INTRODUCCIÓN

La diferencia de los organismos gran positivos y negativos nos presentan el desarrollo de la

amplia diversidad de arqueas y bacterias que realizan funciones físico-químicas dependiendo
del sustrato para producir metano. Además de identificarlas según su membrana y pared celular
(Capa S) gracias a la técnica de Coloración Gram.
OBJETIVOS
Objetivo general

 Identificar los principales organismos microbianas de la etapa metanogénesis mediante la técnica

de Coloración o Tinción de Gram

Objetivos especifico.

 Identificar organismos metanógenos del dominio Archaea, que perduraron al término de la

experiencia
 Determinar la presencia de las arqueas y bacterias Gram negativos como Gram
positivos, dependiendo del sustrato (restos agrícolas), que utilizan para su metabolismo.
MARCO TEÓRICO
Generalidades de la Coloración

Las células bacterianas o arqueas presentan una naturaleza química, que proporciona una afinidad por los
colorantes; esta propiedad ha sido aprovechada para estudiar los diferentes tipos morfológicos y estructuras,
esto permite la identificación de una especie o grupo en particular. Los colorantes de mayor aplicación son:
cristal violeta, violeta de genciana, safranina, etc. Actúan mejor mediante la adición de mordientes, porque
aumentan la permeabilidad de la pared celular y membrana citoplasmática.

Tinción de Gram o coloración Gram:

Es un tipo de tinción diferencial empleado en microbiología para la visualización de bacterias, que
desarrolló la técnica para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una
primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias
que se visualizan de color violeta y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa.
Utilidad de la coloración Gram
Se usa para diferenciar las características de la bacteria aplicando el colorante (es un color violeta casi
azul), entonces esas son Gram +. Hay otras bacterias que no tienen casi pared celular (es muy pobre), y en
virtud de eso, no retienen el colorante presentando un color rosado o rojizo, entonces esas son Gram
negativa.

Organismos metanógénos
Las arqueobacterias metanogénicas pueden utilizar sólo un número restringido de sustratos,
principalmente acetato, hidrógeno y dióxido de carbono. Pueden clasificarse, según el substrato
que utilizan en dos grupos: hidrogenofílicas y acetoclásticas (Ruiz, 2002).
Las metanógenicas hidrogenofílicas como Methano bacterium, Methanococcus y Methanobrevi
bacter; utilizan el hidrógeno y el dióxido de carbono, permitiendo disminuir la presión parcial de
hidrógeno, y producen aproximadamente un 30% del metano, (Ferry, 1992)
Las acetoclásticas producen el 70 % restante a partir de acetato. Se encuentran reagrupadas en
sólo 9 especies y los géneros Methanosaeta (Methanotrix) y Methanosarcina, son los más
frecuentemente encontrados en un digestor. Por lo general, los dos géneros compiten por el
sustrato (Ruiz, 2002).
Methanobacterium
Es un género dentro de la familia Methanobacteriaceae, perteneciente al dominio Archaea. Las
células no son móviles, y sus membranas celulares faltan el biopolímero peptidoglucano. Algunos
miembros de este género se puede utilizar formiato para producir metano; otros se basan
únicamente en la reducción de dióxido de carbono con hidrógeno.
Methanococcus (maripaludis)
Esta especie de arquea metanógena, es anaeróbico, débilmente móviles, no formadoras de esporas
y Gram-negativos.
Methanobacillus
Es una especie de arqueas en forma de bastón y Gram - negativas. Son anaeróbicos facultativos.
Methanosaeta (concilii)
Es una especie de arquea en el género disputado Methanosaeta. Es anaerobio estricto, Gram-
negativo, y no móvil.
Methanosarcina(barkeri)
Es la especie más fundamental del género Methanosarcina , y sus propiedades se aplican
generalmente al género Methanosarcina . Puede producir metano anaeróbicamente a través de
diferentes vías metabólicas; puede incluir una variedad de moléculas para la producción
de ATP , incluidos metanol , acetato , metilaminas y diferentes formas de hidrógeno y dióxido
de carbono.
Membranas de las Archeae

Los lípidos presentes en las membranas son únicos desde el punto de vista químico, a diferencia
de los eucariotas y las bacterias, en que los enlaces éster son los responsables de la unión entre
los ácidos grasos y glicerol, los lípidos de las Archaea poseen enlaces ÉTER para la unión del
glicerol con cadenas laterales hidrofóbicas. En lugar de acidos grasos poseen cadenas laterales
formadas por unidades repetitivas de una molécula hidrocarbonada como el isopreno.

Los principales tipos de lípidos son los diéteres de glicerol. En algunos éteres las cadenas
laterales (fentanil) se unen entre sí por enlaces covalentes formando una monocapa en lugar de
la bicapa característica de las membranas, siendo más estables y resistentes.

Paredes celulares

Algunas arqueobacterias metanogénicas poseen la pared celular formada por un compuesto

similar al peptidoglucano de las bacterias, por lo que denomina pseudopeptidoglucano, con
enlaces glucosídicos 1,3 en lugar de los 1,4 de los peptidoglucano. En otras archaeas la pared se
compone de polisacáridos, glicoproteínas o proteínas.

El tipo de pared más común es la capa superficial paracristalina (capa S) formada por proteína o
glucoproteína, de simetría hexagonal. A diferencia de las bacterias, la mayoría de arqueas
carecen de peptidoglucano en la pared celular

Carecen de petidoglucano

Pared compuesta de
glucoproteinas, proteinas o Gram positivas
polisacardios

La mas comun en las aqueas es

la llamda Capa S compeusta d
eproteionas o glucoprtienas

Gram negativas
METODOLÓGICA Y MATERIALES
Materiales:
Cuadro N° 1: Instrumentos del laboratorio

MATERIAL UTILIDAD IMAGEN

Es un utensilio metálico que

permite calentar sustancias,
MECHERO DE BUNSEN proporciona una llama
caliente.

Pieza o lámina rectangular

de cristal en que se coloca el
PORTA OBJETOS objeto o preparación que va
a ser observado en el
microscopio.
Es un instrumento que
permite observar objetos
MICROSCOPIO que son demasiados
pequeños para ser vistos a
simple vista.
Es un material que nos
ayuda para poder realizar las
siembras adecuadamente,
ASA DE SIEMBRA
tiene una punta de alambre
que cuando lo calentamos
estamos descontaminando.

Elaboración propia
Reactivos
Cuadro N° 2: Reactivos a usar en la experiencia
REACTIVO FUNCIÓN IMAGEN
Es el primer colorante que se echa
sobre la porta objetos
CRISTAL VIOLETA O previamente preparado. Es un
AZUL VIOLETA colorante selectivo que tiñe a
todos los microorganismos
cargados negativamente
Producto compuesto de yodo y
yoduro potásico. Es un mordiente,
que intensifica al Cristal Violeta
haciendo que precipite. Fija las
LUGOL
tinciones y aumenta la afinidad
entre el colorante y las células. Los
mordientes empleados suelen ser
sales metálicas, ácidos o bases.
El alcohol retira el colorante de las
Gram (-) debido a su diferente
estructura de la pared celular
ALCOHOL ACETONA (tamaño de los poros). A veces se
usa otro agente decolorante o
disolvente orgánico como alcohol-
acetona (1:1).
Colorante básico diferenciador.
Tiñe los organismos Gram (-).
Siempre se añade ésta
contratinción con fucsina o eosina
para teñir las bacterias
SAFRANINA decoloradas de color rojo y
hacerlas más visibles. Se
denominan Gram positivas a
aquellas que retienen la tinción
azul y bacterias Gram negativas a
las que quedan decoloradas.
Elaboración propia
PROCEDIMIENTO

1. Desinfectamos el área de trabajo con alcohol y algodón.

2. Esterilizamos los materiales (aza de siembra) con ayuda del mechero.

3. Sacamos una pequeña porción de muestra con el aza de la botella, después la colocamos
en el portaobjetos y lo pasamos sobre el mechero para evaporar el agua.

4. Luego de ello cubrimos con colorante (cristal violeta) la preparación, dejándola actuar en
un periodo de un minuto.

5. Lavamos cuidadosamente con agua destilada (eliminación del exceso de colorante).

6. Se cubre la preparación con colorante (lugol) por un minuto, con el objetivo de aumentar
la afinidad entre el colorante y las células.
7. Utilizamos el agente decolorante (alcohol – acetona) lavando con sumo cuidado dicha
preparación dejando actuar por un minuto.

8. En seguida echamos colorante de contraste (safarina) reposando 1 minuto, para después

lavarlos con agua destilada cuidadosamente. Las bacterias Gram positivas se teñirán de
color azul y las Gram negativas color rosa debido a este colorante.

9. Finalmente lo observamos en el microscopio con el objetivo de inmersión (100X).

RESULTADOS
Realizado la observación en el microscopio, determinamos la presencia de organismos
metanógenos,

 Methanobacterium
 Methanosaeta
(concilii)
 Methanococcus
(maripaludis)
 Methanococcus

Figura. Arqueas Gram negativas. Microscopía óptica en objetivo 100, en la etapa de metanogénesis.,

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

 Las imágenes nos permiten determinar que la presencia de microrganismos del dominio
Arqueas, Esto lo comprobamos con el color rojo o rosado de los organismos en el
portaobjetos.
 No se observó presencia de organismos Gram positivos, ningún organismo en el
portaobjeto se tiño con el cristal violeta.

CONCLUSIONES
 Las arqueas son las que perduraron durante la etapa de la metanogénesis del proceso de
fermentación, ya que las mayorías de las arqueas metanógenas no presentan
peptidoglucano en su pared celular.
 Las arqueas Gram negativas presentan como pared celular la capa S
(pseudopeptidoglucano,) se une a la membrana externa, mientras que las bacterias Gram
positivas lo hace al peptidoglucano, por lo que en las arqueas cumplen la función de pared
celular.
  Se determina que los Gram positivos no se desarrollaron metabólicamente ni
reprodujeron, ya que la hemicelulosa y celulosa como sustrato, no son la fuente para sus
funcione fisicoquímicas de las bacterias u otras arqueas.

RECOMENDACIONES

 Realizar una toma de muestra en cada etapa del proceso de fermentación para determinar
en el consorcio microbiano los organismos que hay (bacterias, arqueas, hongos, etc.) y
así determinar mejor la presencia de Gram positivos o Gram negativos.