11. ¿Cuál es la importancia de determinar endotoxinas bacterianas en medicamentos?

Ya que son la causa más común de reacciones tóxicas asociadas a la contaminación de

productos farmacéuticos y artículos médicos.

12. ¿Cuál es la naturaleza química de las endotoxinas?

Las endotoxinas son lipopolisacáridos cuya actividad es mayor que la de otras
sustancias pirogénicas de estructura diferente.

13. ¿En qué estructura celular encontramos endotoxinas?

Las endotoxinas más conocidas son los lipopolisacáridos (LPS), que hacen parte de la pared
celular de las bacterias Gram negativas

14. ¿Cuál es el origen del lisado de amebocitos que se utiliza en esta prueba?
La prueba para determinar o cuantificar endotoxinas utiliza el lisado de amebocitos de Limulus
polyphemus o Tachypleus tridentatus.

15. ¿Cuáles son los métodos que pueden emplearse para la determinación de endotoxinas
bacterianas?
Método A: Formación de un gel.
Método B: Fotométrico, que dependiendo de la forma de cuantificación puede ser:
● Turbidimétrico (cinético y de punto final), basado en el desarrollo de turbiedad después
de la ruptura de un sustrato endógeno.
● Cromogénico (cinético y de punto final), basado en el desarrollo de color después de la
ruptura del complejo sintético péptido-cromógeno.

16. ¿Cuál es el diluyente que debe emplearse en esta prueba?

El Agua libre de endotoxinas (ALE). Es el diluyente de elección y no debe reaccionar con el
reactivo de LAL (Lisado de amebocitos).

17. ¿Cuál es el procedimiento para la preparación del lisado de amebocitos?

Lisado de amebocitos. Reconstituir el reactivo con agua libre de endotoxina (ALE) o solución
amortiguadora, siguiendo las instrucciones del fabricante. Mezclar suavemente, evitando la
formación de espuma. Almacenar el lisado reconstituido en refrigeración o congelación, de
acuerdo a las recomendaciones del fabricante.

18. Definir “Máxima dilución válida (MDV)”

La máxima dilución válida es la dilución máxima permitida de una muestra en la que el límite de
endotoxina puede determinarse.

19. Elaborar un diagrama de flujo de los Métodos de Formación de Gel: Prueba límite y Prueba
semicuantitativa

Método de formación de gel (Prueba límite)

Método de formación de gel (Prueba semicuantitativa).
20. Definir “Factores de Interferencia”.
Son factores presentes en la muestra que pueden ocasionar resultados falsos positivos o
negativos.

TAREA 12 MGA-0381 Esterilidad

21. Explicar la utilidad de esta prueba.

Esta prueba aplica a todos los productos biológicos, medicamentos, dispositivos médicos y
productos que se denominan como estériles, y tiene como finalidad investigar la presencia de
microorganismos contaminantes.

22. Describir el modo de preparación del medio líquido tioglicolato.

MATERIALES
L-Cistina 0.5 g
Cloruro de sodio 2.5 g
Glucosa monohidratada/anhidra 5.5 / 5.0 g
Agar granulado con un contenido de humedad
no mayor del 15 % 0.75 g
Extracto de levadura soluble en agua 5.0 g
Digerido pancreático de caseína 15.0 g
Tioglicolato de sodio* 0.5 g
Solución de resazurina de sodio 1:1 000 recién
preparada 1.0 mL
Agua purificada 1 000 mL
pH después de esterilizar 7.1 ± 0.2
* Puede sustituirse por 0.3 mL de ácido tioglicólico.
PROCEDIMIENTO
Mezclar los ingredientes en agua y calentar hasta que se disuelvan completamente. Si es necesario,
filtrar en caliente a través de papel filtro. Añadir la solución de resazurina de sodio, mezclar, envasar y
esterilizar en autoclave. El medio de cultivo puede presentar una zona superficial de color rosa debido
a su oxidación, la cual no debe rebasar la tercera parte del volumen total. Si más de la tercera parte
del medio presenta un colora rosa, antes de su uso, calentar una sola vez en baño de agua hasta que
el color desaparezca. Si el medio de cultivo se almacena efectuarlo a una temperatura de entre 2 y
25 °C en un envase hermético. Incubar el medio líquido de tioglicolato de 30 a 35°C, excepto cuando
se prueban productos que contienen como preservativos derivados del mercurio por el método
directo, en estos casos incubar el medio de cultivo a 20 a 25°C, este medio puede usarse en lugar del
medio de digerido de soya tripticaseína siempre y cuando se valide su uso como se describe en la
Prueba de promoción de crecimiento de aerobios, anaerobios, hongos filamentosos y levaduras.

23. Definir la función de cada ingrediente del caldo tioglicolato.

L-Cistina Agentes reductores, contribuyendo a la prevención de la acumulación de
sustancias nocivas para el desarrollo bacteriano, como lo es el peróxido.
Cloruro de sodio Regulador de la P. osmótica
Glucosa monohidratada/anhidra Carbohidrato
Extracto de levadura soluble en agua Nutriente
Digerido pancreático de caseína Nutriente
Tioglicolato de sodio* Agentes reductores, contribuyendo a la prevención de la
acumulación de sustancias nocivas para el desarrollo bacteriano, como lo es el peróxido.
Solución de resazurina de sodio Es un indicador de óxido –reducción. Esta sustancia es
incolora cuando está reducida y color rosa cuando está oxidada

24. ¿Cuál es la utilidad de adicionar β-lactamasa en los medios para penicilinas y cefalosporinas?
Inactivar el antibiótico de la muestra

25. Explicar la utilidad de “Prueba de adecuación del método”

Para cada preparado farmacéutico los volúmenes de medio de cultivo, diluyente y concentración del
agente inactivante deben determinarse mediante esta prueba.

26. ¿Qué circunstancias motivan a la aplicación de la “Prueba de adecuación del método"?

La prueba de adecuación del método se efectúa:
a) Antes de realizar por primera vez la prueba de esterilidad a un producto.
b) En caso de modificar las condiciones experimentales de la prueba

27. ¿Cuáles son los dos métodos que pueden emplearse en la prueba de esterilidad?
● Método directo
● Método de filtración por membrana
28. Elaborar un diagrama de flujo del método de filtración por membrana.
29. ¿De qué tamaño debe ser el poro de la membrana en la prueba de filtración por membrana?
Utilizar filtros de membrana con un tamaño de poro nominal no mayor a 0.45 μm

30. Elaborar un diagrama de flujo del método directo.

31. ¿Cuál es el tiempo de incubación para la prueba de esterilidad?
Incubar a la temperatura indicada, un número representativo de unidades del lote (se recomienda el 4
% de las unidades) de los medios de cultivo por 14 días.

32. ¿Cómo se interpreta la prueba de esterilidad?

El resultado de la prueba debe ser Ausencia de crecimiento.

TAREA 14 MGA 0100 Valoración microbiológica de antibióticos

1. ¿Cuál es la utilidad de realizar la valoración microbiológica de antibióticos?

En los antibióticos puede haber ligeros cambios químicos que se traducen en pérdida de actividad
antimicrobiana que no pueden demostrarse por métodos químicos, por esta razón, en caso de duda
respecto a la actividad de un antibiótico, los métodos de valoración microbiológica prevalecen sobre
los métodos químicos.

2. ¿Cómo se calcula la potencia o actividad de los antibióticos?

La potencia o actividad de los antibióticos se calcula comparando el grado de inhibición de
microorganismos sensibles y específicos determinada por concentraciones conocidas del antibiótico
analizado y una sustancia de referencia.

3. ¿Cuáles son los dos métodos para valorar microbiológicamente los antibióticos?
● Método de cilindro en placa (difusión en agar)
● Método turbidimétrico.

4. ¿Cuál es el fundamento del método de cilindro en placa o difusión en agar?

Se basa en la difusión del antibiótico desde un cilindro vertical, a través de una superficie con agar
inoculado con el microorganismo de prueba. La difusión origina zonas de inhibición del
microorganismo cuyo tamaño (diámetro) está en relación con la concentración del antibiótico.

5. ¿Cuál es el fundamento del método turbidimétrico?

Se basa en medir espectrofotométricamente el crecimiento del microorganismo de prueba en un
medio de cultivo líquido que permite su rápido crecimiento y en el que al adicionar concentraciones
crecientes del antibiótico se inhibe el crecimiento en forma proporcional a la concentración
adicionada.

6. ¿Qué solución se emplea como diluyente en este método? ***

Medio de cultivo líquido. Solo se emplean diluyentes para las soluciones madre y diluciones de
prueba de la SRef (tabla 0100.10).

7. Elabore un diagrama de flujo sobre el procedimiento del método de difusión en agar.

8. ¿Cómo se interpretan los resultados del método de difusión en agar?
Las comparaciones se limitan a las relaciones entre las condiciones del diámetro de la zona de
inhibición dentro de las placas, sin tener en cuenta la variación entre placas. Las respuestas
individuales de las placas se corrigen basándose en el tamaño relativo de la zona de inhibición de la
SRef (c36) comparado con el tamaño medio de la zona de inhibición de la SRef (c36) en todas las
placas (a,b,d,e).

9. Elabore un diagrama de flujo sobre el procedimiento del método turbidimétrico.

10. ¿Cómo se interpretan los resultados del método turbidimétrico?
Colocar en cada gradilla por lo menos tres tubos para cada concentración de la muestra y la SRef.
Las comparaciones se limitan a las relaciones entre los valores de turbidez observados dentro de las
gradillas.