INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA

DEPARTAMENTO DE BIOPROCESOS

ACADEMIA DE CIENCIA Y TECNOLOGÍA FARMACÉUTICA

INGENIERÍA DE PRODUCTOS BIOLÓGICOS

LABORATORIO

Elaboraron:
I.B.T. Verónica Chávez Infante
I.B.T. Héctor Molina Jiménez

Diciembre de 2011
PRÓLOGO

La unidad de aprendizaje nació como respuesta a las necesidades encontradas en la industria

farmacéutica nacional y para que los egresados de la carrera de Ingeniería Farmacéutica puedan
competir más eficientemente al incorporarse a ésas fuentes de trabajo.

Podemos definir a un Producto Biológico como cualquier virus, suero terapéutico, toxina, antitoxina o
producto análogo; aplicable a la prevención o tratamiento de enfermedades humanas.

El presente Manual de Prácticas del Laboratorio de Ingeniería de Productos Biológicos.

Consta de seis prácticas:

1. Prueba de efectividad de antibióticos en diferentes microorganismos.
2. Determinación de la capacidad del medio de cultivo para permitir el crecimiento de los
microorganismos.
3. Producción de anticuerpos en conejos.
4. Diseño teórico por bioinformática de una vacuna.
5. Análisis del proceso de producción de interferón humano por tecnología recombinante.
6. Aislamiento de insulina a partir de páncreas bovino.

Abarca las seis unidades temáticas que comprende el programa.

EVALUACIÓN DEL LABORATORIO DE INGENIERÍA DE PRODUCTOS
BIOLÓGICOS 8 DE AGOSTO 2013

La evaluación del Laboratorio corresponde al 40% de la calificación que se asienta en las actas.

La evaluación del curso se realizará en tres evaluaciones departamentales.

El alumno debe obtener una calificación mínima de seis (6.0) para aprobar.

En caso de presentar examen extraordinario se deberá presentar un examen práctico teórico de todos
los conocimientos adquiridos en el semestre.

Los aspectos a evaluar son:

El desempeño y trabajo en el laboratorio (10%),
La bitácora (10%), y
La entrega del reporte escrito correspondiente a la práctica realizada (80%).

El reporte escrito debe contener al menos los siguientes apartados:

1. Introducción
2. Objetivos
3. Diagrama de flujo del trabajo realizado
4. Resultados
5. Discusión de resultados
6. Conclusiones
7. Sugerencias (opcional)
8. Bibliografía consultada.

FIRMA DE CONFORMIDAD Y ENTERADO

 0PRÁCTICA No. 1

Prueba de efectividad de antibióticos en diferentes microorganismos.

OBJETIVO GENERAL:
Determinar la eficacia de diferentes antibióticos.

OBJETIVOS ESPECIFICOS:
Conocer los métodos que existen para determinar la eficacia terapéutica de un antibiótico.
Realizar la curva patrón de penicilina, estreptomicina y tetraciclina de acuerdo a la farmacopea.

INTRODUCCIÓN
Las infecciones bacterianas son un problema de salud a nivel mundial: esto es particularmente cierto para los
países subdesarrollados, donde estas enfermedades también causan una pérdida económica importante.
Para una quimioterapia sistémica, un agente antibacteriano ideal debe ser seguro en dosis terapéuticas altas
dosis, fácil de administrar, incapaz de inducir resistencia y de bajo costo; para determinar la factibilidad y los
regímenes óptimos de dosificación se deben de efectuar cuidadosos estudios farmacológicos y farmacocinéticos.
Los antibióticos son compuestos solubles derivados de ciertos microorganismos y que inhiben el crecimiento de
otros.
La eficacia terapéutica de los antibióticos es demostrada por el efecto inhibitorio del crecimiento de un
microorganismo sobre un medio de cultivo específico para cada antibiótico.
Existen dos métodos generales para demostrar esta inhibición; el método de cilindro-placa y el ensayo
turbidimétrico, el primero depende de la difusión a través de un cilindro y sobre una placa solidificada de agar en
una caja petri de tal manera que se adiciona un microorganismo de prueba dependiendo del antibiótico a ensayar
y la inhibición se determina en un área circular alrededor del cilindro que contiene el antibiótico. El método
turbidimétrico depende del crecimiento microbiano en un medio de cultivo líquido que es favorable para el
crecimiento en la ausencia del antibiótico.

MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS:

Antibióticos:
Penicilina
Estreptomicina
Tetraciciclina

Microorganismos:
Staphylococcus aureus
Bacillus subtilis

Medios de cultivo:
Medio para antibióticos No. 1 (agar y medio líquido)
Medio para antibióticos No. 2
Medio para antibióticos No. 32 (es el medio No. 1 + 300 mg de MnSO 4.H20 por litro)

Diluyentes:
Acido clorhídrico 0.1 N
Solución amortiguadora No. 1 (Disolver 2.0 g de fosfato dibásico de potasio y 8.0 g de fosfato monobásico de
potasio en 1000 ml de agua. Ajustar el pH con ácido fosfórico 18 N ó Hidróxido de potasio 10 N a pH 6.0 +/-0.05)

PROCEDIMIENTO:

Preparación del estándar

Estándar de penicilina.
Pesar la cantidad necesaria para obtener una solución de 100 U/ml y realizar las diluciones necesarias para
obtener por lo menos 5 puntos de la curva de manera que el punto medio sea 1.0 U/ml

Estándar de tetraciclina.
Pesar la cantidad necesaria para obtener una solución de 1 mg/ml y realizar las diluciones necesarias para
obtener 5 puntos de la curva de manera que el punto medio sea 0.24 g/ml

Estándar de estreptomicina.
Pesar la cantidad necesaria para obtener una solución de 1 mg/ml y realizar las diluciones necesarias para
obtener 5 puntos de la curva de manera que el punto medio sea 30 g/ml.

Preparación del inóculo.

En un tubo de agar nutritivo sembrar el microorganismo de prueba e incubarlo 24 h. Añadir solución salina estéril
suficiente para obtener una solución ajustada al 25% de transmitancia a 580 nm.

Método del cilindro-placa.

1. Añadir 20 ml del medio No. 2 en cada caja de petri, una por cada dilución y dejar solidificar.
2. Añadir al medio No. 1, 0.1 ml de S. aureus o B. subtilis de la suspensión del inóculo (ajustada al 25%) por cada
100 ml.
3. Añadir 10 ml del medio inoculado sobre la placa gelificada de agar No. 2 y dejar solidificar nuevamente.
4. Colocar 2 cilindros sobre las placas gelificadas y añadir 50 l de cada una de las diluciones, incubar a 37 C por
24 h, medir el halo de inhibición.

Método turbidimétrico
1. Preparar las diluciones necesarias para el estándar y realizar por triplicado el ensayo.
2. Colocar 9.0 ml del medio para antibióticos líquido y añadir 0.01 ml de inóculo.
3. Incluir 1 ó 2 tubos control, conteniendo l ml de diluyente sin antibiótico y 9 ml de medio.
4. De la solución de referencia añadir 1 ml de cada dilución a cada uno de los tres tubos preparados y colocar los
tubos en una gradilla.
5. Colocar la gradilla en un baño de agua a 37 C. Después de la incubación añadir 0.5 ml de formaldehído al 12%
en cada tubo.
6. Leer la absorbancia de los tubos de cada gradilla a 530 nm ajustando previamente con los tubos control.
 PRÁCTICA 2
Determinación de la capacidad del medio de cultivo para
permitir el crecimiento de los microorganismos (USP XX)

Ésta prueba se lleva a cabo para comprobar que los medios Medio fluido de tioglicolato y Medio digerido de
soya tripticasa tienen las propiedades necesarias para permitir el crecimiento de microorganismos.

Material:
Asa bacteriológica
Cajas de Petri
Celdas para el espectrofotómetro
Matraces
Perlas de vidrio estériles
Pipetas estériles
Tubos de vidrio con rosca y tapas
Tubos para centrífuga (Falcon®)
Varilla de vidrio para la extensión del microorganismo
Recipiente con agua para desechas las pipetas usadas
Cinta para rotular
Marcador indeleble
Mecheros
Franela
Esponjas
Cerillos o encendedor

Equipos:
Parrilla eléctrica con agitación magnética
Incubadora
Espectrofotómetro
Campana de flujo laminar
Agitador vórtex

Soluciones:
Agua destilada estéril
Solución salina al 0.85%
Solución de fenol al 5%

Cepas a utilizar:
 Bacteroides vulgatus ATCC 8482, Clostridium sporogenes ATCC 7955 o Aspergillus niger ATCC 16404 para el
Medio fluido de tioglicolato (MFT)
 Bacillus subtilis ATCC 6633 o Candida albicans ATCC 10231 para el Medio digerido tríptico de caseína y soya
(MDST)

Medios de cultivo:
Caldo carne para los microorganismos B. vulgatus, C. sporogenes y A. niger.
Agar infusión de cerebro y corazón (BHI) para los microorganismos B. subtilis y C. albicans.
Agar gelosa sangre
 MEDIO FLUIDO DE TIOGLICOLATO (MFT)
Digerido pancreático de caseína 15.00 g
Extracto de levaduras (soluble en agua) 5.00 g
Cloruro de sodio 2.50 g
Dextrosa monohidratada 2.50 g
Agar granulado (con menos del 15% de humedad) 0.75 g
Cistina HCl 0.50 g
Tioglicolato de sodio 0.50 g
Resarzurina (solución al 0.1% recientemente preparada) 1.00 mL
Agua aforar a 1000 mL
pH después de la esterilización 7.0 ± 0.2
Éste medio puede sustituirse por Caldo tripticasa soya de BBL o DIFCO®.
®

MEDIO DIGERIDO TRÍPTICO DE CASEÍNA Y SOYA (MDST)

Digerido pancreático de caseína 17.0 g
Cloruro de sodio 5.0 g
Digerido pancreático de harina de soya 3.0 g
Dextrosa monohidratada 2.5 g
Fosfato de potasio dibásico 2.5 g
Agua purificada Aforar a 1000 mL
pH después de la esterilización 7.3 ± 0.2
Éste medio puede sustituirse por el Caldo soya tripticasa de BBL ® o DIFCO®.

DESARROLLO EXPERIMENTAL

PARA EL MEDIO FLUIDO DE TIOGLICOLATO (MFT):

Preparación del inóculo para la determinación de la sensibilidad del medio de cultivo:
A partir de un cultivo de caldo carne o bien, de un vial liofilizado, efectuar una resiembra o caldo
tioglicolato, incubar a 37 °C durante 48 horas.
Obtención del paquete celular:
Centrifugar a 3000 rpm durante 15 minutos, lavar con solución salina al 0.85% dos veces. Resuspender
el paquete celular en 15 mL de solución salina al 0.85%.
Ajustar esta suspensión a 60% de transmitancia utilizando un filtro verde (580 nm). Una vez ajustada,
preparar diluciones decimales de 10-1 a 10-8. Por duplicado colocar en placas de gelosa sangre 0.5 mL
de las diluciones 10-5, 10-6, 10-7 y 10-8, extender la alícuota ayudándose de una varilla doblada en ángulo
recto estéril.
Incubar a 37 °C durante 48 horas en atmósfera de anaerobiosis (sistema de Gas-Pack).
Transcurrido el periodo de incubación, proceder a contar las Unidades formadoras de colonias (UFC)
en cada una de las placas seleccionando aquellas placas que muestren no menos de 30 ni más de 300
UFC. Calcular el número total considerando la dilución y el volumen del inóculo. Utilizar la dilución
que muestre un número de UFC menor de 100.
Desarrollo de la prueba.
De cada lote de medio que se prepare, separar 9 tubos; 4 se usan para probar la sensibilidad del medio
de cultivo; 3 tubos para una segunda prueba, si ésta fuera necesaria y 2 tubos se utilizan como control
de esterilidad del medio de cultivo.
De la suspensión ajustada como se indicó anteriormente tomar 1 mL e inocularla a cada tubo de prueba.
Incubar a 30-35 °C durante 7 días. Revisar los tubos diariamente y anotar el día en el que aparezca el
crecimiento (generalmente aparece al tercer día).
NOTA: Es conveniente que al momento de la prueba se efectúe una cuenta en placa, para comprobar que el
número de microorganismos del inóculo es el indicado en la USP (United States Pharmacopeia).
PARA EL MEDIO DIGERIDO DE SOYA TRIPTICASA (MDST):

Preparación de los inóculos para la determinación de la sensibilidad del medio de cultivo:

a. Obtención de esporas de Bacillus subtilis.

Sembrar el B. subtilis en tubo conteniendo agar BHI (inclinado), incubar por a 37 °C 48 horas.
Transcurrido el período de incubación, cosechar el cultivo y resuspender en solución salina en un tubo
provisto de perlas de vidrio estériles (para la homogenización del cultivo), agitándolo en el vórtex.
Calentar el cultivo a 70 °C durante 30 minutos. Lavar tres veces centrifugando a 300 rpm durante 15
minutos con solución salina estéril al 0.85% y resuspender finalmente en 50 mL de agua destilada
estéril. Calentar nuevamente a 70 °C por 30 minutos. Sembrar una placa de BHI para observar
viabilidad de las esporas.
Ajustar la suspensión a 60% de transmitancia utilizando un filtro verde (580 nm). Una vez ajustada la
suspensión, preparar diluciones decimales 10-1 a 10-7 y sembrar por duplicado en cajas de Petri 1 mL de
cada una de las 3 últimas diluciones, colocar sobre el inóculo aproximadamente 25 mL de agar BHI
previamente fundido y enfriado a 45 °C (técnica de vaciado en placa), homogenizar y dejar solidificar
el agar, incubara 37 °C por 24 horas. Transcurrido el periodo de incubación, proceder a contar las UFC
en cada una de las placas, se deben seleccionar aquellas que presenten no menos de 30 ni más de 300
UFC. Calcular el número total considerando la dilución del inóculo. Utilizar la dilución que muestre un
número de UFC cercano a 100 (no más de 100).

b. Obtención de la suspensión de Candida albicans.

Sembrar el microorganismo en tubos de agar BHI inclinado e incubar a 37 °C por 48 horas.
Transcurrido el periodo de incubación cosechar el cultivo, resuspender en 15 mL de solución salina y
homogenizar.
Ajustar la suspensión a 40% de transmitancia utilizando un filtro verde (580 nm). Una vez ajustada,
preparar diluciones decimales de 10-1 a 10-8. Hacer cuenta viable de las cuatro últimas diluciones
siguiendo el método de vaciado en placa (como en el inciso a.).
Utilizar la dilución que muestre un número cercano a 100 UFC, no más de 100.

Desarrollo de la prueba:
De cada lote de medio de agar soya tripticasa que se prepare, separar 16 tubos, de los cuales 8 se
utilizarán para probar la sensibilidad del medio, 6 tubos para una segunda prueba, si esta fuera
necesaria y 2 tubos se utilizan como control de esterilidad del medio de cultivo.
De las suspensiones preparadas se inoculan 1 mL de cada una en cuatro tubos de medio y la segunda en
los cuatro complementarios.
Incubar a 20 –25 °C durante 7 días. Observando diariamente y anotando el día en que aparece
crecimiento.
NOTA: Es conveniente hacer una cuenta en placa como se indicó para el medio de tioglicolato, para comprobar
que el número de microorganismo del inóculo es el indicado.

Evaluación:
Si ambos medios fallan para obtener crecimiento de los microorganismos en una concentración de 1 a
100 microorganismos por mL, se deben investigar los medios en cuestión y la forma de prepararlos.
Igualmente determinar si los microorganismos están en las condiciones óptimas y si el procedimiento
se ha seguido correctamente.
REFERENCIA
Manual de laboratorio de producción y control de biológicos, 4ta. ed., IPN, México, 1984, 222 pp.
 PRÁCTICA 3.
PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS EN CONEJOS.

OBJETIVOS.
 Obtener dos inmunógenos bacterianos, uno de naturaleza proteínica (antígeno "H"), y otro de
naturaleza lipopolisacarídica (antígeno "O") de Salmonella thyphimurium.
 El alumno ensayará las técnicas de inmunización con los animales de uso más común en el
laboratorio, practicando algunos de los esquemas de inmunización ya establecidos.
 Efectuar la purificación de gamma globulina por precipitación con sulfato de amonio a una
saturación final del 33%.
 El alumno conocerá distintas maneras de poner en evidencia la reacción de precipitación que ocurre
cuando un antígeno soluble interacciona con su anticuerpo homólogo.

INTRODUCCIÓN.

INMUNIZACIÓN Y SANGRADO DE ANIMALES.

Inmunización es el proceso, natural o artificial, mediante el cual un individuo competente desarrolla
una respuesta inmunológica al entrar en contacto con un antígeno.
Cuando un inmunógeno penetra al organismo, es captado y procesado por las células
presentadoras de antígeno (CPA), llevándose a cabo una serie de interacciones celulares que involucran
también a los linfocitos T y a los linfocitos B. Como resultado se induce una respuesta inmunológica
primaria con la consecuente formación de anticuerpos, los cuales se detectan en el suero a partir del
cuarto día de inmunización (fase lag), incrementando su concentración lentamente (fase log) hasta
llegar aun máximo (meseta) para posteriormente decaer rápidamente. En este tipo de respuesta el
isotipo principal de inmunoglobulina producido es IgM, seguida por una pequeña cantidad de IgG de
baja afinidad.
En un segundo contacto con el inmunógeno, la fase lag disminuye considerablemente y se
alcanza una concentración de anticuerpos aproximadamente diez veces mayor que en una respuesta
primaria; el isotipo dominante en este caso es IgG, y presenta una mayor afinidad por el antígeno.
El isotipo de anticuerpo producido puede reflejar la diferencia en la ruta de inmunización y la
naturaleza del inmunógeno, así como la vía por la cual el antígeno es procesado y presentado a
diferentes poblaciones de linfocitos.
Para que un antígeno pueda actuar como un buen inmunógeno debe favorecer la cooperación
entre las células T y B. Un mismo antígeno puede no tener la misma inmunogenicidad en diferentes
especies animales, ya que esto depende de las características gen éticas, así como de la edad y sexo del
individuo inmunizado.
La dosis del inmunógeno es un factor importante para lograr una respuesta inmunológica, ya
que cantidades excesivas o mínimas del antígeno pueden inducir el fenómeno de tolerancia, el cual se
define como un estado de no-respuesta aun antígeno en particular.
El estado físico del antígeno (particulado o soluble) debe tomarse en cuenta para designar la
ruta de inmunización, es decir, los antígenos particulados (bacterias, eritrocitos, células)
preferentemente son introducidos dentro del organismo por vía intravenosa, mientras que los antígenos
en solución pueden introducirse por diversas vías, como intramuscular (IM), intraperitoneal (IP),
subcutánea (SC) e intradérmica (ID). En estas dos últimas, se utiliza preferentemente el antígeno
acompañado de un inmunopotenciador o adyuvante. Estos agentes actúan inespecíficamente para
incrementar la respuesta inmune específica aun antígeno dado.
Los adyuvantes se han clasificado arbitrariamente de acuerdo a los mecanismos de acción
propuestos, ya que la mayoría de ellos parecen funcionar utilizando más de un mecanismo. Los
adyuvantes pueden actuar a través de la retención y liberación del antígeno, o por efecto directo en
macrófagos y linfocitos. La formación de un depósito de antígeno parece ser importante para la
actividad de adyuvantes como aquellos compuestos de alúmina, emulsiones de aceite, liposomas y
polímeros sintéticos. La actividad de los adyuvantes como lipopolisacáridos (LPS) y muramil dipéptido
(MDP) parece ser mediada principalmente a través de la activación de macrófagos, mientras que
Bordetella pertusis actúa sobre macrófagos y linfocitos.
Actualmente, el adyuvante de mayor uso en animales de experimentación es el de Freund. El
adyuvante incompleto de Freund es una mezcla de un aceite mineral (Drakeol, Bayol, Nujol) con un
detergente (Falba, Arlacel, Aquafor) en diferentes proporciones, por ejemplo, Arlacel-Drakeol (1:9);
Arlacel-Bayol (3:17). El adyuvante completo de Freund contiene además del aceite y el detergente, una
micobacteria (M. tuberculosis, M. bovis, M. phlei u otras) cuya cantidad es variable (de 1 a 5 mg de la
bacteria, peso seco, por cada mililitro de la mezcla incompleta de Freund).
En los humanos no se recomienda el uso de este tipo de adyuvante (Freund completo e
incompleto) ya que frecuentemente su aplicación conduce al desarrollo de granulomas graves.
No hay esquemas establecidos para la inmunización de un animal con un antígeno determinado.
Los esquemas empleados en los diferentes laboratorios se han establecido realizando pruebas de ensayo
y error.

Sangrado.
El sangrado se efectúa antes y después del protocolo de inmunización en cada uno de los animales. El
sangrado previo es indispensable para contar con el testigo negativo. Al suero obtenido después de la
inmunización, generalmente después de 4 a 7 días de la última inoculación, se le determinará el título de
anticuerpos, si éste es alto, los conejos se sangrarán en blanco por punción cardiaca.

PREPARACIÓN DE INMUNÓGENOS.
El concepto de antígeno ha sido utilizado para denominar aquellas sustancias extrañas al organismo que
pueden reaccionar específicamente con los anticuerpos o con receptores celulares. En la actualidad,
además del concepto de antígeno, cabe mencionar los conceptos de inmunógeno y de hapteno. Se
define como inmunógeno a aquella sustancia capaz de inducir o estimular una respuesta inmunológica.
El concepto de hapteno fue introducido por Landstainer para denominar a aquellas sustancias que son,
en general, de bajo peso molecular, capaces de reaccionar con los anticuerpos o los receptores celulares
sin que por sí mismos generen una respuesta inmunológica, a menos que se acoplen con un acarreador,
generalmente una proteína.
La importancia de trabajar en la obtención de antígenos radica en las diferentes aplicaciones que
se les pueden dar a éstos. Por ejemplo, se pueden utilizar en pruebas de diagnóstico, en la preparación
de vacunas, con fines epidemiológicos y de investigación para estudiar los mecanismos inmunológicos
que participan en el reconocimiento antigénico.
La inmunogenicidad de los antígenos radica en varias de sus características fisicoquímicas. Su
capacidad inmunogénica depende grandemente de su naturaleza química, siendo los mejores
inmunógenos las proteínas, seguidas de los polisacáridos, lípidos y por último los ácidos nucléicos.
Algunas sustancias de bajo peso molecular, como el dinitroclorobenceno (DNCB), el cloruro de
picrilo y medicamentos como penicilinas y sulfonamidas, son inmunogénicas particularmente si se
aplican en la piel, debido a que forman complejos con proteínas tisulares
 Antígeno "H".
El antígeno "H" se encuentra localizado solamente en los flagelos de la bacteria. Su naturaleza es
proteínica, y por lo tanto es lábil a temperaturas mayores de 60°C, y al tratamiento con alcohol o ácidos
diluidos. Una determinada cepa de Salmonella en cultivo puede generar en distintos momentos dos
diferentes tipos de antígenos “H". Los del primer tipo, denominados de fase uno, o específicos, se
comparten entre pocos serotipos de Salmonella. Los del segundo tipo, llamados de fase dos, son menos
específicos. La clasificación de las enterobacterias se basa en sus características morfológicas,
reacciones bioquímicas y propiedades antigénicas. Por lo tanto, el trabajar con diferentes antígenos de
un mismo grupo de enterobacterias puede ayudar en la clasificación.

Antígeno "O".
Los diferentes serotipos de Salmonella están íntimamente relacionados entre sí y éste es el criterio
básico para su clasificación. Las especies de Salmonella se clasifican en grupos, de acuerdo con la
estructura química del antígeno somático. Esto es, que dependiendo de su composición de azúcares
diferentes, presencia o ausencia de grupos acetilo sustituidos y enlaces glicosídicos alfa y beta. se ha
observado una gran cantidad de serotipos diferentes. Este antígeno se encuentra en la superficie de la
bacteria formando parte de su membrana externa. A este antígeno también se le conoce como la
endotoxina de Salmonella. Debido a que es un lipopolisacárido, este antígeno resiste temperaturas hasta
de 100°C durante tiempos prolongados y no se destruye con alcohol ni con ácidos diluidos.

PURIFICACIÓN DE GAMMA GLOBULINA POR PRECIPITACIÓN CON SULFATO DE AMONIO.

Tiselius y Kabat demostraron que la actividad de anticuerpos está principalmente presente en la
fracción gamma de las proteínas del suero. Desde entonces se han diseñado diferentes métodos para la
obtención de esta fracción sérica.
Los anticuerpos pueden purificarse por métodos específicos e inespecíficos. Los métodos
específicos se basan en la propiedad que tienen los anticuerpos para reaccionar con sus antígenos. Así,
los anticuerpos pueden ser precipitados por la adición del antígeno en estado soluble, o ser adsorbidos
al antígeno previamente insolubilizado. En ambos casos, el complejo resultante puede disociarse por
modificación del pH a valores entre 2.5 y 4.0 ó 9.5 y 11.0, o bien por aumento en la concentración de
sales o la concentración del antígeno soluble. Después, los anticuerpos se recuperan por alguno de los
métodos de separación inespecífica.
Las separaciones inespecíficas están basadas en las propiedades fisicoquímicas de los
anticuerpos. Entre estos métodos, los más utilizados son la precipitación con etanol, con sulfato de
amonio o sulfato de sodio, electroforesis en diversos soportes (papel, acetato de celulosa, gel de
almidón, etc.), cromatografía de intercambio iónico y filtración en tamices moleculares.
Uno de los métodos inespecíficos más empleados de purificación de gamma globulina es la
precipitación con sulfato de amonio a una concentración final de 33%. Generalmente, se considera que
con tres precipitaciones se obtiene una gamma globulina con un alto grado de pureza.
La precipitación de la gamma globulina por este método se debe al fenómeno conocido como
"salting out", el cual consiste en que las moléculas de agua que solvatan a la molécula de anticuerpo
son desplazadas por los iones sulfato y amonio, que además neutralizan los grupos cargados de la
proteína, con lo que se insolubiliza y precipita.

REACCIONES DE PRECIPITACIÓN.
La inmunoprecipitación se presenta cuando antígenos solubles y polivalentes se combinan con su
anticuerpo específico (antisuero homólogo) y da lugar a complejos insolubles que son visibles y
cuantificables.
 La facilidad de combinación del antígeno con el anticuerpo depende de varios factores como
son el pH, fuerza iónica, temperatura, tiempo, y sobre todo, las concentraciones relativas de antígeno y
anticuerpo.
Los complejos antígeno-anticuerpo insolubles forman una red tridimensional que debe ser
voluminosa para que pueda observarse, y los reactantes han de estar en proporciones adecuadas, ya que
el exceso de cualquiera de ellos conduce a un cierto grado de solubilización del agregado molecular;
este hecho se explica ya que la reacción antígeno-anticuerpo está sujeta a la ley de acción de masas.

Reacción de precipitación en medio líquido.

Para llevar a cabo la reacción, se mezclan cantidades crecientes del antígeno soluble con una cantidad
constante del anticuerpo específico y se mide el precipitado resultante. En forma semicuantitativa se
estima la cantidad de precipitado formado, expresándolo en milímetros lineales. Cuantitativamente, el
precipitado se puede analizar mediante la determinación del nitrógeno proteínico en el mismo.
Si los resultados se presentan en forma gráfica colocando en el eje de las abscisas la cantidad de
antígeno agregado y en el de las ordenadas la cantidad de precipitado, se obtiene una curva en forma de
campana.
No se observa formación de precipitado a pequeñas concentraciones de antígeno, pero conforme
aumenta la concentración de éste, comienza a formarse un precipitado que va en aumento gradual hasta
llegar aun máximo, después del cual comienza a disminuir en cantidad aún cuando la concentración de
antígeno siga aumentando. Al analizar el contenido del sobrenadante después de centrifugar y eliminar
el precipitado, es posible evidenciar la presencia de anticuerpo libre en la región ascendente de la curva
(zona de exceso de anticuerpo) o de antígeno libre en la región descendente de la misma (zona de
exceso de antígeno). En la región central de la curva donde ocurre la máxima precipitación, no hay ni
anticuerpo ni antígeno libres, ya esta región se le denomina zona de equivalencia.

Reacciones de precipitación en medio semisólido.

Las reacciones de precipitación en medios semisólidos, llamadas inmunodifusión en gel, han
aumentado una nueva dimensión al poder resolutivo de estos métodos, ya que permiten identificar
individualmente cada constituyente de una mezcla de antígenos y anticuerpos, así como su
cuantificación por comparación con sistemas conocidos. Este poder de resolución es mayor si se
combina con la electroforesis.
La velocidad de difusión de los reactantes depende de las propiedades físicas e inmunoquímicas del
sistema, como son la concentración, el tamaño y la forma de las moléculas así como la viscosidad del medio. El
número de bandas observadas representa el número mínimo de sistemas antígeno-anticuerpo existentes en el
medio.
Las técnicas de difusión en gel pueden clasificarse en difusión simple y difusión doble.
Inmunodifusión simple o radial (Mancini). En este método sólo uno de los reactivos
(generalmente el antígeno) difunde radialmente desde un pozo perforado en el agar en el cual ya está
embebido el otro reactivo (generalmente el anticuerpo). En la cercanía del pozo, el antígeno está en una
concentración relativamente alta y forma complejos solubles; conforme el antígeno difunde, la
concentración va disminuyendo hasta un punto en que ambos reactivos alcanzan concentraciones
equivalentes y entonces se forma un halo de precipitación. Cuanto más alta sea la concentración de
antígeno mayor será el diámetro del halo. Esta prueba se puede realizar de manera cuantitativa si se
agregan concentraciones conocidas del antígeno de prueba, de tal manera que se pueda construir una
curva de calibración.
Este método se emplea rutinariamente para cuantificar inmunoglobulinas, complemento,
factores de coagulación, transferrina, alfafetoproteína, entre muchos otros componentes.
 Inmunodifusión doble (Oüchterlony). Este método se basa en el principio de que el antígeno
y el anticuerpo difunden a través de un medio semisólido y forman complejos inmunes estables que
pueden ser analizados visualmente.
El método permite identificar sistemas antígeno-anticuerpo múltiples, establecer la posible
relación inmunológica entre dos antígenos y hacer estimaciones gruesas sobre la pureza del antígeno o
del anticuerpo. Es posible emplear también este método para el análisis semi cuantitativo de la
concentración de antígeno, o para conocer el título precipitante de un antisuero. Su principal desventaja
es su relativamente baja sensibilidad (1 mg/l00 mL).

MATERIALES.
Material por grupo:
Adyuvante completo e incompleto de Freund.
Agitador magnético.
Agitador Vórtex.
Antígeno suficiente para inmunizar a los conejos de acuerdo a los protocolos de inmunización.
BaCl al 10% (5 mL).
Baño maría a 37°C.
Base magnética.
Bote metálico de boca ancha.
Cajas para transporte de animales.
Centrífuga clínica.
Colorante para marcar los animales.
Conejos suficientes para obtener la cantidad de antisuero según las necesidades del curso.
Charola con solución de benzal.
Jaulas para ratones.
Matraz Erlenmeyer de 2 L.
Mechero Bunsen.
Solución de timerosal al 1 % (10 mL)
Solución salina-regulador de boratos (SSRB) 0.1 M, pH 7.8.
Tripie.

Material por equipo:

2 tubos Agar nutritivo.
Agarosa tipo II, medium EEO (Sigma Chemical).
1 fco Alcohol al 70% con torundas de algodón.
0.5 mL Antígeno soluble.
0.3 mL Antisuero.
10 pzas Aplicadores de madera.
Caja de Petri de 15 x 100 mm.
1 tubo Caldo nutritivo.
2 tubos Caldo tioglicolato con aceite mineral.
1 pza Frasco Gerber.
1 pza Gradilla con plastilina.
1 pza Gradilla para tubos de ensaye de 10 x 75 mm.
1 pza Gradilla para tubos de ensaye de 15 mm de diámetro.
10 cm Hilo grueso.
 Horadador de 3 mm de diámetro
Jeringas estériles de 1.0 mL con agujas de 22 x 32 mm.
Jeringas estériles de 1.0 mL con agujas de 25 x 16 mm.
Jeringas estériles de 10 mL con agujas de 20 x 25 mm.
Jeringas estériles de 20 mL con agujas de 20 x 25 mm.
1 pza Lámpara.
1 pza Matraz Erlenmeyer de 125 mL.
1 pza Matraz Erlenmeyer de 25 mL.
1 pza Mechero Bunsen.
5.0 mL NaOH 2 N.
Papel absorbente.
Papel indicador de pH.
1 pza Pinza de disección
5 pzas Pipeta Pasteur estériles, y bulbo de hule.
1 pza Pipeta serológica de 1.0 mL.
4 pza Pipeta serológica de 10 mL, de punta ancha.
2 pza Pipeta serológica de 5.0 mL.
3 pzas Pipetas de 5.0 mL, estériles.
Portaobjetos limpios y desengrasados.
Regla graduada en milímetros.
Rejilla de asbesto
1 tubo Semilla de Salmonella typhimurium.
200 mL Solución de salina al 0.85% (SS), pH 7.8, estéril.
2 mL Solución de timerosal al 1 %.
50 mL Solución salina con 0.3% de formaldehído, estéril.
20 mL Solución sobresaturada de sulfato de amonio.
10 mL SSRB.
10 mL Suero.
Tripié metálico
16 pzas Tubo capilar.
2 pzas Tubo cónico de 15 mL, graduados.
14 pzas Tubo de ensaye de 10 x 75 mm.
5 pzas Tubo de ensaye de 13 x 100 mm. con tapón de rosca, estériles.
4 pzas Tubo de ensaye de 15 x 125 mm.
Tubo para diálisis.
2 pzas Vaso de precipitados de 250 mL.

METODOLOGÍA:

A. Obtención del antígeno "H".

Precaución: trabajar en condiciones de esterilidad.
1. Seleccionar formas móviles de Salmonella typhimurium y sembrarlas en un tubo con caldo
nutritivo. Incubar a 37°C durante 18 a 24h.
2. Agregar al cultivo solución de formaldehído hasta una concentración final de 0.3%.
3. Incubar a temperatura ambiente durante 24 a 48 h.
4. Cosechar el cultivo por centrifugación a 3000 rpm durante 15 min.
5. Desechar el sobrenadante y resuspender el sedimento bacteriano en solución salina formalinizada al
0.3%, con el objeto de fijar químicamente los componentes microbianos, hasta igualar la turbidez
con la del tubo No.3 del nefelómetro de McFarland.
6. Probar la esterilidad del producto sembrando dos gotas en un tubo con agar nutritivo y en un tubo
con caldo tioglicolato, incubando los tubos a 37°C durante 24 horas.
7. Mantener la suspensión en refrigeración hasta su uso.

B. Obtención del antígeno “O".

Precaución: trabajar en condiciones de esterilidad.
1. Cosechar el crecimiento de Salmonella typhimurium obtenido en un tubo con agar inclinado,
agregando 2.0 mL de SS, y agitar vigorosamente hasta tener una suspensión homogénea.
2. Pasar la suspensión a un tubo de ensaye estéril con la ayuda de una pipeta Pasteur estéril.
3. Colocar el tubo en un baño maría a ebullición durante 90 min.
4. Centrifugar a 3000 rpm durante 15 min.
5. Desechar el sobrenadante y re suspender el paquete bacteriano en solución salina formalinizada al
0.3%, hasta igualar con la turbidez del tubo No.3 del nefelómetro de McFarland.
6. Probar la esterilidad del producto sembrando dos gotas en un tubo con agar nutritivo y en un tubo
con caldo tioglicolato, incubando los tubos a 37°C durante 24 horas.
7. Mantener la preparación antigénica en refrigeración hasta su uso.

C. Sangrado de oreja del conejo.

1. Localizar la arteria central de la oreja y limpiar con una torunda con alcohol.
2. Sangrar al conejo con una jeringa de 5 mL con aguja de 20 x 25 mm.
3. Obtener la cantidad necesaria de sangre, retirar la aguja y presionar el sitio de la punción con un
algodón.

D. Sangrado de corazón.
Esta técnica se utiliza en conejos y cobayos, fundamentalmente, cuando se pretende sangrar en blanco al
animal.
1. Sujetar al conejo o al cobayo de las cuatro patas, colocándolo con el tórax hacia arriba, como lo
indique su profesor.
2. Tocar con la mano la zona del tórax para localizar el corazón con el tacto.
3. Limpiar con una torunda la zona del tórax.
4. Proceder a hacer la punción con una jeringa de 20 mL con una aguja de 20 x 32 mm.
Nota: Si una vez que se introdujo la aguja no está en una cavidad del corazón, sacarla y volverla a
introducir nuevamente, ya que si se mueve la aguja en el interior del tórax se corre el riesgo de
desgarrar el tejido cardiaco y/o pulmonar ocasionando la muerte del animal.

E. Obtención de suero.
1. Disgregar el coágulo con un aplicador de madera.
2. Incubar la sangre a 37°C durante 30 -60 min. para permitir la retracción del coágulo.
3. Centrifugar a 3000 rpm durante 15 min. y recuperar el suero.
4. Guardar el suero en congelación hasta su uso.

INMUNIZACIÓN DE CONEJOS.
F. Inmunización vía intravenosa.
1. Colocar al conejo en el cepo.
2. Localizar las venas marginales de la oreja del animal.
3. Sujetar bien la oreja con los dedos medio y anular.
4. Limpiar la zona de inmunización con alcohol al 70%.
5. Proceder a inyectar al animal. Si se va a llevar acabo una serie de inmunizaciones, es recomendable
comenzar en el extremo de la oreja más alejado de la cabeza y se procede a inyectar hacia la base
de la oreja.

G. Inmunización vía subcutánea.

1. Elegir la zona de inoculación, cortar el pelo del animal con tijeras y limpiar con una torunda.
2. Levantar ligeramente la piel del conejo e introducir la aguja lateralmente, aproximadamente una
tercera parte de ésta, y depositar el antígeno. No debe formarse pápula en el sitio de la inoculación.

H. Inmunización vía intradérmica.

1. Rasurar el lomo del animal.
2. Introducir la aguja de 22 x 32 mm en la dermis del animal con el bisel hacia arriba. Una vez dentro
de la piel, girar 180° y depositar el inóculo. En el sitio de la inoculación se debe observar la
formación de una pápula.

PROTOCOLOS DE INMUNIZACIÓN.
I. ANTÍGENOS P ARTICULADOS.
Antígenos bacterianos.
Utilizar antígenos "H" y "O" de Salmonella typhimurium ajustados a una concentración equivalente al
tubo No.3 del nefelómetro de McFarland (aproximadamente 900 millones de bacterias/mL de suspensión).
Inmunizar de acuerdo al siguiente protocolo:
Protocolo de inmunización de antígenos bacterianos particulados
Inyección No. Tiempo (días) Fecha Dosis Vía Notas
1 0 0.5 mL IV
2 4 1.0 mL IV
3 8 2.0 mL IV
4 12 3.0 mL IV
Sangrado 18

Titular los antisueros con los antígenos respectivos. En general, los títulos de 1:640 o mayores son los
adecuados para el antígeno somático "O", y para el antígeno "H" de 1:5000 o mayores. En caso de que
se obtengan títulos menores a los señalados, se recomienda administrar una quinta dosis de 3 mL al
cuarto o sexto día después del sangrado. Efectuar un nuevo sangrado seis días después de la
reestimulación.

J. ANTÍGENOS SOLUBLES.
Proteínas solubles.
Utilizar fracciones séricas como albúmina y gamma globulina.
Protocolo de inmunización para antígenos solubles.
Inyección Tiempo Fecha Dosis Disolvente Vía
No. (días)
1 0 5 mg 1.0 mL de SS, emulsificados con 1.0 mL ID en sitios
de adyuvante completo de Freund múltiples
2 15 5 mg 1.0 mL de SS, emulsificados con 1.0 mL ID en sitios
de adyuvante incompleto de Freund múltiples
 3 30 0.25 mg SS IV
4 31 0.50 mg SS IV
5 32 1.0 mg SS IV
Sangrar 39

K. Precipitación de gamma globulina con sulfato de amonio.

1. Ajustar a 7.8 el pH de la solución saturada de sulfato de amonio, con NaOH 2N.
2. Adicionar a un volumen de suero, contenido en un tubo cónico, medio volumen de la solución
sobresaturada de sulfato de amonio, LENTAMENTE y CON AGITACIÓN CONSTANTE. De esta
forma, el sulfato de amonio queda a una saturación final del 33%.
3. Continuar con la agitación durante 10-15 min. después de terminar la adición del sulfato de amonio.
4. Centrifugar los tubos a temperatura ambiente a 3500 rpm durante 15 min.
5. Disolver el sedimento en SS pH 7.8, hasta alcanzar el volumen original del suero.
6. Repetir los pasos 2, 3, 4 y 5.
7. Repetir nuevamente los pasos 2, 3 y 4.
8. Disolver en SSRB el sedimento después de la última centrifugación hasta alcanzar la mitad o un
tercio del volumen original del suero.
9. Dializar contra SSRB en frío (4°C) y con agitación, durante 3-5 días, realizando 2 cambios diarios
de solución de diálisis hasta eliminar completamente al sulfato de amonio. Para saber si
efectivamente se eliminó al sulfato de amonio, a 5.0 mL de la solución de diálisis se le agregan
unas gotas de cloruro de bario al 10%. La diálisis se considera completa si ya no se observa la
formación de un precipitado blanco de sulfato de bario.
10. Transferir la gamma globulina dializada a un tubo y centrifugar en frío a 2500 rpm durante 10 min.
para eliminar el precipitado que se hubiera formado.
11. Determinar la concentración de proteínas por colorimetría o espectrofotometría.
12. Agregar a la preparación de gamma globulina, timerosal hasta una concentración final del 0.01 %, y
conservarla en refrigeración o congelación.
13. Comprobar la pureza del producto por inmunoelectroforesis.

REACCIÓN DE PRECIPITACIÓN EN MEDIO LÍQUIDO.

L. Precipitación en capilar.
1. Hacer una serie de diluciones dobles del antígeno en tubos de 10 x 75 mm de la siguiente manera:
depositar 0.2 mL de SS en 10 tubos de ensaye. Al primer tubo agregar 0.2 mL de la solución
concentrada del antígeno y mezclar. De este tubo tomar 0.2 mL y transferirlos al segundo tubo.
Mezclar y transferir 0.2 mL al tercer tubo, y así sucesivamente hasta el tubo 10.
2. Dividir los tubos capilares en tres partes iguales utilizando un marcador indeleble.
3. Llenar un tubo capilar con antisuero hasta la primera marca y limpiar el exterior del tubo con papel
absorbente para eliminar el antisuero adherido a las paredes externas del mismo.
4. Invertir el tubo capilar para hacer descender el antisuero hasta el borde del extremo contrario.
5. Tomar un volumen de antígeno de tal manera que el líquido dentro del capilar llegue hasta la
segunda marca. No debe haber burbujas en la interfase entre el antígeno y el antisuero. Limpiar la
parte externa del capilar con papel absorbente.
6. Mezclar el contenido por movimientos de rotación e inversión repetidos del capilar. Centrar el
contenido del capilar, tapar uno de los extremos del mismo con el dedo índice e introducir el
extremo contrario en una gradilla con plastilina.
7. Repetir los pasos 3, 4, 5 y 6 para cada una de las diluciones del antígeno.
8. Utilizar como testigos un tubo capilar conteniendo antisuero más SS y otro conteniendo antígeno
sin diluir más SS.
9. Mantener los tubos capilares a temperatura ambiente durante 24 a 48 h.

REACCIONES DE PRECIPITACIÓN EN MEDIO SEMISÓLIDO.

M. Inmunodifusión doble (Método de Oüchterlony).
1. Preparar 200 mL de una solución de agarosa al 0.1% en SS. Disolver la agarosa por calentamiento.
Reponer el volumen perdido por evaporación con agua destilada caliente. Sumergir los portaobjetos
cuando aún esté caliente la solución de agarosa, escurrirlos y dejarlos secar (barnizado).
2. Preparar una solución de agarosa al 1% en SS. Disolver la agarosa por calentamiento, reponiendo el
volumen perdido con agua destilada; adicionar timerosal hasta una concentración final del 0.01 %.
Colocar los portaobjetos previamente barnizados y ya secos, en una superficie completamente
horizontal y con una pipeta serológica de punta ancha depositar 4.0 mL de agarosa al 1% caliente
sobre cada uno de ellos. Dejar gelificar a temperatura ambiente y mantener los portaobjetos dentro
de una cámara húmeda hasta su uso.
3. Perforar la agarosa según el molde proporcionado más adelante y remover el gel del interior de las
perforaciones.
4. Llenar con el antisuero el pozo central y con los antígenos los pozos periféricos. Cuidar de que no
se derrame ninguno de los reactivos fuera de los pozos.
5. Incubar los portaobjetos en una cámara húmeda, usando una caja de Petri en cuya tapa se ha
colocado papel absorbente humedecido. Incubar a temperatura ambiente durante 24 a 48 h.

MANEJO DE LOS RESULTADOS.

Medir la cantidad de precipitado con la ayuda de una regla. Con los datos obtenidos completar la
siguiente tabla y hacer una gráfica en papel milimétrico, anotando en el eje de las abscisas la
concentración del antígeno y en las ordenadas la cantidad de precipitado en mm, y localizar las zonas
de exceso de anticuerpo, de antígeno y la de equivalencia.
Hacer un esquema de los resultados obtenidos identificando las bandas de identidad, de
identidad parcial y aquellas de no-identidad.

REFERENCIAS BILIOGRÁFICAS.
 Campbell, D. H.; Garvey, J. S.; Cremer, N. E. y Sussdorf, D. H. 1970. METHODS IN IMMUNOLOGY. 2a.
ed. W. A. Benjamin. Editor.
 Davis, B. D.; Dulbecco, R.; Eissen, H. N. y Ginsberg H. S. 1980. MICROBIOLOGY. 3a. ed. Harper & Row
Editores.
 Hudson, L. y Hay, F.C. PRACTICAL IMMUNOLOGY. Editorial Blackwell Scientific Publications.
 Kabat, E. A. y Mayer. M. M. 1968. INMUNOQUÍMICA EXPERIMENTAL. 1a. ed. La Prensa Médica
Mexicana.
 K1ein, J. 1991. IMMUNOLOGY. Blackwell Scientific Publications.
 Roitt, I. M. 1997. ESSENTIAL IMMUNOLOGY. 9a. ed. Blackwell Scientific Publications.
 Williams, C; Curtis, A. y Chase, M. W. 1967. METHODS IN IMMUNOLOGY AND
IMMUNOCHEMISTRY. Editorial Academic Press.
 Práctica 5
PROTEÍNAS TERAPÉUTICAS
Desde hace mucho tiempo se han aislando de la orina, sangre y otros tejidos, humanos y
animales, proteínas terapéuticas con métodos bioquímicos tradicionales. Así por ejemplo, la
insulina proveniente del páncreas del cerdo regula los niveles de glucosa en sangre de
diabéticos tipo l. Sin embargo los tratamientos con proteínas animales que presentan
diferencias con respecto a las humanas pueden provocar una importante respuesta
inmunitaria.

La diabetes mellitus es una enfermedad crónica caracterizada por la incapacidad del

individuo de metabolizar la glucosa de manera normal debido a una deficiencia parcial o total
de la hormona insulina, por lo que en algunos casos los pacientes diabéticos pueden ser
controlados mediante la aplicación de la insulina.

En México toda la insulina es importada. Su consumo ha sido calculada en 1989 fue de 56

kg. Y para el año 2007 se estimo entre 81 y 100 kg de esta hormona.

Extracción de insulina proveniente de páncreas de cerdo.

1. Pesar 30 9 de páncreas de ( de preferencia neonato) ganado y adicionar 100 m I de
buffer modificado
Buffer modificado. 75 m I de metanol, 25 m I de agua destilada, y 1 m I de ácido
clorhídrico concentrado
2. Incubar por tres horas a 35°C en agitación.
3. Eliminar el tejido mediante filtración con doble capa de gasa. De ser necesario filtrar con
papel filtro.
4. Con el tejido recuperado realizar nuevamente la extracción con 100 m I de buffer
modificado durante 1 hora en las miasmas condiciones.
5. Juntar los dos extractos.
6. Adicionar hidróxido de sodio concentrado hasta obtener un pH en el límite del alcalino o
hasta que se forme un precipitado. Centrifugar, eliminar el precipitado y medir el volumen
de sobrenadante.
7. En tubos de centrifuga de 50 m I colocar 100 ml sobrenadante.
8. La insulina se precipita mediante la adición de 1 m I de metanol y 25 m I de éter.
9. Incubar la mezcla en el refrigerador por 12 h
10. Centrifugar y el precipitado (insulina) será liofilizado
11. Generalmente se logran obtener en promedio 15 mg