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COLORACIONES ESPECIALES
HISTOQUIMICA
12 Nov. 2011
COLORACIONES ESPECIALES
Reactivos y solucione empleadas en Histoqumica .. 5 12
1. PAS. .. 13
2. PAS con diastasa.. 15
3. Masson. 16
4. Reticulina.. 18
5. Rojo congo.. 20
6. Alcian Blue .......... 22
7. Coloracin de Perls 24
8. Despigmentacin 25
9. Verhoeff. 26
10. Methenamine 27
11. Giemsa 29
12. Fontana Masson . 30
13. Mtodo Von Kossa. . 31
14. Van Giesson33
15. Ziehl Neelsen 34
16 Gram. 35
17 Grocott . .. 36
18 Warthin Starry 37
INTRODUCCIN
En los estudios de biopsias y muestras de autopsias con el microscopio de luz
compuesto y los cortes histolgicos se examinan teidos con hematoxilina y
eosina., tejidos incluidos en parafina slida y de los cuales se obtienen los
cortes histolgicos de 2 a 4 micras, que se tien con hematoxilina eosina y
luego se montan sobre una laminilla cubre objeto
A partir de aqu el Mdico Antomo Patlogo realizar un diagnstico ptico
con ayuda del microscopio donde le permitir realizar un diagnstico adecuado
en ms del 80% de los casos. En el 20% restante es necesario utilizar tcnicas
complementarias como microscopa electrnica, inmunohistoqumica o biologa
molecular aplicada a histopatologa.
De todo esto se tendrn que solicitar en el Laboratorio de Anatoma Patolgica
las llamadas Coloraciones especiales Histoqumica, que son preparaciones
histolgicas pueden teirse con otros colorantes para identificar estructuras
especiales como fibras elsticas, colgeno, secreciones o pigmentos .
EJEMPLOS DE TINCIONES HISTOQUIMICAS ESPECIALES
Tincin especial
Estructuras o componentes
identificados
van Gieson
Fontana-Masson
melanina, argentafinidad
Perls
hierro
Tricrmica de Masson
Fibras colgenas
Coloracin de Wilders
Fibras reticulares
Zieel Neelsen
BK
Giemsa
Germenes
PAS
azul alciano
mucopolisacridos cidos
Verhoeff
Gram
bacterias
Rojo de congo
amiloide
La histoqumica es la aplicacin de reacciones qumicas y bioqumicas en la
tcnica histolgica, con el fin de localizar y determinar de manera cientfica
ciertas sustancias o su actividad.
En todas estas reacciones o bien se tie la sustancia que buscamos los
colorantes reaccionan qumicamente con ella.
OBJETIVOS
1. GENERAL
El objetivo general de este manual prctico es el de compartir
conocimientos tanto tericos como prcticos sobre la histoqumica y las
coloraciones especiales comn mente utilizadas en el laboratorio de
Anatoma Patolgica en forma sencilla paso a paso.
2. ESPECIFICO
Contribuir en la capacitacin de aquellas personas relacionadas al rea
de Anatoma Patolgica : Profesionales, en sus diferentes especialidades,
tecnlogos, Bilogos, Tcnicos y personas que de alguna u otra manera
estn involucrados en el rea de la histotecnologa , que quieran lograr en
forma prctica conocer y desarrollar las diferentes coloraciones especiales
y asi mismo la preparacin de nuestros propios reactivos , los cuales
contribuyen al xito de una buena coloracin.
Interpretar el fundamento de las coloraciones en la prctica
Ejercitar las tcnicas de coloracin simple y compuesta.
Practicar la preparacin de coloraciones de uso a partir de soluciones
Madre .
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
0.17 Bouin:
Acido actico glacial------------------ 5ml
Formol 40%-----------------------------25ml
Acido pcrico solucin saturada---75ml
0.18 Cloruro Frrico 2%, 10%,
Cloruro Frrico----------------------2g
Agua destilada----------------------100ml
2%
Cloruro Frrico---------------------10g
Agua destilada----------------------100ml
10%
20%
Formol------------------------------- 30ml
Agua destilada----------------------70ml
30%
PREPARACION .
a) Disolver la hematoxilina en el alcohol y el alumbre en agua
destilada ayudado por calor.
b) Quitar del calor y mezclar las dos soluciones.
c) Hacer hervir rpidamente
d) Quitar del calor y agregar el Oxido amarillo de mercurio
lentamente.
e) Hacer hervir por 3 5 minutos hasta que tome color rojo morado
a oscuro.
f) Quitar de la llama y hacer enfriar.
g) Aadir 40 ml de cido actico glacial.
h) Filtrar antes de usar, estable por 6 meses.
1%
Hidrxido de Sodio-----------------0.15g
Agua destilada-----------------------5ml
0.31 Methanamine al 3%:
Methanamine--------------------------- 3 g
Agua destilada----------------------- 100 ml
0.32 Nitrato de Plata al 5%:
Nitrato de Plata AgNO3----------------- 5g
Agua destilada----------------------- 100 ml
0.33 Nitrato de Plata 10 % (Wilders):
Nitrato Plata ------------------------- 10 g
Agua destilada ---------------------- 100 ml
Colocar en frasco oscuro y aguardar en la oscuridad.
10
Thiosulfato de Sodio-----------------5g
Agua destilada-----------------------100ml
0.45 Solucin de Van Giesson:
Fucsina cida 1%----------------------- 5ml
Acido pcrico solucin saturada----95ml
0.46 Solucin Alumbre de hierro sulfato frrico amnico al 2 %
Sulfato frrico amnico ---------------- 2 g
Agua destilada --------------------------- 100 ml.
COLORACIONES
HISTOQUMICAS
FUNDAMENTO:
Consiste en oxidar los tejidos mediante el cido peridico (HIO4) para
incrementar el nmero de grupos carbonilo (aldehdo o cetona) presentes en
ellos, de forma que puedan ser demostrados posteriormente mediante reactivo
de Schiff.
Los hidratos de carbono contienen grupos carbonilos relativamente aislados, en
una proporcin aproximada de uno por molcula de monosacrido.
Precisamente por ello es necesario oxidarlos con el fin de incrementar dichos
grupos, que solo pueden ser detectados por el reactivo de Schiff si se
encuentran situados en carbonos contiguos y delimitados por grupos
alcohlicos o amino.
Para los grupos aldehidos que aparecen en posicin 1,2 glicol estas
condiciones se cumplen exclusivamente tras la oxidacin de los
correspondientes radicales hidroxilo.
Los hidratos de carbono o glcidos son polialcoholes oxidados
(polihidroxicetonas o polialdehidos). Los polisacridos son glcidos formados
por la unin de varios monosacridos (mas de 10). Entre los polisacridos
adems de los polisacridos simples como el glucgeno destacan los
polisacridos complejos.: Mucopolisacaridos (Mucopolisacaridos neutros y
Mucopolisacaridos cidos). Mucoprotenas y Mucolpidos.
APLICACION
La coloracin de PAS se utiliza principalmente para identificar glicgeno en
el tejido, y tambin macromolculas de carbohidratos (glucgeno, glicoprotena,
proteoglicanos), que se encuentran habitualmente en tejidos conectivos, moco,
y laminas basales. La coloracin PAS es tambin usada para identificar
eritroleucemias, en la leucemia de clulas rojas inmaduras estas colorearan
fucsia claro.
Esta tcnica tie de color violeta las mucosustancias neutras; tie las
clulas caliciformes intestinales utilizndose por ejemplo para poner en
evidencia la metaplasia intestinal en el esfago de Barret.
Se utiliza tambin para demostracin de produccin de mucina por las
clulas tumorales de una neoplasia epitelial poco diferenciada (que no forma
glndulas) permitiendo su tipificacin como carcinoma p.e en el carcinoma
difuso de clulas en anillo de sello gstrico
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1. Desparafinar e hidratar
2. Incubar con acido peridico 20 minutos
3. Lavar con agua destilada.
4. Incubar con reactivo de Schiff 5 10 minutos
5. Lavar con agua destilada.
6. Incubar en agua temperada por 2 minutos (viraje)
7. Contrastar con Hematoxilina Harris 30 segundos
8. Lavar con agua, diferenciar y virar
9. Lavar
10. Deshidratar , aclarar y montar.
Compuestos PAS +
1. polisacridos simples: como el glucgeno y la celulosa.
2. Mucopolisacaridos neutros: se encuentran en el epitelio gstrico, en
glndulas del duodeno y en cpsulas bacterianas, tambin en intestino y
estmago.
3. mucoprotenas como son algunas mucinas del tubo digestivo y del rbol
respiratorio o bronquial, tambin la tiroglobulina que est en el tiroides y
la hormona estimulante.
14
PAS -DIASTASA
Desparafinar e hidratar
Incubar con diastasa por 15 minutos
Lavar con agua corriente por 10 minutos
Seguir con el protocolo de PAS.
PAS
PAS VERDE
15
TRICROMICA DE MASSON
FUNDAMENTO :
Primeramente, se tien las secciones con un tinte cido tal como escarlata de
Biebrich. Todos los elementos acidfilos del tejido tales como el citoplasma, el
msculo y el colgeno se unirn a los tintes cidos. Las secciones entonces se
tratan con cido fosfotngstico y/o fosfomolbdico. Ya que el citoplasma es
mucho menos permeable que el colgeno, los cidos fosfotngsticos y
fosfomolbdicos permiten que la escarlata de Biebrich difunda del colgeno
pero no del citoplasma. Los cidos fosfotngsticos y fosfomolbdicos tienen
numerosos grupos cidos que probablemente acten como medio de unin
entre el colgeno y el azul de la anilina, que es el tinte del colgeno.
Probablemente, el pH de la solucin fosfotngstico/fosfomolbdico tambin
aumente la coloracin y ayude al colgeno en la difusin o el retiro de los
colorantes.
APLICACIN :
Se utiliza para identificar el tejido muscular, fibras de colgeno y
eritrocitos en muestras de tejido; el principal valor de este tipo de tincin es la
evaluacin del tipo y cantidad del material extracelular. Las tres estructuras
titulares demostradas por los tres colorantes que componen la tincin son:
ncleo, citoplasma y colgena extracelular. La tincin tricrmica de Masson se
utiliza con frecuencia para demostrar una deposicin aumentada de colgeno
asociada a la sustitucin de tejido funcional por tejido de cicatrizacin. Esto
resulta til para el diagnstico de la esclerosis, en la cual un colgeno
engrosado sustituye al tejido normal provocando la disfuncin del hgado. La
tincin tricrmica de Masson tambin es ms adecuada para demostrar el
tejido muscular que la tincin con hematoxilina y eosina.
Como su nombre indica, se emplean tres colorantes que colorean
selectivamente los msculos, las fibras de colgeno, fibrina y eritrocitos.
Procedimiento:
*Hematoxilina Weight
Solucin A 1:1 Solucin B
1. Desparafinar e hidratar
2. Sobrefijar con la solucin de Bouin a 60C por 15 minutos
16
3. Lavar con agua que corre por unos minutos hasta que salga la
coloracin amarilla del fijador.
4. Agregar a la lmina Hematoxilina Harris por 10 minutos.
5. Lavar con agua que corre por 2 minutos.
6. Agregar a la lmina Escarlata de Biebrich por 10 minutos.
7. Lavar con agua.
8. Agregar la solucin de cidos fosfotungsticos y fosfomolibdico por 5
minutos
9. Lavar.
10. Agregar el azul de anilina por 3 - 5 minutos.
11. Lavar con agua destilada
12. Deshidratar, aclarar y montar.
Control: tero, intestino delgado, hgado, apndice o trompa de Falopio.
Resultado:
Fibras musculares:............Rojo
Fibrina:..............................Rosa
Colgeno:..........................Azul
Ncleos:............................Azul o negro
Eritrocitos: .........................Rojo
MASSON EN RION
MASSON EN HIGADO
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RETICULINA
APLICACIN :
La coloracin de reticulina se emplea para identificar una forma primitiva
de tejido conjuntivo denominada reticulina. Este procedimiento emplea una
solucin de nitrato de plata amoniacal para teir las fibras de reticulina
presentes en el tejido. A continuacin, se reduce la plata para producir una
coloracin negra de las fibras, que quedan visibles mediante microscopio
ptico. Se evidencian las fibras de reticulina y material de membrana basal. Las
fibras de reticulina consisten en fibras finas constituidas principalmente por
colgeno tipo III.
Tradicionalmente, antes de la llegada de la inmunohistoqumica, la
aplicacin ms importante de estas tcnicas (tal como la tcnica de Gomori)
era la distincin entre carcinomas y sarcomas basndose en la distinta
distribucin de las fibras de reticulina segn englobaran grupos de clulas
(carcinoma) o rodearan individualmente cada clula (sarcomas). Hoy en da se
sigue utilizando la tincin de las fibras de reticulina en patologa heptica para
evidenciar la desorganizacin arquitectural trabecular y en estudios de mdula
sea para poner de manifiesto mielofibrosis incipiente (fibrosis reticulnica)
negativa en fases iniciales para tincin de colgeno.
Procedimiento:
1. Desparafinar e hidratar.
2. Agregar Permanganato de Potasio al 0.5% por 5 minutos.
3. Lavar con agua destilada.
4. Agregar Acido Oxlico al 5% por 2 minutos.
5. Lavar con agua destilada.
6. Agregar sulfato Ferrico Amonical al 3% por 3 minutos.
7. Lavar con agua destilada.
8. Agregar la Solucin de Plata de Wilder por 2 minutos.
9. Lavar con agua destilada rpidamente.
18
19
ROJO DE CONGO
Este mtodo utiliza una solucin alcalina del colorante Rojo de Congo con la
finalidad de eliminar tinciones de sustancias diferentes al amiloide.
Reactivos :
A : Solucin alcohlica de cloruro-hidrxido de sodio.
a) Solucin Stock.
Solucin saturada de cloruro de sodio en alcohol etlico al 80 %.
b) Solucin de Trabajo.
Solucin Stock ---------------------------- 50 ml
Solucin hidrxido de Na 1% ---------- 0,5 ml
o Mezclar y filtrar. Esta solucin se prepara 15 minutos antes de
usarla.
B Solucin de Rojo de Congo alcalino.
a) Solucin Stock
Solucin saturada de rojo de Congo en solucin en solucin saturada
de cloruro de sodio en alcohol etlico al 80 %. ( 1g Rojo congo)
b) Solucin de Trabajo
Solucin Stock ----------------------------- 50 ml
Solucin hidrxido de Na 1% ---------- 0,5 ml
o Mezclar y filtrar. Esta solucin se prepara 15 minutos antes de
usarla.
APLICACIN :
El rojo congo es la tcnica ms prctica para demostracin de sustancia
amiloide. Este procedimiento utiliza una solucin alcohlica de rojo Congo, as
como sales para reducir la tincin electroqumica de fondo y refuerza la unin
entre el colorante rojo Congo y los amiloides.
La coloracin con rojo Congo funciona sobre la base de enlaces por
puente de hidrgeno con el componente de hidrato de carbono del substrato. El
amiloide, teido por el rojo Congo, muestra un llamativo bicromatismo bajo la
luz polarizada, los sedimentos muestran sectores verdes luminosos sobre
fondo oscuro, mientras que otros materiales, como colgeno, que tambin son
teidos por el rojo Congo, no muestran este efecto.
Procedimiento:
1. Desparafinar e hidratar
2. Teir los ncleos con Hematoxilina de Harris 2 min., diferenciar y azular.
20
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Desparafinar e hidratar
Incubar en acido Actico al 3% durante 3 minutos.
Decantar.
Incubar con Alcian Blue al 1% por 30 minutos.
Lavar con agua
Contrastar con Rojo Neutro (rojo rpido) 1minuto.
Lavar
Deshidratar y montar
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Resultados:
NOTA :
Si desea preparar azl alcian a pH 1 , diluir 0,1 ml de colorante azl
alcian 1% en 10 ml de HCl 0,1 N.
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CL3Fe
Ferrocianuro frrico.
APLICACIN :
Esta coloracin se utiliza para visualizar depsitos de iones frricos en
muestras de tejido. Un exceso de hierro depositado en rganos como el
hgado, el bazo y la mdula sea puede ser resultado de una hemocromatosis.
Estos depsitos interfieren en el funcionamiento del rgano afectado y pueden
ser fatales. Este procedimiento se basa en los trabajos de Perl.
La hemosiderina representa las reservas de hierro del cuerpo, el cual se
encuentra en estado frrico; el hierro se puede visualizar por su liberacin de
la hemosiderina con acido clorhdrico, formando cloruro frrico; el hierro
reacciona con el ferrocianuro de potasio para formar ferrocianuro frrico, esto
es un compuesto azul insoluble conocido como azul de Prusia o azul de
Berln, la intensidad del color da una indicacin en cuanto a cantidad, pero es
slo cualitativa. Otras fuentes de hierro frrico tambin sern visualizadas.
Procedimiento
1. Desparafinar e hidratar
2. Mezclar Ferrocianuro de potasio al 10% en una proporcin 1:1 con la
solucin de HCl al 20%.
3. Agregar la mezcla a la lmina por 30 minutos.
4. Lavar con agua destilada.
5. Contrastar con Rojo rpido por 1 minuto o con eosina solo segundos.
6. Lavar,
7. Deshidratar , aclarar y montar.
DESPIGMENTACIN DE MELANINA
Procedimiento:
1. Desparafinar e hidratar.
2. Agregar Permanganato de Potasio al 0.25% por 5 minutos.
3. Lavar con agua destilada.
4. Agregar Acido Oxlico al 5% por 2 minutos (slo hasta que blanquee
completamente).
5. Lavar con agua destilada.
6. Colorear con H&E.
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Desparafinar e hidratar
Agregar la solucin de Verhoeff por 1 hora.
Colocar en el bao mara por 10-20m
Diferenciar con cloruro frrico 2% y enjuagar con agua.
Repetir el paso 4 hasta que decolore la coloracin negra viendo al
microscopio que solo las fibras estn negras. (1 o 2 veces mas)
6. Agregar Tiosulfato de sodio 5% por 30 segundos a 1 minuto.
7. Lavar con agua destilada
8. Contrastar con Van Giesson por 1 minuto.
9. NO LAVAR, solo secar con papel.
10. Xilol y montar.
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9. Cubrir las lminas con thiosulfato de sodio 1 minuto para fijar (opcional).
10. Lavar con agua destilada
11. Contrastar con H-E.
12. Deshidratar, aclarar y montar.
RESULTADOS :
Membrana basal -------------------------- marrn oscuro negro.
Hongos ------------------------------------- marrn oscuro - negro
Fondo ------------------------------------ rosado plido.
Hemates -------------------------------- amarillo.
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COLORACION DE GIEMSA
Fijaci{on :
Formol neutron.
Clortes :
3 micras en parafina.
REACTIVOS:
Solucin stock de Giemsa -----------------------Solucin de trabajo de Giemsa-----------------PROCEDIMIENTO:
1. Desparafinar en xilol, alcohol ,hasta hidratar en agua.
2. Diluir el colorante de Giemsa 1 /5 y filtrarlo sobre la lmina.
3. Incubar el colorante por 30 minutos.
4. Lavar con agua destilada.
5. Diferenciar en cido actico al 1 % durante 1 minuto.
6. Lavar con agua destilada.
Chequear al microscopio que los hemates estn de color rosado.
Repetir en caso necesario.
7. Deshidratarlo rpidamente en alcohol corriente, absoluto y aclarar en
xilol.
8. Montar con Blsamo de Canad
RESULTADOS:
Ncleos ------------------------ Az.
Citoplasma--------------------- Rosado.
Bacterias ----------------------- Azl.
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APLICACIN .
Fontana. Se utiliza para demostracin de pigmento de melanina.
En la reaccin argirfila se aade un agente externo para reducir la plata;
una de las ms conocidas es la tincin de Grimelius.
Estas tcnicas se utilizan en la demostracin de clulas neuroendocrinas
Fijador
:
Formol neutro al 10 %
Cortes
:
3 micras en parafina.
REACTIVOS .
Nitrato de Plata 10 % ---------------------------Solucin de Fontana Masson------------------Cloruro de Oro 0,2 % ---------------------------Thiosulfato de sodio 5 %-----------------------
PROCEDIMIENTO .
NOTA: Preparar la solucin de Fontana Masson el da anterior a la coloracin.
(ver reactivos).
1. Desparafinar, alcholo absoluto, corriente hasta hidratar con agua.
2. Lavar con agua destilada.
3. Sumergir las lminas en la solucin de Fontana Masson por 1 hora a
60C.
4. Enjuagar con agua destilada.
Chequear al microscopio que los grnulos argentafines estn de
color marrn oscuro. Si es necesario regresar a la solucin
Fontna Masson e incubar por mas tiempo.
5. Diferenciar con cloruro de oro 0,2 %, donde el tejido se pondrn de color
gris a negro (Precipitado de methenamine).
6. Fijar en Thiosulfato de sodio 5 % por 1 minuto.
7. Lavar con agua destilada.
8. Contratar con Eosina.
9. Deshidratar, aclarar y montar.
RESULTADOS :
Grnulos argentafnicos ----------------------- Negro.
Grnulos carcinoides --------------------------- Marrn
Resto del tejido ---------------------------------- Rosado a rojo.
30
1.
2.
3.
Soluciones:
Solucin acuosa de nitrato de plata al 1 %.
Solucin de tiosulfato sdico al 2,5 %.
Rojo neutro al 1 %.
Procedimiento tcnico:
1. Desparafinar e hidratar.
2. Tratar con la solucin de nitrato de plata a plena luz.. 30 60
min.
3. Lavar con agua destilada.
4. Lavar en la solucin de tiosulfato.. 5 min.
5. Volvemos a lavar con agua destilada.
6. Contrastar con el rojo neutro. 2 3 min.
7. Deshidratar, aclarar y montar.
Resultados:
- Iones calcio o calcificacin: negro.
- Ncleos: rojo.
31
1.
2.
3.
Soluciones:
Solucin madre de cido rubenico al 0,1 %.
Solucin de acetato sdico al 10 %.
Solucin de trabajo:
- De la solucin 1: por cada 2.5 ml se echan de la solucin 2, 50 ml
Procedimiento Tcnico:
1. Desparafinar e hidratar.
2. Tratar con solucin de trabajo a 37 durante toda la noche en un recipiente
tapado hermticamente.
3. tratar los cortes con alcohol etlico al 70 % 15 min.
4. Alcohol etlico absoluto.. 6 horas.
5. Aclarar con xileno y montar.
Resultados:
- Depsitos de Cobre: con granulaciones de verde a negras.
32
Procedimiento:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Desparafinar e hidratar
Agregar la hematoxilina de Weigert (tricrmica).por 10 min
Lavar con agua que corre por 2 minutos
Agregar Van Giesson por 10 minutos
Lavar con agua destilada rapidamente
Esperar a que seque , luego xilol y montar
33
COLORACIN DE ZIEHL-NEELSEN o BK
FUNDAMENTO
Estos bacilos son gran positivos, pero con esta coloracin , se colorean difcil e
irregularmente, de ah que emplee este tipo de tincin (Ziehl- Neelsen) o su
variante (Kinyoun).,
Se emplea para detectar la presencia de BAAR (Bacilos Acido-Alcohol
Resistentes), como diagnostico de enfermedades infecciosas producidas por:
a. Micobacterias: Micobacterium tuberculosis y Mycobacterium leprae.
b. Bacterias del gnero Nocardia Nocardiosis y Micetoma
actinomictico (micosis subcutnea).
El fundamento de la tcnica se basa en la pared celular rica en lpidos y cidos
carboxlicos (cido miclico) de los BAAR que tienen la propiedad de unirse
excepcionalmente fuerte al colorante 1rio, Carbol fucsina. Una vez que se forma
este complejo colorante-pared, ni siquiera la accin conjunta del diferenciador,
cido y alcohol pueden deshacerlo, ya que las paredes retienen el colorante en
forma "resistente", apareciendo los bacilos de color rojo sobre un fondo azul
Procedimiento:
1. Desparafinar e hidratar
2. Agregara la lmina carbol fucsina por 15 minutos
3. Diferenciar con alcohol cido (hasta que el tejido tome una coloracin
rosada)
4. Lavar con agua destilada.
5. Contrastar con azul de metileno por 10 segundos.
6. Deshidratar rpidamente y montar (el alcohol tiende a bajar el azul de
metileno).
Control:
Resultado: Los BAAR se observan en rojo, todo el fondo (contraste) aparece en
celeste o azul.
34
COLORACION GRAM
Esta tcnica se basa en las diferencias de la pared celular existentes
entre BGP (pared gruesa) y BGN (pared fina); sirve para clasificar bacterias u
hongos en Gram+ y Gram-; mediante esta clasificacin se puede descartar u
orientar el diagnstico de una amplia gama de enfermedades infecciosas.
Al aplicar el colorante 1rio todas las clulas (G+ y G-) absorben el colorante, al
aadir el mordiente, slo las cel. G+ formarn el complejo Yodo-Cristal Violeta
dentro de la pared celular. Este complejo fija fuertemente el colorante 1rio
(cristal violeta) a la pared celular de las clulas G+ quedando coloreado de
color violeta azulado. Cuando se aplica el decolorante las clulas G- (que no
han formado el complejo) pierden los lpidos de su pared (y con ellos el
colorante 1rio) y sta se torna porosa dejando el paso libre a cualquier otra
sustancia colorante para que ingrese a la clula. Finalmente, cuando se aade
el colorante 2rio (zafranina) ste atraviesa fcilmente la pared celular (que
qued muy porosa tras el decolorante) y tie todo el citoplasma de la clula de
un color rosado.
Procedimiento:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
Desparafinar e hidratar
Agregar a la lmina Cristal Violeta por 1 minuto.
Lavar con lugol o agua destilada.
Agregar lugol a la lmina por 1 minuto.
Lavar con agua destilada
Diferenciar con el cido .
Agregar zafranina por 1 minuto.
Deshidratar y montar
Control: Los controles del kit de tincin pueden realizarse con bacterias
grampositivas
(estafilococos) y bacterias gramnegativas (Escherichia coli).
Resultado:
Microorganismos grampositivos violeta azulado
Microorganismos gramnegativos rosa a rojo
35
GROCOTT
APLICACIN
VT: 2ml
Procedimiento:
1. Desparafinar e hidratar.
2. Agregar cido peryodico al 1% por 10minutos (reemplaza al acido
crmico de la tcnica original)
3. Lavar con agua destilada
4. Colocar en la solucin diaria a 60C por 1 hora o microondas no ms de
6 minutos.
5. Lavar con agua destilada
6. Agregar cloruro de oro 1 minuto (OPCIONAL, sirve para limpiar)
36
WARTHIN STARRY
37
1g
NO3Ag
1000ml de agua Acidulada
Soluciones de Trabajo
A. NO3Ag al 2%
(0.5g NO3Ag / 25ml agua acidulada)
B. Gelatina al 5%
(gelatina 2,5g / 50ml agua acidulada)
C. Pyrocatecol
(pyrocatecol 0,15g / 100ml agua acidulada)
*Dejar todo en Bao mara a 54C
*Combinar en el siguiente orden:
1,5 ml de a
3,75 ml de b
2,0 ml de c
Procedimiento:
1. Desparafinar e hidratar
2. Impregnacin en NO3Ag 1% a 43C por 30 minutos
3. Solucin de trabajo (A+B+C) de 4 a 7 minutos
4. Lavar con agua destilada
5. Deshidratar, montar con blsamo de Canad
Resultado: Espiroquetas-negro/ fondo-amarillo pardo.
Uso: Dx verruga peruana/ grmenes
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