UNIVERSIDAD AUTNOMA DE ELECTROFORESIS DE PROTENAS

CHIRIQU EN GEL DE POLIACRILAMIDA BAJO

CONDICIONES
FACULTAD DE CIENCIAS
DESNATURALIZANTES (SDS-PAGE)
NATURALES Y EXACTAS
ESCUELA DE QUMICA Resumen
En esta experiencia de laboratorio el
objetivo principal fue aplicar la tcnica de
electroforesis bajo condiciones
desnaturalizantes con el fin de separar
INFORME DE LABORATORIO protena papana que se encuentra
presente en las plantas, las muestras
ELECTROFORESIS DE PROTENAS utilizadas para el estudio fueron hojas de
EN GEL DE POLIACRILAMIDA BAJO veranera y papaya. Las muestras fueron
CONDICIONES tratadas con el reactivo de SDS al 10%
DESNATURALIZANTES (SDS-PAGE) que es un detergente aninico que se une
a las protenas, desnaturalizndolas en
una conformacin extendida recubierta de
molculas de SDS; Por otra parte se
calcul el peso molecular de una muestra
de tejido vegetal. Se calcularon los
factores Rf de los patrones de peso
PRESENTADO POR
molecular y a su vez el Rf de la muestra y
SHARON CUBAS mediante el grfico donde se relaciona
Log10 (PM) versus Rf de los patrones se
(4-782-2072) calcul el peso molecular de muestra
tejido vegetal que fue de 53 180. Esta
tcnica se realiz por medio de un sistema
ESTEBAN ARJONA de amortiguador discontinuo, ya que nos
permiti cargar volmenes considerables
(4-779-2316) de muestra de protena diluida en los
pozos del gel sin comprometer la
resolucin de la corrida. El gel separador
se prepar a un 10%, mientras que el gel
espaciador a un 4%, la polimerizacin del
gel dio inicio con el Persulfato de amonio
al 10% y el reactivo TEMED permite
PROFESORA finalizar dicha polimerizacin. La
electroforesis es un mtodo analtico en el
Mgtra. ALBERTINA MONTENEGRO que se utiliza una corriente elctrica
controlada con la finalidad de separar
biomolculas segn su relacin tamao a
carga elctrica, usndose como base una
matriz gelatinosa.
Objetivos
Aplicar la tcnica de electroforesis en
condiciones desnaturalizantes para la
16 DE MAYO DE 2017 separacin de una protena vegetal.
Calcular el peso molecular de la muestra
de tejido vegetal.
Introduccin Materiales y reactivos
La electroforesis es una tcnica para la Cmara de electroforesis
separacin de molculas segn la Fuente de voltaje
movilidad de stas en un campo elctrico. Enfriador a 4C
La separacin puede realizarse sobre la Solucin stock monmero (Acrilamida
superficie hidratada de un soporte slido 29,2%, bisacrilamida 0,8%)
(electroforesis en papel o en acetato de Amortiguador Tris-HCl 1,5M pH 8,8
celulosa), a travs de una matriz porosa Amortiguador Tris-HCl 0,5M pH 6,8
(electroforesis en gel), o bien en Amortiguador Trisbase-glicina pH 8,3 (5X)
disolucin (electroforesis libre). Solucin stock SDS 10%
Dependiendo de la tcnica que se use, la Persulfato de amonio al 10% (recin
separacin obedece en distinta medida a preparado)
la carga elctrica de las molculas y a su TEMED
masa. Herrez (2010). Amortiguador reductor para las muestras:
La mayora de las biomolculas poseen SDS, 2-mercaptoetanol, Glicerol, Azul
una carga elctrica, cuya magnitud de bromofenol, Amortiguador pH 6,8
depende del pH del medio en el que se Fijador A (Metanol 50%, cido actico
encuentran. Como consecuencia, se 5%)
desplazan cuando se ven sometidas a un Fijador B (Metanol 50%)
campo elctrico. Cada molcula se Sensibilizador (Tiosulfato de sodio 0,02%)
desplaza por efecto del campo, Marcador (Nitrato de plata 0,1%)
alcanzando rpidamente una velocidad Revelador (Formaldehdo 0,04%,
constante al equilibrarse la fuerza carbonato de sodio 2%)
impulsora (fuerza del campo elctrico) Enjuague (cido actico 5%)
con la resistencia al avance (fuerza de Agua desionizada
friccin o rozamiento) impuesta por el
medio en el que se desplaza. Procedimiento
Las protenas son compuestos I. Preparacin de reactivos:
anfotricos, por lo tanto su carga neta est Los reactivos que prepararon para esta
determinada por el pH del medio en el que experiencia fueron:
estn suspendidas. En una solucin con -Tris-base 1.5 M, pH 8.8=18.15 g en 100
un pH por encima de su punto isoelctrico, mL
una protena tiene una carga neta -Tris-base 0.5 M, pH 6.8=6 g en 100 mL
negativa y en un campo elctrico migra El resto de los reactivos a utilizar se
hacia el nodo, mientras que migrar encontraban previamente preparados.
hacia el ctodo a pHs por debajo de su
punto isoelctrico. La carga presente en II. Obtencin y preparacin de las
una protena es independiente de su muestras de protenas.
tamao y vara de una protena a otra, por Se recolectaron hojas de papaya y
lo tanto, la separacin electrofortica de veranera, las cuales se maceraron en un
protenas bajo condiciones no mortero con 50mL de buffer 2.5x luego se
desnaturalizantes se realiza en virtud de decant su extracto en una probeta y se
su carga y tamao. Herrez (2010). registr su volumen.
En una electroforesis desnaturalizante, es Se le agreg al decantado el mismo
la que somete a las protenas a migracin volumen en acetona y se homogeniz por
asegurando la completa 5 minutos, se elimin la acetona y se
desnaturalizacin (prdida de la repite el lavado con acetona. Ahora se le
estructura tridimensional). En esta agreg igual volumen de sulfato de
situacin la migracin es proporcional a la amonio saturado se homogeniz y se
carga y al tamao de la molcula pero no transfiri a un tubo de centrfuga a
a su forma. velocidad mxima por 5 minutos.
Transcurrido ese tiempo se elimin el gel separador y se le agreg la mezcla del
sobrenadante y se suspendi los gel espaciador y se coloc el peine
precipitados en la solucin buffer muestra. evitando dejar burbujas de aire e
La muestra fue tratada con el SDS al 10% igualmente se dej polimerizar por 35
y se procedi a calentar para facilitar la minutos.
desnaturalizacin.

Figura 2. Soporte para gel cargado del gel

Figura 1. Calentamiento de las muestras tras Acrilamida/Bis 30%, al 10% con 4mm de
adicionarle SDS para provocar la butanol saturado en agua.
desnaturalizacin de la protena.

III. Preparacin de los geles:

Se prepararon los geles como se muestra
a continuacin:

-Gel separador al 10%= se mezcl 2.85

mL agua destilada, 1.75 mL de Tris-base
1.5 M, pH 8.8, 70 L SDS 10%, 2.3 mL
de Acrilamida/Bis 30%, 30 L TEMED, 50
L Persulfato de amonio 10% (preparado
el mismo da).

-Gel espaciador al 4%= se mezcl 2.9 Figura 3. Polimerizacin del gel Acrilamida/Bis
mL de agua destilada, 1.4 mL Tris- 30%, al 4%. Aplicacin del peine.
base 0.5 M, pH 6.8, 50 L SDS 10%, 670
L Acrilamida/Bis 30%, 30 L TEMED, 50
L Persulfato de amonio 10%.

En las mezclas anteriores se agreg de

ltimo el Persulfato de amonio al 10%, ya
que este reactivo es que va a dar inicia a
la polimerizacin de los geles. Por lo que
primero se prepar el gel separador e
inmediatamente se le aplic al soporte
para preparar geles con adicin de una
capa de 4mm de butanol saturado con
agua destilada y se dej polimerizar
durante 35 minutos. Transcurrido ese Figura 4. Polimerizacin total del gel,
tiempo se elimin la capa de butanol del separacin de pocillos para las muestras.
IV. Condiciones para la corrida. V. Proceso de revelado.
Se puede cargar un mximo de 20 Este proceso const de cuatro partes:
microgramos (20 g) de protena por -Sacar el gel de la cmara y con mucho
pozo, para obtener una resolucin ptima cuidado pasarlo a una recipiente con 50
de las bandas. En este caso cargamos los Ml de solucin fijadora de metanol al 50%
pozos con 5, 10, 15 L de muestra de la en agua destilada. Agitar suavemente por
protena y se le adicionaron a cada pozo 30 minutos.
10 L de glicerol y 10 L de azul de -Decantar la solucin fijadora y agregar 50
bromofenol. ml de solucin de teir que contiene azul
coomassie al 0.1%, disuelto en metanol al
40% y cido actico al 10%. Agitar
suavemente durante 30 minutos.
-Desteir mediante dos lavados con
solucin de metanol al 40%, c. actico al
10%. 30 minutos de agitacin por cada
lavado.
-Efectuar un ltimo lavado con etanol 50%
durante 20 minutos.

VI. Proceso de secado.

En este paso se coloca el gel entre dos
capas de papel celofn previamente
sumergido en agua por 15 minutos,
utilizando como soporte un vidrio
cuadrado grueso. Procurando que no
queden burbujas de aire dentro del papel
plstico, porque pueden daar el gel.
Luego se fija los extremos del papel
Figura 5. Cargado de las muestras en los celofn con prensas y dejar el vidrio
pocillos correspondientes (superior). Gua
inclinado para que escurra el agua,
para aplicacin de muestras (inferior).
durante 24 horas. Despus de las 24
El voltaje mximo recomendado para una horas, retire las prensas y recorte el
corrida sin el problema de distorsin de exceso de papel celofn.
bandas por efecto del calor es de 200 v.
La corrida completa dura de 40 a 50 VII. Clculo del peso molecular de la
minutos. muestra de tejido vegetal.
Tras el revelado del gel se procede a
determinar los valores de los Rf de los
patrones de los cuales se conoce su peso
molecular. El Rf se determin mediante la
ecuacin:

=

De igual forma se realiz el calcul del Rf
de la muestra. Se construy una grfica
de Rf versus peso molecular (Log [PM]).
Luego para encontrar el valor del peso
molecular de la muestra se interpola, por
medio de la ecuacin de la recta dada por
la grfica de los patrones, el valor de Rf
Figura 6. Corrida de las muestras.
de la muestra.
 3
24 000 4.380211242
Tripsinogeno
4
34 700 4.540329475
Pepsina
5
Albmina de 45 000
huevo 4.653212514
6
Albmina 66 000
bobina 4.819543936

Figura 7. Revelado del gel (superior). Peso

molecular de los patrones. Figura 8. Grfica del factor Rf de los patrones
versus el Log del peso molecular de los
Resultados y discusin: mismos.
Cuadro 1. Determinacin de los Rf de los
patrones. Cuadro 3. Determinacin del Rf y peso
Dista. molecular de la muestra de tejido vegetal.
Dista. banda Muestra Tejido vegetal
Patrn Rf
ABF de Distancia
patrn 11.6 cm
Azul de Bromofenol
1 11.6 Distancia
10.2 cm 0.88 4.1 cm
Lisozima cm Banda de muestra
2 11.6 Factor Rf 0.35
8.9 cm 0.77
Lactoglobulina cm Log (PM) 4.72574836
3 11.6 Peso molecular
7.8 cm 0.67 53 180
Tripsinogeno cm (inverso de Log)
4 11.6
6.0 cm 0.52
Pepsina cm
5
11.6
Albmina de 4.9 cm 0.42
cm
huevo
6
11.6
Albmina 3.1 cm 0.27
cm
bobina
Nota: ABF (azul de bromofenol).

Cuadro 2. Peso molecular de los patrones.

Peso
Patrn Log (PM)
molecular
1
14 300 4.155336037
Lisozima Figura 9. Grfica de interpolacin del valor del
2 peso molecular de la muestra de tejido
18 400 4.264817823
Lactoglobulina vegetal.
En este laboratorio aplicamos la Al momento de cargar las muestras como
separacin de la protena vegetal papana se muestra en la figura 5, el gel
por medio de un mtodo analtico en el espaciador que se encuentra a 4% de pH
que se utiliza una corriente elctrica 6.8, va acondicionando y concentrando
controlada utilizando como matriz geles las muestras para que no haya un cambio
de poliacrilamida en un sistema brusco en las condiciones en las que se
discontinuo, (Herrez, 2012) explica que encuentran las muestras, de esta manera
para mejorar la resolucin (obteniendo facilita la separacin de las protenas
bandas ms compactas) se suele emplear cuando se encuentren el ambiente del gel
electroforesis discontinua, en la cual la separador al 10% de pH 8.8.
parte superior, hay un gel acumulador o
concentrador que tiene como efecto De acuerdo con (Lomonte, 2005), Los
concentrar la muestra en una banda lmites prcticos de pH para realizar
estrecha y ocupando la mayor parte de la PAGE (por sus siglas en ingls
placa, un gel separador en el que tiene "polyacrylamide gel electrophoresis")
lugar la separacin de los componentes. estn entre pH 3 y 10, ya que algunas
reacciones hidrolticas (como
La modalidad en la cual se llev a cabo desaminacin) ocurren a pH extremos. La
fue en presencia del detergente eleccin del pH para PAGE depende de
duodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE), ya dos consideraciones opuestas, a pH
que mediante el uso de este detergente cercanos al punto isoelctrico de las
nos permite cargar negativamente la protenas a separar, la diferencia de carga
protena. Para que esto ocurra la muestra entre ellas es grande, aumentando la
se trata con SDS (a mayor concentracin posibilidad de separacin, sin embargo, al
que en la composicin del gel) y se ser pequea la carga, los tiempos de
calienta brevemente a 90-100C, para corrido son largos, llevando a un aumento
provocar la desnaturalizacin (figura 1). en el ensanchamiento de banda. En SDS-
Se aade tambin -mercaptoetanol para PAGE los complejos polipptido-SDS
reducir los puentes disulfuro, separando estn negativamente cargados en un
as las subunidades de la protena y rango amplio de pH, por lo tanto el pH no
permitiendo que se extiendan por efecto es crtico.
del SDS, como se muestra en la figura 10.
Por otra parte, los geles de poliacrilamida
constituyen un excelente medio de
soporte para separaciones
electroforticas, dado que renen una
serie de propiedades idneas:
transparencia, elasticidad, porosidad
controlable y compatibilidad con una gran
variedad de compuestos qumicos,
explica (Monts, 2015). La poliacrilamida
se forma por copolimerizacin de dos
compuestos, la acrilamida y la bis-
acrilamida, en una reaccin iniciada por la
tetrametiletilndiamina (TEMED) y el
persulfato de amonio. El radical persulfato
activa al TEMED, el cual a su vez activa al
monmero de acrilamida para que
polimerice. Las cadenas de poliacrilamida
Figura 10. Efecto del dodecilsulfato sdico. son entrecruzadas al azar por la
Tomado de http://biomodel.uah.es bisacrilamida, formndose as una red de
porosidad bastante uniforme, que puede presente la molcula su movilidad
ser regulada variando las condiciones de electrofortica ser menor y viceversa. La
la reaccin y las concentraciones de los distancia arbitraria ser la distancia que
monmeros. (Montes, 2015). recorre el colorante que es el azul de
Esta red de porosidad es en la cual se bromofenol.
desplazarn las molculas de las
muestras, por lo que las que tenga mayor Como la movilidad electrofortica relativa
peso molecular o sea de mayor tamao (Rf) es inversamente proporcional al
recorrern una menor distancia que logaritmo del PM. Trazando un grfico con
aquellas que poseen bajo peso molecular estndares de PM conocido, se obtiene
como se evidencia en la figura 7, el patrn una lnea de referencia en la cual se
de lisozima es el que avanza ms en el puede interpolar muestras de PM
gel porque tiene menor peso molecular desconocido, (Lomonte, 2005). El cuadro
(PM=14,300). 3 presenta los valores obtenidos de
La modalidad SDS-PAGE nos deducir muestra de tejido vegetal; el Rf de la
permite deducir el peso de la molcula o muestra fue de 0.35 ya que la distancia
molculas en estudio, ya que la recorrida fue de 4.1 cm, por lo que
determinacin del peso molecular de despejando x de la ecuacin de la recta e
protenas mediante SDS-PAGE es vlida interpolando este dato en la grfica se
cuando se analizan cadenas proteicas obtiene el logaritmo correspondiente para
individuales (subunidades), en donde se la muestra desconocida, y determinado el
han reducido todos los enlaces disulfuro y inverso del logaritmo obtuvimos el valor
por ende, se ha distendido toda la cadena del peso molecular de dicha muestra que
proteica para su interaccin con el SDS. fue de 53 180.
Bajo estas condiciones, la migracin de
las molculas obedece Conclusiones:
fundamentalmente a su peso molecular.
Inferimos que la tcnica de
La figura 7 que se presenta en la parte de electroforesis es de gran importancia,
los resultados no representa la corrida de ya que por medio de la migracin de
las muestras de veranera y papaya, solutos inicos bajo la influencia de un
debido a que no se contaba con los campo elctrico se nos permite la
patrones necesarios, sin embargo la separacin de mezclas complejas de
figura 7 es un ejemplo que aplica para cidos nucleicos, protenas y otras
poder demostrar que se puede calcular el biomolculas, donde aporta un
peso molecular de una muestra de tejido potente criterio de pureza, como
vegetal. El cuadro 1 se presenta el tambin es til adems para
resultado del clculo del Rf (movilidad determinar otros parmetros como
relativa) de cada uno de los patrones, el peso molecular, punto isoelctrico y
Rf se calcula dividiendo la distancia (cm) nmero de cadenas polipeptdicas de
recorrida por la banda en cuestin, entre las protenas.
la distancia recorrida por el colorante azul Por medio de la determinacin de la
de bromofenol (u otro punto de referencia movilidad electrofortica, que es la
arbitrario). Posteriormente se presenta el distancia que migracin de un ion, se
valor del logaritmo del peso molecular pudo determinar el valor del peso
correspondiente a cada patrn (cuadro 2). molecular que presentaba una
La figura 8 muestra la grfica de los muestra desconocida de tejido
valores anteriormente calculados como vegetal.
vemos la relacin del Rf versus el Log Concluimos que la tcnica de SDS-
(PM) es inversamente proporcional lo que PAGE posee un alto poder de
sugiere que a mayor peso molecular resolucin, debido al uso de un
 sistema electrofortico discontinuo, mol/L en sistemas fuertemente cidos,
formado de dos geles de distinta pues a bajos valores de pH muchos
porosidad y pH, que primero cidos dbiles (que son los ms
compactan las muestras (en el gel empleados) estn dbilmente ionizados y
superior o concentrador) y luego las es necesaria una alta concentracin para
separan (en el gel inferior o separador, obtener la adecuada capacidad
permite obtener resultados con mejor amortiguadora.
definicin en las bandas. En condiciones no desnaturalizantes
afectar en menor medida la fuerza inica
Bibliografa del amortiguador debido a que la protena
-Herrez, A. (2010). Electroforesis de se encuentra o se desea que este
protenas y cidos nucleicos [Biomodel]. precipitada, ya que en es condiciones
Recuperado el 14 de mayo de 2017 de desnaturalizantes, por otro lado en
http://biomodel.uah.es/tecnicas/elfo/inicio condiciones no desnaturalizantes las
.htm# protenas se les somete a una migracin
sin desnaturalizacin, por lo que se
-Lomonte, B. (2005). Electroforesis en gel requiere que a lo largo del proceso no se
de poliacrilamida. Recuperado el 14 de vea afectada la estructura de la protena
mayo de 2017 de lo que con lleva a que a utilizar
http://www.ciens.ucv.ve:8080/generador/ amortiguadores de baja fuerza inica ya
sites/lab-bioq-gen/archivos/Lomonte%20- que siendo menos conductores llevan la
%20Cap13%20PAGE.pdf produccin de calor a un mnimo, evitando
-Monts, S. (2015). Electroforesis en la desnaturalizacin de la protena.
geles de poliacrilamida: Fundamentos e
importancia. Recuperado el 14 de mayo 2. Por qu para asegurar la unin
de 2017 de estequiomtricas del SDS a las
http://www.bvs.sld.cu/revistas/uni/vol1_2 protenas es necesario reducir sus
_00/uni07200.htm puentes disulfuro tratndose con 2-
mercaptoetanol?
Cuestionario: R: La muestra se trata con SDS (a mayor
concentracin que en la composicin del
1. En electroforesis suelen preferirse los gel), para provocar la desnaturalizacin y
amortiguadores de baja fuerza inica, es necesario aadir tambin -
ya que siendo menos conductores mercaptoetanol para reducir los puentes
llevan la produccin de calor a un disulfuro, separando as las subunidades
mnimo, esto es deseable ya que el de la protena y permitiendo que se
calentamiento suele distorsionar las extiendan por efecto del SDS.
bandas; sin embargo, la fuerza inica
no debe ser tan baja que precipiten las 3. La cuantificacin de las bandas suele
protenas. Afectar la fuerza inica realizarse densitomtricamente. En
del amortiguador la separacin en qu consiste el mtodo?
condiciones desnaturalizantes y en R: Es un mtodo en el cual se determina
condiciones no desnaturalizantes? el factor de retardo de las muestras en
R: La fuerza inica del sistema tampn estudio y el peso molecular. Se utiliza
debe mantenerse a un nivel adecuado peso moleculares conocidos de patrones
para garantizar la solubilidad de la y se realiza curvas patrones de los
muestra y suficiente capacidad diferentes patrones y se determina la
amortiguadora. Es usual utilizar concentracin de las muestras.
concentraciones de tampn en un rango
entre 0,025 y 0,1 mol/L, pero pueden
emplearse concentraciones sobre 0,5