4.manual Micro-Alim-2015 PDF

Instituto Tecnológico de Oaxaca
Manual de Prácticas de Microbiología de Alimentos
Manual de
Prácticas de
Microbiología
de Alimentos
INSTITUTO TECNOLÓGICO DE OAXACA
1
CONTENIDO
Normas Y Sugerencias Para Trabajar En El Laboratorio De Microbiología................. 3
Práctica 1: Identificación Y Uso Del Equipo, Materiales Y Reactivos Del Laboratorio
De Microbiologia De Alimentos ...................................................................................... 5
Práctica 2: Preparación Y Esterilización De Medios De Cultivo ................................. 18
Práctica 3: Cuenta De Bacterias Mesofilas Áerobias En Placa .................................. 23
Práctica 4: Cuenta De Mohos Y Levaduras De Alimentos ......................................... 30
Práctica 5: Tinción Simple Y Modelo Clásico De Tinción Diferencial (Tinción De
Gram), Y Observación De Los Microorganismos Al Microscopio .............................. 33
Práctica 6: Recuento De Coliformes Por La Técnica Del Número Más Probable
(Nmp) .............................................................................................................................. 36
Práctica 7: Determinacion De Salmonella En Alimentos ........................................... 42
Práctica 8: Recuento De Staphylococcus Aureus ....................................................... 45
Referencias .................................................................................................................... 49
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NORMAS Y SUGERENCIAS PARA TRABAJAR EN EL LABORATORIO DE

MICROBIOLOGÍA
1. El uso de la bata de laboratorio es indispensable para asistir a la práctica.

2. No se debe comer, fumar, ni beber en el laboratorio.
3. Mantenga las mesas de trabajo libre de todo lo que no sea esencial.
4. Limpiar y desinfectar la superficie de las mesas antes y después del trabajo del día.
5. Lave sus manos con agua y jabón antes y después de cada práctica. Luego asegure
de frotarse las manos con alcohol.
6. Llevar registro de sus análisis indicando: Tipo de muestra, procedencia, fecha, tipo
de siembra o método, cultivos empleados y resultados obtenidos.
7. Identificar las muestras antes de comenzar el análisis, no desechar la muestra hasta
obtener el resultado (contra muestra).
8. El material a examinar debe manipularse exclusivamente con instrumentos estériles.
9. En caso de derramar un cultivo sobre la mesa o el piso o cualquier accidente como
cortadura, quemaduras, caída del material infectado en la conjuntiva ocular, ruptura
de una lámina montada al microscopio de aviso inmediato al profesor o monitor.
Tome todas las precauciones posibles para evitar estos accidentes.
10. Cuando tenga el asa bacteriológica cargada con algún cultivo de microorganismos
no se desplace de un área a otra ya que puede crear aerosoles, trabaje solo en el
área estéril.
11. Flamee el asa antes y después de usarla.
12. Descarte todo el material usado en recipientes destinados para tal fin; por ningún
motivo en los desagües o lavatorios.
13. Tenga cuidado con las preparaciones teñidas ya que puede salpicar colorantes a
mesas y pisos.
14. Al final de la práctica dejar el lugar limpio y ordenado.
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Sugerencias para el trabajo en el laboratorio
1. Es muy importante la asistencia a la práctica a la hora indicada, ya que las

explicaciones se darán en los primeros minutos.
2. Antes de comenzar la práctica, lea el manual de laboratorio. Esto le ayudará a
entender mejor y a realizar un ordenado y eficiente trabajo de laboratorio.
3. Anote todos los resultados y las explicaciones pertinentes.
4. Cada sesión de laboratorio deberá iniciarse con una corta explicación. No empiece
a trabajar hasta que haya recibido todas las instrucciones. La buena técnica de
laboratorio depende primordialmente de que se sepa lo que se va a hacer.
5. Los instrumentos de laboratorio son muy delicados. Tenga mucho cuidado al
manejarlos. Cualquier pequeño descuido puede ocasionar una pérdida irreparable.
El material entregado para la práctica debe ser devuelto antes de abandonar el laboratorio.
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PRÁCTICA 1: IDENTIFICACIÓN Y USO DEL EQUIPO, MATERIALES Y

REACTIVOS DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS
Introducción
La microbiología es una ciencia muy interesante y fascinante. Para su estudio y comprensión

es necesario efectuar algunas determinaciones prácticas por lo cual es necesario el
conocimiento y manejo de algunos materiales e instrumentos de uso común.
Por esa razón en este material bibliográfico se hizo un apartado al inicio para presentar el
nombre, uso y clasificación de algunos materiales que se usan con mucha frecuencia en
esta ciencia.
El material utilizado en un laboratorio de Microbiología es muy variado y depende

fundamentalmente de las líneas de trabajo a las que está dedicado.
Evidentemente, no se precisa el mismo equipamiento en un centro de investigación con un

alto grado de especialización que en un laboratorio de Bacteriología.
El tipo de material usado en el laboratorio de microbiología más común es el siguiente:
Material de vidrio o plástico: que se usa para contener o medir: aquí se incluyen tubos de
ensayo, vasos de precipitado, matraces, embudos, probetas, pipetas, dosificadores, etc.,
todo ello de distintos tamaños y capacidades.
También incluimos las placas de Petri, los portaobjetos y cubreobjetos, cámaras de recuento,
cestillos y cubetas para efectuar tinciones, jarras para incubar en anaerobiosis, etc.
Material de siembra: constituido principalmente por asas, filamentos de platino y pipetas
estériles.
Material para toma de muestras e inoculaciones: escobillones estériles, tubos y frascos
estériles, jeringas, agujas y material de disección.
Por tanto, aquí sólo nos referiremos al material básico que se suele encontrar en un
laboratorio mínimamente dotado.
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Objetivo
El alumno identificará y explicará el uso de los reactivos, materiales y equipos que se utilizan
en las prácticas de la materia de Microbiología de Alimentos.
Procedimiento
Descripción de reactivos y medios de cultivo
Nombre Uso Imagen
Medio utilizado para

propósitos generales,
favorece el desarrollo y
aislamiento de una gran
Peptona de Soya variedad de
microorganismos aerobios,
y anaerobios facultativos y
estrictos.
El Agar Papa y Dextrosa es

conocido como PDA por
Agar Papa y Dextrosa sus siglas en inglés. Tiene
la infusión de papa como
fuente de almidones y la
dextrosa como la base para
el crecimiento de hongos y
levaduras.
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El Agar Métodos Estándar

es un medio utilizado para
Agar Cuenta Estándar el recuento de bacterias
aeróbicas a partir de agua,
aguas residuales, alimentos
y productos lácteos.
Medio recomendado para

detección y recuento de
coliformes en aguas, aguas
residuales y alimentos.
Es un medio selectivo ya
Caldo Lauril Sulfato de que el lauril sulfato de sodio
Sodio inhibe el desarrollo de la
flora acompañante.
Se recomienda como
prueba presuntiva para
investigar la presencia de
bacterias del grupo
coliforme en agua, y
alimentos.
Actualmente también está
Caldo Lactosado indicado para el pre-
enriquecimiento no
selectivo en la búsqueda de
Salmonella spp. a partir de
alimentos.
7
Este medio está

recomendado para el
recuento de coliformes
Caldo Bilis Verde Brillante totales y fecales, por la
técnica del Número Más
Probable. En el medio de
cultivo, la peptona aporta
los nutrientes necesarios
para el adecuado desarrollo
bacteriano, la bilis y el verde
brillante son los agentes
selectivos que inhiben el
desarrollo de bacterias
Gram positivas y Gram
negativas a excepción de
coliformes, y la lactosa es el
hidrato de carbono
fermentable.
Este medio (también

denominado E.M.B.) es
utilizado para el aislamiento
Agar Eosina y Azul de selectivo de bacilos Gram
Metileno negativos de rápido
desarrollo y escasas
exigencias nutricionales.
El agar es el agente
solidificante.
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Medio de cultivo utilizado

para el aislamiento de
Salmonella spp. y de
Agar Salmonella y Shigella algunas especies de
Shigella spp. a partir de
heces, alimentos y otros
materiales en los cuales se
sospeche su presencia.
Es un medio de cultivo
selectivo y diferencial.
Medio de cultivo utilizado

para el enriquecimiento
Caldo Tetrationato selectivo de Salmonella
spp. a partir de heces,
orina, alimentos y otros
materiales de importancia
sanitaria.
Es un medio selectivo para

el aislamiento y
Agar para Estafilococos diferenciación presuntiva
de estafilococos, en base a
la producción de pigmentos,
la fermentación de manitol y
la hidrólisis de gelatina, a
partir de alimentos y otras
muestras.
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Medio de alta especificidad

diagnóstica, selectivo y
Agar Baird Parker diferencial para el
aislamiento y recuento de
estafilococos coagulasa
positiva en alimentos y
otros materiales de
importancia sanitaria.
Colorantes 1.Permite teñir el

1. Azul de metileno interior celular. Tiñen
2. Cristal violeta microorganismos
3. Safranina procarióticos (muertos o
4. Purpura de vivos).
bromocresol 2. Se utiliza para
5. Verde malaquita clasificar bacterias y
destruye a las células.
3.Se utiliza como
contraste coloreando el
núcleo celular de rojo y
tiñe de rosa a las
bacterias G
4. Se utiliza para
valoraciones de ácido-
base. Pigmenta
albuminas.
5. Se utiliza como
tinción de esporas
bacterianas y como
contratincion de
colorantes rojos.
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Descripción de material
Se utilizan para sembrar. Pueden

Asas de siembra ser metálicas o de
plástico, curvas o rectas (para la
siembra por picadura)
Se utilizan para la extensión de

Asas acodadas muestras y diluciones sobre la
superficie de un medio de cultivo
en placa Petri.
Este material existe en dos

presentaciones: Pipetas
aforadas y Pipetas volumétricas.
Pipetas Las primeras permiten medir un
volumen único y las segundas
permiten medir diversos
volúmenes según la capacidad
de esta.
Placas de Petri
Recipientes de vidrio para el
cultivo de microorganismos en un
medio sólido.
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Porta objetos Placas de vidrio para colocar las

preparaciones que se observan.
Sirven para contener y

Vasos de precipitados almacenar líquidos, así como
preparar soluciones
Son recipientes de vidrio,

esféricos, de fondo redondo o
plano, provistos de un cuello.
Matraces Sirven para contener líquidos y
preparar medios de cultivo.
Se usan para taponar tubos de

Tapones de caucho ensayo para análisis
anaeróbicos.
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Espátulas Se utilizan para transferir

muestras o medios de cultivo.
Es un utensilio que permite medir

Termómetro la temperatura que tienen
algunas sustancias.
Permite contener sustancias que

Frascos goteros se necesitan agregar en
pequeñas cantidades.
Permite guardar sustancias para

almacenarlas; los hay ámbar y
transparentes. Los de color
Frascos reactivos ámbar se utilizan para guardar
sustancias que son alteradas por
la acción de la luz del sol, los de
color transparente se utilizan
para guardar sustancias que no
son afectadas por la luz solar.
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Se usa para obtener precipitados

Tubo de centrifuga de líquidos, por medio de la
centrifugación.
Están hechos de varilla de vidrio

Agitador de vidrio y se utilizan para disolver sólidos
en disolventes líquidos.
Gradillas Se utiliza para colocar tubos de

ensaye.
Descripción de equipo
Se utiliza para facilitar el

desarrollo de microorganismos a
Estufa de incubación su temperatura óptima de su
crecimiento.
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Aparato que aplica sobre los

tubos una fuerza centrífuga lo
que permite la separación de los
Centrífuga distintos componentes de la
muestra mediante la
precipitación en el fondo del tubo
de las partículas en suspensión.
Es un aparato que mediante la

iluminación de la placa y una
Contador de colonias lupa, nos permite observar con
mayor nitidez las colonias y por
tanto facilita su recuento.
Es un aparato que permite

Balanzas pesar sustancias, con
precisión de 0.01 o 0.001 g.
Es el equipo más utilizado en él

laboratorio de microbiología.
Realiza la esterilización mediante
Autoclave calor húmedo, durante 15 ó 20
min, según el volumen, a 115°C
ó 121°C, según la naturaleza del
material que se desee esterilizar.
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El microscopio compuesto
emplea dos sistemas de lentes
separados, consiguiendo con
ellos mayores aumentos. Al ser el
microscopio compuesto un
instrumento fundamental en
microbiología, el conocer los
Microscopio principios básicos de la
microscopía y la pericia en el
empleo y la manipulación de este
instrumento, son requisitos
imprescindibles para casi
cualquier estudio en esta ciencia.
Permite observar las reacciones

de las sustancias que se
Tubo de ensaye depositan en él. Los hay de
diferentes medidas
y también sirven para preparar
cultivos de bacterias y hongos.
Potenciómetro Es un aparato que permite

pH-metro medir el pH de las sustancias.
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Se usa para secar y esterilizar

Horno el material de vidrio usado en
el laboratorio. Por calor seco.
Es un aparato que se utiliza para

Baño María desgelificar los medios de cultivo
y mantenerlos a una temperatura
constante, o como para incubar
cultivos a temperatura constante.
Es un utensilio metálico que

permite calentar sustancias.
Presentan una base, un tubo,
Mechero Fisher una chimenea, un collarín y un
vástago.
Con ayuda del collarín se regula
la entrada de aire. Para lograr
calentamientos adecuados hay
que regular la flama del mechero
a modo tal que ésta se observe
bien oxigenada (flama azul).
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PRÁCTICA 2: PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
Introducción
Los microorganismos pueden producir enfermedades cuando infectan personas, animales y

plantas y cuya gravedad oscila entre una infección débil, intoxicación e incluso la muerte.
Pueden contaminar los alimentos y producir cambios físicos y químicos en ellos, haciéndolos
en algunos casos incomibles e incluso venenosos. Los microorganismos son responsables
también de la alteración de muchos otros materiales, generando graves pérdidas
económicas. Por ello es indispensable disponer de procedimientos para controlar la
contaminación y el crecimiento microbiano. Las principales razones para controlar a los
microorganismos pueden resumirse de la siguiente forma:
• Para evitar la transmisión de las enfermedades y las infecciones.
• Para eliminar los microorganismos de un hospedero que está infectado.
• Para eliminar microorganismos de diferentes materiales y así evitar su deterioro y

alteración.
Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos es observar

su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio. El material
alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de
los microorganismos es el Cultivo. Se han preparado más de 10,000 medios de cultivo
diferentes.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir
una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presión de oxígeno
adecuada, así como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe
contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo
microorganismo contaminante.
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Fundamento
Tipos de esterilización
Calor húmedo:
El efecto que causa este calor es matar al microorganismo por la coagulación de sus proteínas
cuando se encuentran en una atmósfera húmeda y sometidos a altas temperaturas, además,
es rápido y efectivo en su acción.
La acción letal del vapor proviene del calor latente liberado cuando se condensa en una
superficie fría aumentando de esta manera la temperatura de la zona enfriada. La destrucción
de las esporas bacterianas sigue un comportamiento de forma similar en tanto que el vapor
se condensa en la pared de la espora y aumenta su contenido en agua que finalmente
hidroliza y degrada el contenido proteico.
Este calor se aplica en forma de vapor de agua y a temperaturas mayores o menores de 100ºC
combinadas con un aumento de la presión en algunos casos.
• El uso de temperaturas por debajo de 100ºC son recomendadas para tratar medios que
contienen compuestos sensibles a las altas temperaturas (evitando la desnaturalización de
los mismos). Esta práctica no asegura una esterilización pero sí una desinfección. Para una
completa esterilización de estos medios se recomienda el medio de tyndalización o
esterilización fraccionada.
• El uso de temperatura de 100ºC se logra exponiendo el medio a tratamiento con agua

hirviendo, la tyndalización o esterilización fraccionada también aplica a estas temperaturas. El
uso de las temperaturas anteriores usualmente destruye todos los microorganismos no
esporulados y la mayoría de los esporulados en 10 minutos. Esta práctica no asegura una
esterilización pero si una desinfección, por lo que no se debe confiar mucho en los métodos
anteriores.
• El uso de temperatura de 100ºC se logra con el uso de equipos especiales (Autoclave) que
combinan el efecto de la temperatura con la presión, así, a una presión a 760 mm de Hg el
agua hierve a 100ºC, pero si la presión es superior la temperatura del agua sube (Vapor de
agua), por encima de los 100ºC, por ejemplo, a 10 lb/pulg de presión la temperatura del vapor
de agua e de 105ºC y a 15 lb/pulg es de 121ºC. El uso de vapor de agua a temperaturas de
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121ºC por 15 minutos destruye todos los microorganismos incluyendo las esporas
bacterianas. Este proceso es el principio que aplica el autoclave y la olla a presión en los
laboratorios de control microbiológico.
Calor seco:
En una atmósfera seca, totalmente exenta de humedad, las bacterias como muchas proteínas
son más resistentes y no mueren hasta que tiene lugar la oxidación de sus componentes, lo
cual ocurre a temperaturas mucho más elevadas que las que se requieren para coagular las
proteínas.
Se recomienda el calor seco siempre que el vapor de agua que se emplea no sea deseable o
no sea posible que entre en contacto directo con el material que se va a esterilizar. Este tipo
de calor comprende: esterilización al rojo vivo, el flameado, aparatos que usan aire caliente y
las radiaciones infrarrojas.
• Incineración y esterilización al rojo: Métodos usados para esterilizar asa metálicas,

espátulas, destrucción de carcasas, animales de laboratorio y cualquier otro material de
laboratorio infectado que es preciso eliminar o material que sólo se usa por el momento y
constantemente. Estos métodos consisten en la exposición directa del material a la acción de
la llama hasta alcanzar una coloración roja.
• Flameado: Método utilizado para esterilizar bisturíes, agujas hipodérmicas, boca de tubos
de ensayo, porta y cubreobjetos. Consiste en pasar varias veces el objeto (de 3 a 4 veces) a
través de la llama sin permitir que este alcance el rojo.
• Aire caliente: Método usado para esterilizar material de vidrio y objetos metálicos. Se debe
envolver todo el material de laboratorio en papel, además, los tubos, matraces, pipetas y todo
material en forma cilíndrica deben ser cubiertos por un tapón de algodón en su boca. Se usan
temperaturas de 160ºC por 2 horas y es suficiente para esterilizar el material.
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Objetivo
Al término de esta práctica el alumno estará capacitado para realizar correctamente la

esterilización de material de laboratorio y la preparación de los medios de cultivo utilizados en
el análisis microbiológico de alimentos.
Reactivos Material Equipo

 Agar simple  Cajas Petri de 10 x100 mm  Olla de presión
 Agua destilada  1 Matraz Erlenmeyer de 125  Potenciómetro
 Cloruro de sodio ml
 Peptona  Mechero Fisher
 Pipetas de 1, 2,5 y 10 ml
 Probeta de 100 ml
 Vaso de precipitados de 100
ml
 Algodón
Procedimiento
 Preparación del material estéril
Pipetas con filtro
Con algodón se realizaran filtros para las pipetas se toma una pequeña porción de algodón
y se coloca en la parte superior de la pipeta. Con la aguja de disección, se empuja el algodón
hasta alcanzar un 1 cm de profundidad y se retira la aguja. La porción de algodón sobrante
en la pipeta se elimina con la flama de un cerillo.
Las pipetas serán envueltas en papel aluminio para su esterilización.
Tapones para matraz Erlenmeyer
Se toma un poco de algodón de forma rectangular. Según el diámetro de la boca del matraz
con unas pinzas, se toma el extremo del algodón y se gira la pinza hasta formar un cilindro
de algodón alrededor de la pinza.
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Cuando el grosor de éste sea aproximado al de la boca del matraz, se corta la parte restante
y con la mano se ajusta para que tome la forma adecuada.
Se corta una proporción de gasa de aproximadamente 10 x10 cm y se coloca en la boca de

matraz. Se introduce el tapón de algodón enrollado y se envuelve completamente con la
gasa. Con un hilo se ajusta la gasa alrededor del tapón y se anuda para darle una forma
definida. Finalmente, se corta el exceso de gasa e hilo.
Coloque todo el material en la autoclave a una temperatura de 121 °C, a 15 libras de presión
durante 15 minutos.
Calor seco:
Por medio de calor seco, se esterilizan pipetas enrolladas con papel aluminio y se colocan
en el interior de un pipetero de acero inoxidable.
Calor húmedo:
 Preparación de medios de cultivo
Preparar agar simple y agua de peptona para diluciones con 3% de NaCl y esterilizar a
121°C y 1.118 Kg/cm2 de presión durante 15 minutos.
En condiciones de asepsia vaciar aproximadamente 15 ml de agar simple en cada caja de

Petri de 10 x 100 mm para siembra por estría, utilizando las de 15 x 100 mm para las
pruebas de vaciado en placa. El agua de peptona para diluciones envasarla en tubos con
tapón de algodón, capucho de plástico, de aluminio, de acero inoxidable o de plástico con
rosca.
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PRÁCTICA 3: CUENTA DE BACTERIAS MESOFILAS ÁEROBIAS EN PLACA
Introducción
Generalidades
Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un

alimento, la técnica comúnmente utilizada es la cuenta en placa. Esta técnica no pretende
detectar a todos los microorganismos presentes, pero el medio de cultivo, las
condiciones de temperatura y la presencia de oxígeno, permiten seleccionar grupos
de bacterias cuya presencia es importante en diferentes alimentos; por ejemplo, las
bacterias mesofílicas aerobias, o mesófilos aerobios son un indicador general de la
población que pueden estar presente en una muestra y, por lo tanto, de la higiene
con que ha sido manejado el producto.
Este grupo en particular, se determina en la mayor parte de los alimentos, pero para
algunos productos, también es importante determinar la presencia de bacterias
termofílicas, psicrofílicas y/o psicrotróficas para predecir la estabilidad del producto
bajo diferentes condiciones de almacenamiento. La técnica básica es la misma, pero
cambian las condiciones de incubación, medios de cultivo y algunos otros detalles,
que se mencionan en la técnica. Si se modifican las condiciones de incubación o
se somete la muestra a algún tratamiento previo, el método puede aplicarse también a la
detección de otros grupos como anaerobios o esporulados, con la adecuada selección
de medios de cultivo.
El método permite numerosas fuentes de variación, algunas de ellas controlables, pero
sujetas a la influencia de diversos factores por lo que es muy importante apegarse
a la técnica y controlar cuidadosamente las condiciones.
Para la correcta aplicación de esta práctica , se deben consultar las siguientes Normas
Mexicanas:
NMX-F-285 Muestreo y transporte de muestras de alimentos para su análisis y
microbiológico.
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NMX-F-286 Preparación y dilución de muestras de alimentos para análisis

microbiológicos
La cuenta en placa es la técnica comúnmente utilizada cuando se requiere investigar el
contenido de microorganismos viables en un alimento (NOM-092-SSA1-1994).
La cuenta en placa inicia con una dilución primaria con el objeto de distribuir lo más
uniformemente posible los microorganismos contenidos en la muestra destinada para el
análisis. Posteriormente se preparan diluciones decimales adicionales para reducir el
número de microorganismos por unidad de volumen y permitir la adecuada distribución y
conteo de microorganismos en placa después de la incubación (NOM-110-SSA1-1994).
Fundamento
La técnica se basa en contar las “unidades formadoras de colonias” o UFC

presentes en un gramo o mililitro de muestra. Se considera que cada colonia que
desarrolla en el medio de cultivo de elección después de un cierto tiempo de
incubación a la temperatura adecuada, proviene de un microorganismo o de un
agregado de ellos, de la muestra bajo estudio. Ese microorganismo o
microorganismos son capaces de formar la colonia, es decir una UFC. Para que las
colonias puedan contarse de manera confiable, se hacen las diluciones decimales
necesarias de la muestra, antes de ponerla en el medio de cultivo. La técnica para
realizar este procedimiento se describe en “Preparación de la muestra y dilusiones.”
Objetivo
El alumno será capaz de llevar a cabo en forma correcta, el aislamiento y recuento de la

flora aerobia mesófila presente en muestras de alimentos, aplicando para ello uno de los
métodos más comúnmente utilizados como indicador microbiológico de calidad sanitaria.
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 Agar para recuento en  Balanza analítica  Contador de colonias
placa, agar nutritivo o  pinzas, tijeras, espátulas,  Dispositivo de registro
agar para método (todo ellos previamente automático del número
estándar esterilizado) de colonias contadas
 Agua peptonada para  Pipetas bacteriológicas de  Estufa de incubación a
disoluciones o agua de 1, 5, 10 y 11 ml 29-30 °C
peptona salina para  Placas de Petri de vidrio  Refrigerador
diluciones. (100x15 mm) o de plástico  Olla de presión
 Nota: Para cada muestra (90x15 mm)
deben esterilizarse en  Vaso homogeneizador
autoclave 9 ml en tubos
de ensaye.
Procedimiento
 Preparación del material estéril
Se preparan pipetas con filtro de 10 ml y 1.1 y se esterilizan por calor seco.
 Preparación de la muestra y diluciones
La muestra debe someterse a análisis tan pronto como sea posible, si no puede ser
estudiada inmediatamente después de su llegada al laboratorio conservarla en refrigeración
a 0-5°. Si la muestra está congelada, descongelarla en su envase original (o en el recipiente
que llego al laboratorio) durante un tiempo máximo de 18 horas en un refrigerador a 2-5°C.
Si la muestra congelada. Puede ser fácilmente triturada (como sucede con los helados), no
es necesario descongelarla.
Pesar en el vaso estéril 25 g de la muestra de alimento. Si el contenido de envase no es

homogéneo, debería tomarse una muestra de 25 g a partir del macerado de todos los
componentes o se analizarán separadamente cada uno de ellos, según la finalidad del
examen.
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Añadir al vaso del homogeneizado 225 ml de agua de peptona para diluciones o de agua
de peptona salina para diluciones. De este modo se obtiene una dilución 10-1.
Homogeneizar el alimento durante 1 min y preparar las diluciones inmediatamente. Esperar

2-3 minutos hasta que desaparezca la espuma formada. Hay que tener presente que desde
el momento en que se mezclan muestra y diluyente debe evitarse cualquier retraso
innecesario.
Medir un ml de la dilución 10-1 del homogeneizado, evitando la formación de espuma, y

pasarlo a uno de los tubos de dilución contenido 9 ml de diluyente, así se obtiene la dilución
10-2. Agitar esta dilución y las subsiguientes enérgicamente 25 veces en un arco de 30 cm
repetir esta operación utilizando las diluciones progresivamente más elevadas para
preparar las diluciones, 10-210-3, 10-4 y 10-5 o las necesarias según indique la experiencia
para el alimento que se va a analizar.
 Cuenta en placa por el método de extensión de superficie
Añadir a cada placa de Petri aproximadamente 15 ml de medio para cuenta en placa y

enfriado a 45-60°C y dejar solidificar. Secar las placas preferiblemente a 50°C durante 1.5
a 2 horas. Si las placas se preparan con antelación, no deben guardarse más de 24 horas
a temperatura ambiente o de 7 días en refrigerador a 2-5°C.
Preparar las muestras del alimento siguiendo el procedimiento indicado anteriormente, para
la preparación y dilución de los homogeneizados de los alimentos.
Tomar dos alícuotas de 0.1 ml de la dilución más elevada y depositarlas en la superficie del
medio contenido en dos placas de Petri (dos placas por dilución, sembrando en cada una
0.1 ml).
Repetir esta operación por cada dilución hasta llegar a la más concentrada utilizando
siempre la misma pipeta que se vaciara y llenara tres veces antes de transferir a cada placa
0.1 ml. Deben sembrarse por lo menos tres diluciones aún en el caso de que se conozca el
número aproximado de microorganismos presentes en la muestra de alimento.
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Extender las alícuotas de 0.1 ml sobre la superficie del medio tan pronto como sea posible,
utilizando las varillas de vidrio en forma de bastón (flamear con alcohol antes de sembrar
en cada caja).
Dejar secar las superficies de las placas durante 15 minutos e incubar las placas invertidas
durante 48 horas a 35 °C.
 Cuenta en placa por el método de vaciado
Preparar las muestras y diluciones siguiendo el procedimiento indicado anteriormente
Enfriar el medio de agar simple esterilizado. Manteniéndolo a una temperatura entre 43 a

45°C.
En condiciones de asepsia tomar alícuotas de 1 ml de la dilución más elevada y transferidas

a la superficie de una caja de Petri estéril, iniciando con la dilución menos concentrada.
Repetir esta operación por cada dilución hasta llegar a la más concentrada; utilizando
siempre la misma pipeta que se vaciará y llenara tres veces antes de transferir a cada placa
el inoculo de 1 ml. Deben sembrarse por lo menos tres diluciones aun en el caso de que se
conozca el número aproximado de microorganismos presentes en la muestra del alimento.
Añadir aproximadamente de 15 a 20 ml de agar simple fundido a temperatura no mayor de

45°C y mezclar con 6 movimientos de izquierda a derecha; 6 movimientos de arriba hacia
abajo; 6 movimientos en el sentido de las manecillas del reloj y 6 movimientos en sentido
opuesto
Esperar a que el medio solidifique e incubar inmediatamente después de las placas

invertidas durante 2 días a 35°C.
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 Cuenta en placa por el método de vaciado y recuento en placa por el método

de siembra en superficie.
 Cálculo e interpretación de resultados
Para calcular el número de gérmenes por gramo o mililitro de muestra elegir dos placas,
correspondientes a una dilución, que presentan entre 20 y 300 colonias. Contar todas las
colonias de cada placa utilizando el contador de colonias y el dispositivo de registro
automático. Hallar la media aritmética de los dos valores y multiplicarla por el factor de
dilución (la inversa de la dilución cuyas placas han sido seleccionadas). Dar el valor
obtenido como la cuenta estándar en placa.
Cuando las placas de dos diluciones consecutivas presentan entre 30 y 300 colonias, deben
hallarse los recuentos estándar en placa de cada dilución tal como se ha señalado
anteriormente y se dará como resultado la media de los dos valores obtenidos, a no ser
28
que uno de ellos sea superior al doble del otro, cuyo caso se dará como recuento estándar
en placa el valor más bajo.
Para dar los valores del recuento estándar en placa, deben utilizarse únicamente dos cifras
significativas. Estas dos cifras correspondientes a los dígitos primero y segundo
(empezando por la izquierda) de la media de las colonias halladas. Los dígitos restantes
tienen que ser sustituidos por ceros. Por ejemplo, si el valor calculado fue de 523,000, este
ha de darse como 520,000 (52 x 103). Si el tercer digito empezando por la izquierda es 5 o
superior, se le añade una unidad al segundo digito (se redondea). Por ejemplo, si el valor
calculado es de 83,600, este debe hacerse como 84,000 (84 x 103).
Los resultados obtenidos deben darse como la cuenta estándar en placa o como la cuenta
estándar en placa estimado por gramo o por mililitro de alimento según corresponda.
Referencias:
Norma Oficial Mexicana NOM-F403-S-1981 Alimentos Para Humanos Microbiológicos

Cuenta De Bacillus Mecentericurs O Bacillus Suptilis (Esporas Formadoras De Hebra).
(Federación, 2015)
Norma Oficial Mexicana NOM-092-SSA1-1994, Bienes Y Servicios. Método Para La Cuenta

De Bacterias Aerobias En Placa. (Salud., 2015)
Norma Oficial Mexicana NOM-110-SSA1-1994, Bienes Y Servicios. Preparación Y Dilución

De Muestras De Alimentos Para Su Análisis Microbiológico. (Salud., 2015)
29
PRÁCTICA 4: CUENTA DE MOHOS Y LEVADURAS DE ALIMENTOS
|Introducción
Los mohos y levaduras son microorganismos que tienen interés como causa de alteración y
como elementos biológicos utilizados en la manufactura de algunos alimentos: quesos,
cerveza, pan.
Al desarrollarse en alimentos, ciertos hongos pueden producir toxinas con efecto en los
animales y el hombre, las que genéricamente reciben el nombre de mico toxinas.
Los hongos tienen una gran ubicuidad en la naturaleza, siendo muy comunes en el polvo y la
tierra; las levaduras desarrollan con facilidad en los utensilios y equipo defectuosamente
lavados, que se utilizan en industrias que manejan carbohidratos.
Es de gran importancia cuantificar los mohos y levaduras en los alimentos, puesto que al
establecer la cuenta de estos microorganismos, permite su utilización como un indicador de
prácticas sanitarias inadecuadas durante la producción y el almacenamiento de los productos,
así como el uso de materia prima inadecuada.
Los lineamientos de la siguiente práctica están basados en el método propuesto por la Norma
Oficial Mexicana NOM-111-SSA1-1994.
Objetivo
Al término de esta práctica y mediante la aplicación de técnicas de aislamiento de hongos y

levaduras, el alumno será capaz de verificar la presencia de los mismos, en muestras de
alimentos.
30
Material, equipo y reactivos

 Medio de Agar dextrosa y  Pinzas, tijeras, espátulas  Balanza analítica
papa (PDA) (todo ellos previamente  Contador de colonias
 Ácido tartárico esterilizado)  Controlador de
 Pipetas bacteriológicas de Colonias Quebec.
1, 5, 10 y 11 ml  Estufa de incubación a
 Placas de Petri de vidrio 20-24 °C
(100x15 mm) o de plástico  Refrigerador
(90x15 mm)  Olla de presión
 Vaso homogeneizador
Procedimiento
Preparar las muestras de alimento para su dilución, aplicando el método señalado en la

práctica número 5. Para hacer diluciones pueden utilizarse los tubos de dilución de
diluyentes sobrantes del método de recuento en placa. Es muy importante procurar que
transcurra el menor tiempo posible entre la preparación de las diluciones y la siembra del
inoculo, para evitar la multiplicación o muerte de los microorganismos suspendidos en el
diluyente.
Para preparar el medio PDA (agar papa dextrosa), seguir las instrucciones del fabricante y
después de esterilizar, enfriar en baño de agua a 45 ± 1°C, acidificar a un pH de 3,5 ± 0,1
con ácido tartárico estéril al 10% (aproximadamente 1,4 ml de ácido tartárico por 100 ml de
medio). Después de adicionar la solución, mezclar y medir el pH con potenciómetro.
Pipetear en placas de Petri alícuotas de 1 ml de las diluciones de 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5,
utilizando dos placas por cada dilución. Se propone esta serie de diluciones para los casos
que no se conozca el número aproximado de unidades formadoras de colonias presentes
en la muestra. Las diluciones que han de prepararse y sembrarse siempre serán función
del recuento esperado.
31
Verter de 15 a 20 ml de agar papa dextrosa acidificado, fundido y mantenido a 45 ± 1 °C en

un baño de agua. El tiempo transcurrido entre la preparación de la dilución primaria y el
momento en que es vertido el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.
Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en el

sentido de las manecillas del reloj, seis en el sentido contrario y seis de atrás para adelante,
sobre una superficie lisa. Permitir que la mezcla se solidifique dejando las cajas Petri
reposar sobre una superficie horizontal fría.
Preparar una caja control con 15 ml de medio, para verificar la esterilidad.
Invertir las placas cuando se haya solidificado el agar e incubarlas a 20-24° durante 3-5
días.
Contar las colonias de cada placa después de 3, 4 y 5 días de incubación. Después de 5

días, seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si alguna parte
de la caja muestra crecimiento extendido de mohos o si es difícil contar colonias bien
aisladas, considerar los conteos de 4 días de incubación y aún de 3 días. En este caso,
informar el periodo de incubación de 3 o 4 días en los resultados del análisis.
Calcular el número de levaduras y mohos por gramo o mililitro de alimento.
Referencias:
Norma Oficial Mexicana NOM-093-SSA1-1994, Bienes Y Servicios. Prácticas De Higiene Y

Sanidad En La Preparación De Alimentos Que Se Ofrecen En Establecimientos Fijos.
(Salud., 2015)
32
PRÁCTICA 5: TINCIÓN SIMPLE Y MODELO CLÁSICO DE TINCIÓN

DIFERENCIAL (TINCIÓN DE GRAM), Y OBSERVACIÓN DE LOS
MICROORGANISMOS AL MICROSCOPIO
Introducción
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es 10 µm tal que resultan difíciles de ver
con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el
medio que la rodea. El modo más simple de aumentar el contraste es la utilización de
colorantes.
Si se desea simplemente aumentar el contraste de las células para la microscopia, son

suficientes los procedimientos que usan un solo colorante llamado de tinción simple. Sin
embargo, a menudo se utilizan métodos que no tiñen de igual modo todas las células, es el
proceso denominado tinción diferencial. Uno muy usado en microbiología es la tinción de
Gram. Basándose en su reacción a la tinción de Gram, las bacterias pueden dividirse en dos
grupos: Gram-positivas y Gram-negativas. Esta tinción tiene gran importancia en taxonomía
bacteriana ya que indica diferentes fundamentales de la pared celular de las distintas
bacterias.
Mientras que las bacterias Gram-negativas son constantes en su reacción, los

microorganismos Gram-positivos pueden presentar respuestas variables en ciertas
condiciones (son Gram-lábiles). Por ejemplo, los cultivos viejos de algunas bacterias Gram-
positivas pierden la propiedad de retener el cristal violeta, y en consecuencia, se tiñen por la
safranina apareciendo Gram-negativas. Análogo efecto se produce en ocasiones por cambio
en el medio del organismo, o por ligeras modificaciones en la ejecución de la técnica.
Pata explicar el mecanismo de la tinción de Gram se han propuesto varias hipótesis fundadas
en la naturaleza química de las paredes celulares de los microorganismos.
33
Objetivo
Utilizando diferentes colorantes de uso común, que el alumno observe al microscopio las
estructuras que se ponen de manifiesto por la tinción simple de organismos en suspensión.
Que el alumno observe al microscopio preparaciones fijas de muestras de alimentos y

distinga las estructuras que se ponen de manifiesto mediante la aplicación de la tinción
diferencial de Gram.

 Azul de metileno  Asa bacteriológica  Microscopio
 Tinta china  Cubreobjetos
 Verde de malaquita  Mechero Fisher
 Colorante de cristal  Portaobjetos
violeta
 Alcohol-cetona
 Safranina
 Solución de lugol
 Muestras de alimentos.
Procedimiento
Tinción simple
Coloque en el centro de un portaobjetos perfectamente limpio y libre de grasa una gota de

azul de metileno y con el asa de platino tome una pequeña porción de muestra de algún
alimento. Mezcle perfectamente con ayuda del asa, cubra la preparación con un
cubreobjetos limpio y observe al microscopio. Repita el procedimiento con otras muestras
de alimento utilizando safranina y verde malaquita. Anote sus observaciones.
Tenga presente, que realizar una preparación para el microscopio, debe depositarse en el
portaobjetos una capa de células lo suficientemente delgada para permitir el paso de la luz
a través de ella.
34
Tinción diferencial
Para preparar frotis antes de teñirlos se aplica el siguiente método: colocar una pequeña
gota de agua destilada en el portaobjetos limpio a una distancia conveniente que permita
sujetar el portaobjetos con los dedos, tomar una pequeña porción de la muestra con ayuda
del asa de platino previamente esterilizada, disperse la muestra y extienda la gota para
formar un frotis delgado. Secar el frotis al aire y fijarlo pasando tres veces el portaobjetos
(con el frotis hacia arriba) por encima de la llama del mechero Fisher. Después de la fijación
el frotis esta listo para la tinción.
Con dos muestras de diferentes alimentos preparar dos frotis idénticos en un portaobjetos
limpio, cubrirlos con solución colorante de cristal violeta y dejarlos reaccionar por un minuto.
Descartar el exceso de colorante y lavar con agua utilizando una piceta, enseguida aplicar
la solución de lugol por un minuto y lavar con agua de la llave.
Agregar la solución decolorante de alcohol- acetona, gota a gota, con el portaobjeto

inclinado sobre el fregadero, hasta que las gotas de la solución ya no arrastren color,
enjuagar con agua para detener la acción decolorante.
Cubrir el portaobjeto con la solución colorante de safranina dejándola reaccionar por 10 a

20 segundos, lavar el exceso de colorante y secar al aire.
Observe al microscopio y anote sus observaciones.
Referencias:
Norma Oficial Mexicana NOM-143-SSA1-1995, Bienes Y Servicios. Metodo De Prueba

Microbiologico Para Alimentos. Determinacion De Listeria Monocytogenes. (Salud., 2015)
35
PRÁCTICA 6: DETERMINACIÓN DE BACTERIAS COLIFORMES. TÉCNICA DEL

NÚMERO MÁS PROBABLE.
Introducción
Los coliformes comprenden todos aquellos bacilos no formadores de esporas, gram-

negativos, aeróbicos o facultativamente anaeróbicos, que fermentan la lactosa con formación
de gas antes de 48 horas a 35°C. La definición de un presunto coliforme corresponde a un
microorganismo que produce gas en un caldo lactosado a las 48 horas a 35°C. Un presunto
coliforme fecal es confirmado cuando produce gas en un medio de lactosa con verde brillante
al 2% después de 48 horas a 35°C 3.
Para determinar el número de microorganismos se utiliza la tecnica del número más probable.
Esta también se conoce como técnica de dilución en tubo, proporciona una estimación
estadística de la densidad microbiana presente con base a que la probabilidad de obtener
tubos con crecimiento positivo disminuye conforme es menor el volumen de muestra
inoculado.
En esta práctica se determinarán bacterias coliformes. Este grupo es el más utilizado en la

microbiología de los alimentos como indicador de la realización de prácticas higiénicas
inadecuadas. Escherichia coli, es un patógeno potencial para el hombre, es un bacilo aislado
del tubo intestinal de los animales de sangre caliente y es considerado por esta razón como
indicador de contaminación fecal.
Los lineamientos de la siguiente práctica están basados en el método propuesto por la Normas
Oficiales Mexicanas NOM-112-SSA1-1994 y NOM-113-SSA1-1994.
Objetivo
Al finalizar ésta práctica el alumno estará capacitado para realizar el análisis de muestras de
alimentos, para el aislamiento e identificación de microorganismos coliformes.
36

 Medio Caldo lauril sulfato  Asa de inoculación con  Estufa de incubación,
triptosa. alambre de nicrom o de 35-37 °C
 Medio Caldo lactosa bilis platino-iridio  Balanza granataria
(2%) verde brillante.  Lo necesario para la  Horno de esterilización
 Medio Agar eosina azul preparación y  Autoclave con
de metileno. homogeneizado de los termómetro y
alimentos manometro
(cuchillos,pinzas,etc)  Baño de agua con
 Pipetas bacteriológicas de control de temperatura
1,1.1 ,5 y 10 ml con filtro  Licuadora, vaso de
 Tubos de ensaye licuadora con tapa
roscados de 10 y 20 ml esterilizable.
 Solución desinfectante
(benzal al 1% o alcohol al
70%)
 Gradilla
Procedimiento de la técnica de NPM.
La preparación de la muestra de alimento para su dilución se realiza aplicando el método

señalado en la práctica 5. Para hacer las diluciones pueden utilizarse los blancos de dilución
o frascos de diluyentes sobrantes del método de recuento en placa. Es muy importante que
una vez hechas las diluciones del alimento, las siembras se realicen lo antes posible, para
evitar la multiplicación o muerte de los microorganismos suspendidos en el diluyente.
Para agua potable y hielo. Prueba presuntiva
Transferir 10 ml de muestra a cada uno de 5 tubos con 10 ml de caldo lactosado o caldo

lauril sulfato triptosa de concentración doble, 1.0 y 0.1 ml de muestra a cada una de las dos
series de 5 tubos con 10 ml de caldo lactosado o caldo lauril sulfato triptosa de
concentración sencilla com purpura de bromocresol.
37
Incubar los tubos a 35°C.Examinar a las 24 horas y observar si hay formación de gas. Si no
hay formación de gas incubar 24 horas más y volver a observar.
Prueba confirmativa
De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una asada y sembrar en un número
igual de tubos con caldo lactosado bilis verde brillante. Incubar a 35± 0.5 °C. Examinar a
las 24 horas y observar si hay formación de gas. Si no hay formación de gas incubar 24
horas más y volver a observar.
Para alimentos
Preparar suficientes diluciones para asegurar que todos los tubos de la última dilución sean
negativas
Preparación de la muestra
Dilución primaria 10-1 Para muestras liquidas no viscosas, agitar la muestra manualmente
con 25 movimientos de arriba abajo en un arco de 30 cm. Tomar 1 ml de la muestra y diluir
con 9 ml de solución diluyente (alternativamente pueden tomarse 10 ml de muestra y 90 ml
de solución diluyente).
Para muestras solidas o semisólidas pesar 10 g de muestra en un vaso de licuadora estéril.

Agregar 90 ml de solución de agua de dilución estéril .Operar la licuadora de 1 a 2 min hasta
la homogeneización de la muestra. Permitir la sedimentación de partículas grandes y tomar
la alícuota de la parte superior del vaso.
Dilución 10-2 Colocar 1 ml de la dilución primaria en un tubo roscado conteniendo 9 ml de

de solución diluyente estéril. Agitar vigorosamente.
Preparar diluciones adicionales repitiendo este procedimiento.
Prueba presuntiva
Transferir 10 ml de muestra liquida o dilución primaria a cada uno de los tres tubos con 10
ml de caldo lactosado o caldo lauril sulfato triptosa de concentración doble, 1.0 ml y 0.1 ml
de muestra liquida o dilución primaria a cada una de las dos series de tres tubos con 10 ml
de caldo lactosado o caldo lauril sulfato triptosa de concentración sencilla con bromocresol.
38
Incubar los tubos a 35°C.Examinar a las 24 horas y observar si hay formación de gas. Si no
hay formación de gas, incubar 24 horas más y volver a observar.
Prueba confirmativa
De cada tubo que muestre formación de gas, tomar una azada y sembrar en un número
igual de tubos con caldo lactosado bilis verde brillante. Incubar los tubos a 35°C. Examinar
a las 24 horas y observar si hay formación de gas. Si no hay formación de gas, incubar por
24 horas más y volver a obsevar.
Anotar el número de tubos confirmados como positivos de organismos coliformes a cada

dilución.
Para obtener el NMP, proceder de la forma siguiente. Ver en cada una de las tres diluciones
seleccionadas el número de tubos en los que se confirmó la presencia de coliformes. Buscar
en la tabla del NMP que se presenta a continuación y anotar el NMP que corresponda al
número de tubos positivos de cada dilución.
39
CUADRO 1 (AGUA) CUADRO 2 (ALIMENTOS)
INDICE DE NMP Y LIMITES DE CONFIANZA INDICE DE NMP Y LIMITES DE CONFIANZA

95% PARA VARIAS COMBINACIONES DE 95% PARA VARIAS COMBINACIONES DE
RESULTADOS POSITIVOS CUANDO SON RESULTADOS POSITIVOS CUANDO SON
USADOS CINCO NUMEROS DE TUBOS USADOS TRES NUMEROS DE TUBOS
DILUCIONES 10, 1.0 Y 0.1 G DILUCIONES 10, 1.0 Y 0.1 G
TUBOS ÍNDICE DEL TUBOS ÍNDICE DEL

POSITIVOS NMP/G POSITIVOS NMP/G
0-0-0 <0.02 0-0-0 <0.03
0-0-1 0.02 0-0-1 0.3
0-1-0 0.02 0-1-0 0.3
0-2-0 0.04 0-2-0 /
1-0-0 0.02 1-0-0 0.4
1-0-1 0.04 1-0-1 0.7
1-1-0 0.04 1-1-0 0.7
1-1-1 0.06 1-1-1 1.1
1-2-0 0.06 1-2-0 1.1
2-0-0 0.05 2-0-0 0.9
2-0-1 0.07 2-0-1 1.4
2-1-0 0.07 2-1-0 1.5
2-1-1 0.09 2-1-1 2
2-2-0 0.09 2-2-0 2.1
2-2-1 -- 2-2-1 2.8
2-3-0 0.12 2-3-0 /
3-0-0 0.08 3-0-0 2.3
3-0-1 0.11 3-0-1 3.9
3-0-2 -- 3-0-2 6.4
3-1-0 0.11 3-1-0 4.3
3-1-1 0.14 3-1-1 7.5
3-1-2 -- 3-1-2 12
3-2-0 0.14 3-2-0 9.3
3-2-1 0.17 3-2-1 15
3-2-2 -- 3-2-2 21
3-3-0 -- 3-3-0 24
3-3-1 -- 3-3-1 46
3-3-2 110
3-3-3 >110
40
3-3-2 --
3-3-3 --
4-0-0 0.13
4-0-1 0.17 Presentación e interpretación de los
4-1-0 0.17 resultados. Los resultados obtenidos
4-1-1 0.21
deben darse como organismos coliformes
4-1-2 0.26
4-2-0 0.22 por gramo o por mililitro de alimento, según
4-2-1 0.26 corresponda.
4-3-0 0.27
4-3-1 0.33
4-4-0 0.34
5-0-0 0.23 Referencias:
5-0-1 0.31
5-0-2 0.43
5-1-0 0.33 Norma Oficial Mexicana NOM-112-SSA1-
5-1-1 0.46 1994, Bienes Y Servicios. Determinación
5-1-2 0.63
De Bacterias Coliformes. Técnica Del
5-2-0 0.49
Número Más Probable.
5-2-1 0.70
5-2-2 0.94
Norma Oficial Mexicana NOM-113-SSA1-
5-3-0 0.79
5-3-1 1.10 1994, Bienes Y Servicios. Método Para La
5-3-2 1.40 Cuenta De Microorganismos Coliformes
5-3-3 1.80 Totales En Placa. (Salud., 2015)
5-4-0 1.30
5-4-1 1.70
5-4-2 2.20
5-4-3 2.80
5-4-4 3.50
5-5-0 2.40
5-5-1 3.50
5-5-2 5.40
5-5-3 9.20
5-5-4 16.09
5-5-5 --
41
PRÁCTICA 7: DETERMINACION DE SALMONELLA EN ALIMENTOS
Introducción
El género Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae. Como el nombre lo indica,

Enterobactericeae comprende bacterias que proliferan en el intestino; varios géneros de esta
familia contienen especies patógenas. Además de Salmonella, se incluyen especies patógenas
transmitidas por los alimentos de los géneros Escherichia, Shigella y Yersinia
Salmonella es una bacteria gram-negativa en forma de bacilo que posee flagelos. Las bacterias
del género Salmonella son microorganismos anaerobios facultativos. Son oxidasa negativa,
fermentan la glucosa y producen ácido y gas. Una de las características de este género es que
la mayoría de los miembros no fermenta la lactosa ni la sacarosa
Shigella es un bacilo gram negativo perteneciente a la familia Enterobacteriaceae, que se

encuentra estrechamente relacionada con el género Escherichia, por sus propiedades
bioquímicas, serológicas y por similitudes genéticas. Se caracteriza por no fermentar la lactosa,
ser inmóvil, no produce lisina decarboxilasa y raramente produce gas a partir de hidratos de
carbono. Su identificación se basa en características bioquímicas y antigénicas
Salmonella es una bacteria invasora que causa infecciones humanas, conocidas como
salmonelosis. Puesto que el intestino es el hábitat natural de algunas variedades de Salmonella,
los alimentos sin procesar de una fuente animal ocasionalmente albergan al patógeno. Por
consiguiente, Salmonella se encuentra en productos derivados de aves de corral, incluidos pollo,
huevo y pavo. De igual manera, mariscos, leche y ensaladas han estado implicados en brotes
de salmonelosis. Sólo algunas especies de Salmonella son patógenas para los seres humanos,
pero todas las salmonelas son inaceptables en alimentos listos para comer. Por tanto, el
alimento se analiza para determinar la presencia o ausencia de Salmonella
Las distintas especies de Shigella constituyen la principal causa de disentería, diarrea

caracterizada por eliminación frecuente de heces con pus, sangre y/o mucus. El ser humano es
el único reservorio conocido de este agente. La mayoría de los casos ocurren en niños, en
general trasmitidos por contacto directo. Los brotes a gran escala, vinculados a alimentos, son
más raros. Los métodos convencionales de detección de Salmonella y Shigella dependen de
las características del cultivo. Estos métodos implican el preenriquecimiento y el enriquecimiento
selectivo, seguidos de los pasos de aislamiento y las pruebas de identificación. Los pasos de
42
enriquecimiento y aislamiento son técnicas principalmente de cultivo, en tanto que la

identificación se basa en el análisis bioquímico NOM-114-SSA1-1994.
Objetivo
Usando las técnicas adecuadas, al finalizar ésta práctica el alumno estará capacitado para
realizar la determinación de salmonella en muestras de alimentos.
 Agua de peptona tamponada  Aguja y asa de inoculación  Horno de

con alambre de nicrom o de esterilización.
 Agar sulfito bismuto, para
platino-iridio  Autoclave con
placas.
termómetro y
 Instrumentos para la
 Agar SS para Salmonella y manómetro.
preparación de la muestra:
Shigella para placas.  Licuadora, vaso de
cuchillos, pinzas, tenedores,
 Caldo lactosado, sin distribuir y
licuadora con tapa
tijeras, cucharas, espátulas,
en tubos con 10 ml, según esterilizable.
todos ellos previamente
precise  Balanza granataria.
esterilizados o pasteurizados
 Incubadora con
 Caldo tetrationato, sin distribuir  Pipetas bacteriológicas de 1, termostato.
y en tubos con 10 ml, según 1.1, 5 y 10 ml.
precise.
 Placas de Petri, de vidrio
 Solución verde brillante (100x15 mm) o de plástico
 Solución de yodo-yoduro.
(90x15 mm)
 Matraces Enlermeyer de 500

ml.
 Tubos de ensayo de 16 x 150

y 20 x 100 mm.
43
Preparación de la muestra
La preparación de la muestra se basara en el análisis de 25 g de la muestra en una

proporción de 1:9 de muestra-caldo lactosado.
Procedimiento
Pesar 25 g de la muestra y homogeneizar con 225 ml de medio de pre-enriquecimiento

(caldo lactosado) y licuar durante 1 minuto. Posteriormente transferir a un recipiente de
boca ancha con tapa de rosca y dejar reposar 60 min a temperatura ambiente. Mezclar y
ajustar a un pH de 6.8 con NaOH o HCL. 1N. incubar 24 hr a 35°C.
Transferir 1 ml del cultivo de pre-enriquecimiento a un tubo que contenga 10 ml de caldo

tetrationato e incubar 24 hr a 35 °C.
Para los demás productos
Aislamiento en medios de agar para salmonelas
Agitar los frascos de cultivo y con la ayuda de una asa sembrar por estría en medios
diferentes selectivos: agar verde brillante, agar sulfito bismuto y agar SS. Procurar obtener
por cada tubo , colonias aisladas sobre la superficie de cuando menos dos placas por medio
diferencia selectivo. Incubar a 35°C durante 24 horas. Observar los cultivos para identificar
morfológicamente las colonias sospechosas. En el medio de agar verde brillante las
colonias de salmonela se presentan como colonias rojas o rosas rodeadas por medio rojo;
las bacterias fermentadoras de lactosa dan colonias amarillas.
En agar sulfito de bismuto las colonias son negras o cafés, con o sin brillo metálico, rodeado
de un halo café que posteriormente se transforma en negro.
La salmonela desarrollada en el medio de agar SS como colonias traslucidas, transparentes

u opacas y algunas veces con centro negro. Las colonias fermentadoras de la lactosa son
rojas.
Referencias:
Norma Oficial Mexicana NOM-114-SSA1-1994, Bienes Y Servicios. Método Para La

Determinación De Salmonella En Alimentos (Salud., 2015)
44
PRÁCTICA 8: RECUENTO DE STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Introducción
El género Staphylococcus se describe como Gram (+), crece aisladamente, en parejas, en

tétradas o agrupaciones irregulares parecidas a racimos de uvas.
Los Staphylococcus se encuentran en las fosas nasales, la piel y en lesiones de humanos y

otros mamíferos.
Su determinación se utiliza como componente de los criterios microbiológicos para alimentos

cocidos, para productos que son sometidos a manipulación excesiva durante su preparación o
después del proceso térmico.
Cuando los alimentos se someten al proceso térmico y muestran altos recuentos de

Staphylococcus generalmente se debe a que la contaminación proviene de la posterior
manipulación, contacto con equipo o aire contaminado y/o conservación inadecuada del
mismo. Este género comprende varias especies dentro de las cuales están S. aureus, S.
epidermidis y S. saprophyticus.
Un número elevado de estos microorganismos puede indicar la presencia de toxinas

termoestables, no obstante, un recuento bajo no significa ausencia de las mismas ya que una
población numerosa pudo haberse reducido a un número más pequeño debido a una etapa del
proceso, por ejemplo, calentamiento o fermentación.
El crecimiento de S. aureus en alimentos tiene gran importancia por tratarse de un

microorganismo capaz de producir una poderosa enterotoxina que al ingerirse causa severas
intoxicaciones alimentarias.
Los lineamientos de la siguiente práctica están basados en el método propuesto por la Norma
Oficial Mexicana NOM-115-SSA1-1994.
45
Objetivo
Al finalizar esta práctica el alumno estará capacitado para realizar la identificación y el recuento
de Staphylococcus aureus en muestras de alimentos.
Material, equipo y reactivos

 Agar Baird-Parker  Aguja y asa de inoculación  Balanza analítica
 Yema de huevo  Instrumentos para la  Baño con agua circulante a
preparación de la muestra 43±0.005 °C
(previamente  Estufa de incubación a 35-
esterilizados) 37°C
 Vaso homogenizador
 Pipetas bacteriológicas de
1ml
 Placas Petri
 Varilla de vidrio acodada
Procedimiento
Preparar las muestras de alimento para su dilución. Para hacer las diluciones pueden
utilizarse los tubos de dilución o frascos de diluyentes sobrantes del método de recuento en
placa. Importante: una vez hechas las diluciones del alimento, debe procurarse que
transcurra el menor tiempo posible hasta que se realizan las siembras, pues así se evita la
multiplicación o muerte de los organismos suspendidos en el diluyente.
Utilizando una pipeta por dilución, transferir alícuotas de 0.1 ml de las diluciones 10-1, 10-2
y 10-3 sobre la superficie de placas de Petri conteniendo medio Agar Baird-Parker. Las
46
diluciones que han de prepararse y sembrarse siempre serán función del recuento
esperado.
Distribuir el inóculo sobre la superficie del medio utilizando para ello varillas estériles de
vidrio dobladas en ángulo recto. Usar una varilla para cada dilución.
Mantener las placas en su posición hasta que el inóculo sea absorbido totalmente por el
agar. Invertir las placas e incubarlas durante 45-48 horas a 35 °C.
Con la ayuda del contador de colonias y el dispositivo de recuento con registro automático,
contar las colonias en aquellas placas que contengan entre 20 y 200, colonias típicas de
Staphylococcus aureus. Si esto no fuera posible, seleccionar las placas de las diluciones
más altas aunque en ellas se cuenten más de 200 colonias. Las colonias típicas son negras,
circulares, brillantes, de 2-3 mm de diámetro y rodeadas de una zona clara. Sin embargo,
en este tipo de alimentos pueden aparecer colonias negras sin brillo, que no presentan zona
clara.
Calcular en número de Staphylococcus aureus por gramo o mililitro de alimento.
PRUEBA DE COAGULASA
Elegir el número de colonias para realizar la prueba de la coagulasa de acuerdo a la tabla

8.1 y sembrar el número de colonias seleccionadas, en 0.5 ml de caldo infusión cerebro
corazón.+
Después del periodo de incubación, pasar con una pipeta de 1 ml 0.2 ml del cultivo anterior
colocar una osada de cada columna relacionados en un tubo de ensayo que contenga 0.2
ml de plasma de conejo.
Incubar en un baño de agua de 35 a 37 °C y observar a intervalos de 1 hora hasta seis; si

hay formación de coágulo. Observar a las 24 horas. Considerar positiva la prueba si hay
formación de coágulo.
47
Tabla 8.1 Selección del número de colonias para la prueba de la coagulasa
Número de colonias sospechosas en la Número de colonias a probar

placa
Menos de 50 3
51 a 100 5
101 a 200 o más 7
Referencias:
Norma Oficial Mexicana NOM-115-SSA1-1994, Bienes Y Servicios. Método Para La

Determinación De Staphylococcus Aureus En Alimentos. (Salud., 2015)
48
Referencias
Federación, D. O. (10 de 06 de 2015). Diario Oficial de la Federación . Obtenido de Diario

Oficial de la Federación :
http://dof.gob.mx/nota_detalle.php?codigo=4671146&fecha=16/07/1981
Salud, S. d. (22 de 06 de 2015). Secretaría de Salud. Obtenido de Secretaría de Salud:

http://www2.sepdf.gob.mx/petc/archivos-documentos-rectores/nom_093_SSA1-
1994.pdf
Salud, S. d. (22 de 06 de 2015). Secretaría de Salud. Obtenido de Secretaría de Salud:

http://www.salud.gob.mx/unidades/cdi/nom/092ssa14.html
49

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Instituto Tecnológico de Oaxaca

Manual de Prácticas de Microbiología de Alimentos

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE OAXACA

Normas Y Sugerencias Para Trabajar En El Laboratorio De Microbiología................. 3

Práctica 1: Identificación Y Uso Del Equipo, Materiales Y Reactivos Del Laboratorio

De Microbiologia De Alimentos ...................................................................................... 5

Práctica 2: Preparación Y Esterilización De Medios De Cultivo ................................. 18

Práctica 3: Cuenta De Bacterias Mesofilas Áerobias En Placa .................................. 23

Práctica 4: Cuenta De Mohos Y Levaduras De Alimentos ......................................... 30

Práctica 5: Tinción Simple Y Modelo Clásico De Tinción Diferencial (Tinción De

Gram), Y Observación De Los Microorganismos Al Microscopio .............................. 33

Práctica 6: Recuento De Coliformes Por La Técnica Del Número Más Probable

Práctica 7: Determinacion De Salmonella En Alimentos ........................................... 42

Práctica 8: Recuento De Staphylococcus Aureus ....................................................... 45

NORMAS Y SUGERENCIAS PARA TRABAJAR EN EL LABORATORIO DE

1. El uso de la bata de laboratorio es indispensable para asistir a la práctica.

Sugerencias para el trabajo en el laboratorio

1. Es muy importante la asistencia a la práctica a la hora indicada, ya que las

PRÁCTICA 1: IDENTIFICACIÓN Y USO DEL EQUIPO, MATERIALES Y

La microbiología es una ciencia muy interesante y fascinante. Para su estudio y comprensión

El material utilizado en un laboratorio de Microbiología es muy variado y depende

Evidentemente, no se precisa el mismo equipamiento en un centro de investigación con un

El tipo de material usado en el laboratorio de microbiología más común es el siguiente:

Descripción de reactivos y medios de cultivo

Nombre Uso Imagen

Medio utilizado para

El Agar Papa y Dextrosa es

El Agar Métodos Estándar

Medio recomendado para

Este medio está

Este medio (también

Medio de cultivo utilizado

Medio de cultivo utilizado

Es un medio selectivo para

Medio de alta especificidad

Colorantes 1.Permite teñir el

Se utilizan para sembrar. Pueden

Se utilizan para la extensión de

Este material existe en dos

Porta objetos Placas de vidrio para colocar las

Sirven para contener y

Son recipientes de vidrio,

Se usan para taponar tubos de

Espátulas Se utilizan para transferir

Es un utensilio que permite medir

Permite contener sustancias que

Permite guardar sustancias para

Se usa para obtener precipitados

Están hechos de varilla de vidrio

Gradillas Se utiliza para colocar tubos de

Se utiliza para facilitar el

Aparato que aplica sobre los

Es un aparato que mediante la

Es un aparato que permite

Es el equipo más utilizado en él

Permite observar las reacciones

Potenciómetro Es un aparato que permite

Se usa para secar y esterilizar

Es un aparato que se utiliza para

Es un utensilio metálico que

PRÁCTICA 2: PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

Los microorganismos pueden producir enfermedades cuando infectan personas, animales y

• Para evitar la transmisión de las enfermedades y las infecciones.