUANTITATIVA Y CUALITATIVA DE DOS COMPONENTES EN UNA

MEZCLA DE TINTES MEDIANTE CROMATOGRAFIA DE COLUMNA Y CAPA
DELGADA

Johan David Mera Erazo (1736047), Juan Manuel Sterling Montealegre (1722465), Gabriela
Andrea Vélez Cerón (1729149)
mera.johan@correounivalle.edu.co, sterling.juan@correounivalle.edu.co,
gabriela.velez@correounivalle.edu.co
27 de agosto del 2019, Departamento de Química – Universidad del Valle

RESUMEN. Se llevó a cabo la sepación de una mezcla de tintes por medio de dos métodos cromatograficos:
de columna y de capa delgada. En la primera, se obtuvo la separación cuantitativa de cada tinte por la acción
de dos disolventes (fase movil) y de gel de silice (fase estacionaria); con el primer disolvente (etanol) se
extrajo un tinte de color verde correspondiente a flueresceina y con el segundo (ácido acetico/agua) se obtuvo
un tinde de color azul correspondiente a azul de metileno. En la segunda se llevo a cabo una evaluación del
desplazamiento ascendente de cada tinte y de la mezcla de tintes en dos placas cromatograficas de silice,
donde se visualizó que el etanol al ser un disolvente polar moderado es selectivo al eluir solamente a la
fluoresceina, mientras que el ácido acetico diluido al tener un comportamiento muy polar no es selectivo y
arrastra los dos tintes de la mezcla.

DATOS, CALCULOS Y RESULTADOS

Tabla 1. Soluciones recolectadas en la
Cromatografia de columna (CC)
cromatografía de columna.
Peso gel de silice: 4.09 ± 0.01 g FASE
ESTACI FASE MÓVIL
La mezcla de tintes era de color verde, cuando ONARIA
se vertió en la columna de cromatografía, al Ácido Ácido
adicionarle el disolvente (etanol), la mezcla se 4.09g EtOH EtOH acetico/ag acetico/a
separo en dos sustancias de colores diferentes de gel ua gua
de Tubo 1: Tubo 2: Tubo 4:
(azul y amarillo-versoso). La primera sustancia Tubo 3:
silice Sln. Sln. Sln. Azul
que bajo de la columna fue la de color amarillo- incolora amarilla
Sln. azul
claro
verdoso adicionando etanol. Acto seguido, la
segunda sustancia que bajo fue la azul
adicionanso ácido acetico.

Figura 2. Sustancias recolectadas

Figura 1. Columna cromatografica con

división de sustancias.
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reversible y continuamente en la dirección del

flujo del disolvente. El proceso descrito puede
Cromatografia de capa delgada (CCD) escribirse como un equilibrio competitivo en
Tabla 2. Datos experimetales. donde hay una partición de los componentes
entre la fase estacionaria y la fase móvil. Entre
Distancia placa Distancia placa
1 con disolvente 2 con disolvente más polar sea un compuesto, más fuertemente se
etanol (cm) ácido acetico adsorbe en la fase estacionaria, por lo que su
(cm) desplazamiento es más lento por la fase móvil,
Punto azul 0.1 1.1 que los compuestos menos polares2.
Punto 2.9 2.3 El principal factor para controlar el movimiento
amarillo de los diferentes compuestos en las tenicas
cromatograficas es la polaridad del disolvente
Para calcular la movilidad relativa se utilizó (ver figura 3).
siguiente ecuación:

distancia recorrida por el compuesto

Rf = (Ec.1)
distancia recorrida por el disolvente

Movilidad relativa primer placa: para calcular

esta, se midio la distancia total recorrida por el
disolvente (etanol) la cual fue de 3.6 cm junto
con toman los datos de la tabla 1.
0.1 cm
Rf punto azul = = 0.03 (Ec.2)
3.6 cm
2.9 cm
Rf punto amarillo = = 0.81 (Ec.3)
3.6 cm
Movilidad relativa segunda placa: la distancia
total recorrida por el disolvente es de 2.7 cm.
1,1 cm
Rf punto azul = = 0.41 (Ec.4)
2.7 cm
2.3 cm
Rf punto amarillo = = 0.85 (Ec.5)
2.7 cm
ANALISIS DE RESULTADOS
La cromatografia es una técnica de separación
en la que los componentes de una muestra A y
B se separan en dos fases: una fase estacionaria
(adsorbente) de gran área superficial, y una fase
móvil (disolvente) el cual fluye a través de la
fase estacionaria1.
La separación surge de las interacciones mutuas
de los componentes de una muestra, disolvente
y adsorbente. La fase estacionaria o adsorbente
está presente en un gran exceso, con una gran
superficie y con sitios polares capaces de unir
reversiblemente pequeñas concentraciones de
sustancias por un proceso esencialmente
electrostático. El disolvente compite con los
componentes de la muestra por los sitios de
unión. Estos componentes son desplazados
Figura 3. Disolventes en orden de polaridad
y elución3.
Se debe tener en cuenta que entre más polar sea
un disolvente, más rápido es el movimiento de
los compuestos y menos efectiva la separación 3.
En la sesión de laboratorio se evaluaron dos
tipos de cromatografia: cromatografia de
columna (CC) y cromatografia de capa delgada
(CCD).
La cromatografia de columna es una técnica
donde se adiciona la mezcla a separar sobre el
borde de la fase estacionaria, la cual se mantiene
dentro de una columna angosta, empacada
uniformemente y la fase móvil es forzada a
pasar a través del tubo bajo presión o por
gravedad (ver Figura 1)4. Esta se empleo para
realizar la separación de una mezcla de tintes
inicialmente de color azul oscuro, la cual
contenia fluoresceina de formula5 C20H12O5 y
azul de metileno (cloruro de metilionina) un
compuesto heterocíclico de formula6
C16H18N3SCl (ver Figura 4 y 5).
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Figura 4. Estructura de la fluoresceina5.
Figura 5. Estructura del azul de metileno6.
Para la mezcla de tintes, se utilizo como fase
estacionaria silica de pH 7, que en ocasiones
actua como catalizador ácido. La silica tiene un
tamaño de granulo grande, el cual es importante
tener en cuenta, ya que una gran superficie
implica una mayor adsorción, es decir, mejor
resolución. Gracias a esto, el equilibrio
adsorción-desorción, fue lento, debido a la
lejania entre sitios activos de los sucesivos
gránulos de adsorbente. Otro factor para tener en
cuenta es el empaquetamiento de la silica en la
columna, es decir la homogeneidad en el armado
de la fase estacionaria, esta dada por un
asentamiento parejo de su relleno, adicionando
el solvente en este caso etanol, dejandolo gotear
lentamente mientras esta se asienta poco a poco
por el paso del liquido7.
Al adicionar la mezcla de tintes a la columna,
con el primer solvente (etanol), se evidenció que
el compuesto que eluyo primero fue el de
fluoresceina, gracias a que las interacciones
entre la fluoresceina-etanol son más fuertes que
el etanol-azul de metilo. Donde este ultimo
estuvo retenido por la fase estacionaria al ser
más polar que la fluoresceina.
Una vez finalizada la elución de la fluoresceina,
se cambio el disolvente por agua-ácido acetico,
esta combinación es mucho más polar que el
etanol (ver Figura 3), y tiene una fuerza de
elución grande, removiendo a su paso a la
muestra, que ya no queda ligada a la fase
estacionaria. Logrando separar estos dos
compuestos de una forma muy efectiva (ver
Figura 2 y tabla 1).
Por otra parte, la cromatografia de capa delgada
(CCD) tuvo como finalidad identificar las
sustancias separadas en la mezcla. Esta es una
de las tecnica más utilizadas para el seguimiento
de reacciones, determinar el grado de pureza en
un compuesto y controlar el contenido de las
fracciones obtenidas en la cromatografia de
columna8.
En la CCD, este proceso consta de una placa la
cual es una lámina aluminio recubierta con una
capa delgada de un sólido adsorbente (gel de
sílice). Para llevar a cabo esta tecnica se dispuso
de dos placas donde se coloco un punto de la
mezcla de tinte en disolución y un punto de la
solución de cada tinte (amarillo y azul) separado
de la cromatografia de columna en cada placa.
Cada placa se introduce en dos vasos de
precipitados, uno con disolvente etanol y el otro
con ácido acetico-agua, de forma que sólo la
parte inferior de la placa queda sumergida en el
líquido (ver figura 6).
Figura 6. Montaje de cromatografia de capa
delgada9.
El disolvente corresponde a la fase móvil y se
desplaza a lo largo de la placa por capilaridad.
Los componentes se diferencian en la fuerza de
su adsorción, de forma que unos componentes
se desplazarán más que otros10. Cuando el
disolvente llega a la parte superior de la placa,
esta se saca del vaso de precipitados, se seca, y
los componentes separados de la mezcla se
visualizan con luz ultravioleta para observar la
placa (figura 7).
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(a) (b)
Figura 7. (a) placa con punto amarrillo y en
etanol; (b) placa con punto azul y en ácido
acetico-agua.
En la Figura 7.a se observó que el compuesto
que se desplazó a lo largo de la placa fue el
amarillo o la fluoresceína y en muy pequeña
proporción el azul de metileno, esto es, gracias
a que la silica gel (fase estacionaria) formó
enlaces más fuertes con el azul de metilo,
mientras que con la fluoresceína se adsorbió
más débilmente, por ende, el etanol arrastró el
compuesto más fácilmente sobre la fase
estacionaria. También, se observa que la marca
patrón de fluoresceína tomada de la elución de
la cromatografía de columna se desplazó a la
misma distancia de la fluoresceína de la mezcla,
deduciendo que el tinte fluoresceína se extrajo
con una alta pureza y efectividad 11. La
movilidad relativa (RF) para la fluoresceína dio
0.81 y para el azul de metilo 0.03 (ver Ec.2 y 3),
esto corrobora lo discutido anteriormente, al
observar una diferencia de 0.78 la cual es
significativa, obteniéndose buena separación de
los compuestos.
En la Figura 7.b se observó que los dos
compuestos de la mezcla de tinte se desplazaron
a lo largo de la placa, donde la fluoresceína
(tinte amarillo) tuvo un mayor desplazamiento
que el azul de metilo, esto es debido a que a
entre menos polar sea el compuesto mayor
movilidad tendrá. El solvente utilizado fue ácido
acético-agua este al ser muy polar tiene una
fuerza de elusión grande, y remueve a su paso a
la mezcla de tintes, que ya no queda ligada al
adsorbente. Cuando dos o más componentes
corren con el frente de este tipo de disolventes,
no sirven como fines separativos ya que no se
logra observar una separación efectiva. Por otro
lado, al utilizar mezclas de disolventes, las
volatilidades relativas de los solventes pueden
ser distintas. Esto implica la evaporación
preferencial del más volátil y una
inhomogeneidad en la polaridad de la mezcla de
disolventes11. La movilidad relativa en este caso
para la fluoresceína dio 0.85 y para el azul de
metilo 0.41 (ver 4 y 5), con una diferencia de
0.44 la cual es menor que la primera placa, por
ende, no resulto tan efectiva la separación ya
que el disolvente no pudo desorberlas
selectivamente (distinguirlas).
SOLUCIÓN DE PREGUNTAS
1. ¿Explique por qué y cómo se separan los
compuestos de la mezcla de tintes?
La especie que migra de última, lo hace porque
es más fuertemente retenida que la otra y por
tanto se retrasa durante el proceso de migración.
Los compuestos de la mezcla de tintes se
separan, porque tiene diferentes velocidades de
migración y se van aislando cada vez más, hasta
completar la separación a medida que se les pase
cantidades suficientes de fase móvil a través de
la columna, hasta lograr que cada uno de los
componentes individuales llegue al final para
recogerlos por separado12.
2. ¿Qué es la cromatografía de columna
seca? Y cómo se desarrolla?
La cromatografía en columna seca, se desarrolla
a partir del empacado de la columna
cromatográfica con material de relleno seco. La
muestra se añade como una disolución
concentrada o seca sobre una pequeña cantidad
de adsorbente antes de la introducción. Se deja
que el disolvente descienda a lo largo de la
columna por capilaridad hasta que el frente casi
alcance la parte inferior. El flujo de disolvente
se para y se sacan las bandas de la columna, por
corte. Luego se extraen con un disolvente
adecuado.
No hay flujo de líquido a través de la columna y
no se forman canales; la zona de separación está
definida. La cromatografía en columna seca
realiza la separación de manera rápida, y
requiere poco disolvente. Cuando se usa
alúmina o gel de sílice, las separaciones se
pueden extrapolar directamente de las placas de
TLC analíticas eligiendo el mismo adsorbente
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en la columna, por lo tanto, el método es una
variante de TLC analítico con la misma
resolución. La cromatografía en columna seca
ha demostrado ser eficaz para un
fraccionamiento inicial rápido de extractos de
plantas13.
3. ¿Cuál es el desarrollo múltiple y el
desarrollo bidimensional de la CCD?
En algunos casos las mezclas de compuestos
analizadas por cromatografía de capa delgada
son complejas y los valores de Rf obtenidos
pueden no diferenciarse claramente. En estos
casos podrá utilizarse nuevamente la placa ya
desarrollada con un solvente y volver a
desarrollarla con el mismo sistema de solventes
o no rotándola 90° con previo secado. Cada
sustancia estará entonces caracterizada por dos
valores de Rf. Las placas usadas en este tipo de
cromatografía deben ser cuadradas14.
4. ¿En qué consiste la CCD preparativa?
Cuando se tienen menos de 300 mg de muestra
y se quieren separar por cromatografía de
adsorción, puede emplearse una cromatografía
en capa preparativa. Una vez elegido el
adsorbente, deberá recurrirse a la cromatografía
de capa delgada para la elección del solvente
apropiado a emplear en la escala preparativa. Si
cuando se analizó el solvente optimo, la de capa
delgada estaba suficientemente activada y la
relación de mesa de muestra a masa de
adsorbente era correcta se puede esperar un
buen resultado y reproducibilidad de los mismos
tanto en capa delgada como en preparativa.
Para armar una placa preparativa se utiliza silica
y alumina. La localización de las sustancias en
capa preparativa se realiza mediante el revelado
de una zona marginal de la placa15.
5. ¿Qué es una resina de intercambio
aniónica? ¿Y una resina catiónica?
Las resinas de intercambio iónico son materiales
de estructura porosa e insoluble que contienen
grupos reactivos que están asociados a iones
lábiles capaces de intercambiarse con los del
medio que los rodea.
Las resinas de intercambio iónico se clasificaron
en dos grandes grupos, resinas catiónicas y
resinas aniónicas, estas pueden ser resinas
catiónicas fuertemente o débilmente ácidas y
resinas aniónicas fuertemente o débilmente
básicas.
Las resinas catiónicas poseen cargas negativas e
interaccionan con cargas positivas, estas
generalmente son utilizadas en dos formas, en
forma libre del ácido o forma de hidrógeno y de
forma salina, la forma de hidrógeno fijará
aniones y liberará una cantidad equimolecular
de iones hidrogeno a la solución, mientras que
la forma sódica se absorberán los aniones y se
liberará iones sodio, entre los intercambiadores
catiónicos se encuentran –SO3H y -CH2SO3H.
Las resinas aniónicas poseen cargas positivas e
interaccionan con cargas negativas, además
tienen propiedades que dependen de la fuerza
básica de la naturaleza del grupo activo y
también de su posición, entre las resinas
aniónicos se encuentran los grupos amino, -NH2
y amino sustituidos16.
6. Indique algunas de las aplicaciones de la
cromatografía de adsorción en columna.
La cromatografía de absorción en la que la fase
móvil es un líquido que fluye a través de un
sólido por efecto de la gravedad se utiliza para
concentración de trazas, separación de iones
interferentes en análisis clásico, separaciones de
iones de características similares, separación de
componentes de una síntesis orgánica,
separación de colorantes, separación e
identificación de hioscina y de morfina,
desmineralización del agua, preparación de
disoluciones patrón y disolución de sustancia
insolubles17.
CONCLUSIONES
 Los dos métodos cromatograficos
demostraron ser optimos para la separación
de mezclas.
 El adsorbente juega un papel vital en la
cromatografia, este es el encargado de
retener los solutos hasta la acción de un
solvente. La fuerza con la que este mantiene
un soluto es debido a las fuerzas
intermolculares propias deribadas de la
polaridad entre estos.
 El tipo de solvente utilizado para separar
compuestos de una mezcla por cromatografia
debe ser selectivo para que está sea efectiva,
y a su vez, este debe tener la sufienciente
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polaridad capaz de desplazar el soluto orgánicos por métodos de distribución entre

deseado. fases, Cali. Departamento de Química,
 En CCD la placa de etanol como fase movil Universidad del valle; 1987. pp. 84,86.
resulto más efectiva para la separación de la 16. Galagovsky L.; Op. Cit, p 205.
mezcla y determinación del grado de pureza. 17. Molina, P.; Gomez, L.; Cromatografía de
adsorción. Prácticas de Química Orgánica.
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