CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA DE UNA SERIN PROTEASA Commented [1]: editen prros ya lo habilite

CON ACTIVIDAD SIMILAR A TROMBINA DEL VENENO DE

SERPIENTE

INTRODUCCIÓN

Existen alrededor de 3150 especies de serpientes de las cuales aproximadamente 600 son
peligrosamente venenosas para los humanos (WHO, 2010). No obstante, existen algunas
especies de las llamadas “non-front-fanged colubroid snkaes” (colúbridos sin colmillos
frontales) que habitualmente no se clasifican como venenosas para los humanos, aunque se ha
demostrado que producen veneno que en ocasiones presenta efectos clínicos significantes para
nuestra especie (Weinstein, 2013). Los venenos de serpiente son mezclas complejas de
numerosos componentes orgánicos e inorgánicos, constituidos predominantemente por
péptidos, proteínas e incluso enzimas (Menaldo D. L., et. al. 2012) como, serin Proteasas,
metaloproteasas, fosfolipasas A2, L-amino Ácido oxidasas, 5’-nucleotidasas, desintegrinas y
similar a lectina tipo-C presentes en venenos de serpientes son proteínas, las cuales pueden
afectar al sistema hemostático en diferentes puntos. Las Serin Proteasas de veneno de serpiente
(SVSPs) son usualmente glicoproteínas de cadena simple con una región catalítica altamente
conservada (Ser 195, His 57 y Asp 102) y una larga diversidad de sustratos (De Oliveira. et.
al., 2016; Serrano & Maroun, 2005). Un grupo de SVSPs son las enzimas similares a
trombina (del inglés Thrombin Like Enzyme, TLE) que se parecen al menos en parte a la
trombina y que, in vitro, pueden acelerar la coagulación de plasma o solución de fibrinógeno.
Sin embargo, in vivo, tienen diferentes efectos, por ejemplo, homeostasis y anticoagulación
(Valeriano-Zapana et. al., 2012). En Venenos de serpiente, esta clase de serin proteasa,
llamada Enzimas tipo trombina del veneno de serpiente (svTLEs), poseen actividad coagulante
similar a la trombina humana. Convierten fibrinógeno a fibrina mediante la escisión de las
cadenas A𝛼 y B𝛼. (Zaqueo D. K. et. al. 2014). Las svTLEs son importantes modelos
moleculares en el desarrollo de fármacos y agentes terapéuticos, ya que exhiben todas las
funciones principales de la trombina y resistencia a inhibidores fisiológicos. (Isabel T. F. et.
al. 2016)
Por lo tanto el objetivo del presente estudio es la caracterización bioquímica y aislamiento de
una serin proteasa, extraída de Veneno de serpiente, como también determinar el efecto de la
actividad coagulante de las enzimas de tipo trombina del veneno de serpiente.
ANTECEDENTES
Se ha purificado una proteína coagulante del tipo enzima similar a trombina, del veneno de la
serpiente peruana Bothrops pictus mediante dos pasos cromatográficos, sobre Sephadex G-100
SF y CM-Sephadex C-50, en ambos casos utilizando buffer acetato de amonio 0,05M pH 6,0.
La enzima fue purificada 18 veces con un rendimiento de 40,74% y por PAGE- SDS se obtuvo
una sola banda proteica de 54,4 kDa en condiciones reductoras con 2 β-mercaptoetanol y de
45,4 kDa en condiciones no reductoras, por lo que se estableció que la enzima consta de una
sola cadena polipeptídica con al menos un enlace disulfuro. La enzima coagulante mostró tener
actividad sobre fibrinógeno bovino así como sobre el substrato cromogénico BApNA; siendo
inhibida por heparina y por el inhibidor de serinoproteasa PMSF. La enzima registró un pH
óptimo de 8,0 para su actividad amidolítica. Los ensayos térmicos mostraron que es estable
hasta los 50 °C. El ion Mn2+, a una concentración final de 10mM, es un potente activador de la
enzima, mientras que Ca2+ y Mg2+ no muestran efecto significativo. (Mesía M. et. al., 2011)

OBJETIVOS
● Objetivo General:
Analizar la caracterización bioquímica de las Serin proteasa con actividad similar a
trombina del veneno de Serpiente en Arequipa, durante los meses de Abril, Mayo y
Junio en el 2017.
● Objetivos Específicos:
- Hallar el grado de Pureza y Homogeneidad de una Serin proteasa de veneno de
serpiente, en condiciones de laboratorio.
- Establecer el Peso Molecular de una Serin proteasa de veneno de serpiente, en
condiciones de laboratorio.
- Determinar el efecto del veneno de serpiente, sobre estructuras anatómicas de pez
cebra.
- Determinar el Índice de Coagulación por el efecto de una Serin proteasa de veneno de
serpiente, así como la actividad Defibrin(ogen)ante, en condiciones de laboratorio.
- Determinar amidolítica, pH optimo, y efecto térmico, así como el efecto de iones
metálicos e inhibidores, sobre una Serin Proteasa de veneno de serpiente.
METODOLOGÍA

La extracción del veneno se llevará a cabo en centros especializados y el veneno llegará, al

laboratorio en forma liofilizada, para facilitar la caracterización.
● Cromatografía en Sephadex:
Para la caracterización bioquímica de una Serin proteasa, se utilizará el método de
cromatografía de exclusión molecular, extraída de Valeriano-Zapata et. al. (2012),
donde se extraerá una muestra de veneno (mg) y será disuelta en un Buffer de
Bicarbonato de Amonio (0.2 M; pH 8) y homogeneizada hasta completar la disolución,
seguido por un proceso de alta centrifugación (4500 x g por 2 min). El sobrante será
fraccionado en una columna de Sephadex G75 (1.6 x 100 cm) pre-equilibrado con un
buffer de bicarbonato de amonio, el perfil de elución será monitoreado a 280 nm. Las
fracciones colectadas serán inmediatamente liofilizadas y almacenadas a -40 ºC.

● Electroforesis (SDS - PAGE):

Para la determinación del grado Pureza y Homogeneidad de una Serin proteasa, se
empleará el método de electroforesis, extraído de Yábar C. A. (2003). Primeramente
procediendo a la preparación de la cámara de electroforesis vertical, luego a la
preparación de los geles de poliacrilamida, mezclar la proteína con el buffer de la
muestra concentrada por cuatro veces (4x) en proporción 3:1. Asegurar la tapa de los
tubos con lámina extensible de parafina y someter la muestra a unos 100 ºC durante 5
min. Para tal efecto se colocara los viales en una gradilla para microtubos dentro de un
recipiente o vaso de precipitación con agua hirviendo. se retirará los tubos y se
centrifugarán a 12 000 rpm. Luego se sumergirá en un tanque conteniendo buffer de
electroforesis, dicho tanque tendrá 2 electrodos, uno positivo y otro negativo, la
distribución de la proteína dependerá de la concentración del gel, determinando el grado
de Pureza de la misma.

● Determinación del peso molecular:

Para la determinación del Peso Molecular de una Serin proteasa, se empleará el método
de Análisis de espectrometría de masas MALDI-TOF, extraído de Vilca-Quispe et. al.
(2010), usando un espectrómetro de masas Transportador-DE PRO MALDI-TOF. Un
microlitro de la muestra en TFA 0.1% será mezclado con 2𝜇𝑙de matriz preparada con
Ácido 𝛼-ciano-4-hidroxi-cinámico (Sigma), 60% de Acetonitrilo y 0.1% v/v TFA. La
 masa de la proteína será analizada en modo de análisis linear usando un voltaje de
aceleración de 25kv, con el laser fijado en 2890 mJ/𝑙𝑙𝑙2 y con un retraso de 300 ns.

● Determinación de la actividad fibrinogenolítica:

Para la determinación del Índice de Coagulación de una Serin proteasa, se usará el
Ensayo de Coagulación-Fibrinógeno, extraído de Vilca-Quispe et. al. (2010), en el cual
se determinarán tiempos de coagulación, mezclando 20𝜇𝑙de fracción de enzima con
900𝜇𝑙de solución de fibrinógeno (2 mg/ml en 10 mM Tris-HCL), a ph fisiológico
(7,4), conteniendo 10 mM de CaCl2 a 37 ºC. El índice de coagulación (CI), se obtendrá
de la ecuación CI=𝑙−1 x 1000, donde 𝑙−1 es la inversa del tiempo y donde una unidad
de actividad Coagulación-Fibrinógeno, será definida como la cantidad de enzima capaz
de coagular la solución de Fibrinógeno en 1 minuto.

● Actividad amidolítica
Se determinará, empleando el método de Erlanger 1961, utilizando el sustrato
cromogénico Benzoil-Arginil-p-nitroanilida (BApNA) midiéndose la liberación de p-
Nitroanilina por espectrofotometría. La mezcla de reacción contendrá 1,5mL de
BApNA a una concentración de 9x10-4 M; 0,5mL de buffer Tris-HCl 0,05M pH 8,1 y
50 μL de la muestra. Luego se incubará por 15 minutos a 37 °C se adicionará 1mL de
ácido acético al 60 % para detener la reacción y cuantificar la p-Nitroanilina por su
absorbancia a 405 nm.

● pH óptimo y efecto térmico

El pH óptimo será determinado, siguiendo la metodología de Ruíz, 2017, empleando
un buffer acetato de sodio 0,2 M en rango de 4,0 a 6,0; buffer fosfato de sodio 0,2 M
pH 6,0 - 7,0 y buffer Tris HCl 0,2M pH 8,0 - 10,0. Se medirá la actividad sobre BApNA
empleando 25μL de la enzima purificada. En cuanto al tratamiento térmico, alícuotas
de 30 μL de la enzima serán sometidas a calentamiento por 15 minutos a temperaturas
de 37, 40, 50, 60, 70, 80 y 90 °C. Luego serán enfriados rápidamente, colocándolos en
hielo para inmediatamente después, medir la actividad sobre BApNA.

● Efecto de iones metálicos e inhibidores

 Siguiendo la metodología de Ruíz, 2017. Se prepararán preincubados de la enzima con
los iones calcio, magnesio, sodio, potasio y manganeso bajo la forma de cloruros a
concentraciones finales de 5 y 10 mM. El mismo tratamiento se empleará, para ensayar
los agentes: Fenil-metil sulfonil fluoruro (PMSF), Tosil lisil clorometil cetona (TLCK),
Ácido Etilendiaminotetraacético (EDTA), iodoacetato e inhibidor de tripsina de soya,
registrándose las actividades enzimáticas luego de estos tratamientos.

● Actividad Defibrin(ogen)ante
Se determinará, siguiendo el protocolo del Manual del Instituto Clodomiro Picado,
2007, usando ratones albinos de la cepa Balb c obtenidos del Instituto Nacional de Salud
(INS - Perú). La dosis defibrinogenante mínima (DDM) corresponde a la menor
cantidad de veneno que produce incoagulabilidad total de la sangre en el lote
correspondiente de ratones inyectados.

2. METODOLOGÍA DE EFECTO DEL VENENO DE SERPIENTE SOBRE

ESTRUCTURAS ANATÓMICAS DE PEZ CEBRA
Método para la obtención de larvas de pez cebra
Se compraron adultos y larvas de pez cebra de tipo salvaje (Danio rerio) con
procedimientos modelo, mediante el método de Westerfield modificado (Westerfield
1995). Las larvas se utilizaron a los 5 días después de la fertilización de peces adultos
a 28,5°C. Las larvas se colocaron en una solución de agua dulce estéril; luego, las
fracciones obtenidas por cromatografía se probaron en el modelo de pez cebra. Se
colocaron cinco larvas por pocillo a distintas concentraciones de fracción en 500 µL de
agua dulce estéril, como se indica más adelante.
Electroforesis en gel de poliacrilamida con sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE)
El soporte se construyó con una matriz discontinua de poliacrilamida formada por dos
geles de distinta densidad. Un primer gel de concentración al 4,5% y un segundo gel de
separación al 12,5%. Para la corrida se utilizó una cámara MINI-PROTEAN II (Biorad,
USA). El proceso de fraccionamiento se realizó con una corriente de 200 v. El tiempo
de corrida estimado fue de 45 min. Se utilizó un marcador de corrida de amplio y bajo
rango de pesos moleculares (Biorad, USA). La muestra y el marcador de corrida se
 diluyeron en tampón de disolución el cual contenía sodio dodecil sulfato (SDS) a una
concentración de 10%, tampón tris a pH 6,8, y glicerol. Una vez finalizada la corrida,
los geles fueron coloreados con azul de Coomassie.
Actividad proteolítica
Se empleó el método modificado por Ramírez et al. (1999), que permitió evaluar la
actividad gelatinasa de los venenos. Para esta actividad se colocaron diluciones
seriadas, partiendo de 100 µg del veneno seco de serpiente, fracción 1 con y sin
inhibidor de serino proteasas (benzamidina 10 mM) y fracción 2 con y sin inhibidor de
metaloproteasas (EDTA 10 mM), sobre la placa de rayos X Kodak OMAT. La hidrólisis
de gelatina fue determinada, por el lavado de la placa, luego de cuatro horas de
incubación a 37°C, en una cámara húmeda. Las diluciones seriadas se consideraron
positivas, hasta la última dilución de veneno capaz de producir un aclaramiento de la
placa de rayos X.
Actividad proteolítica sobre gelatina
El veneno crudo de serpiente mostró actividad proteolítica. Mientras que la fracción FI
sin inhibidor y la FI con inhibidor de benzamidina evidenciaron una mayor actividad
proteolítica. La FII con el inhibidor de EDTA no mostró actividad proteolítica

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