Laboratorio # 8

Producción de Trichoderma harzianum mediante fermentación solida sobre medio arroz

1. Introducción

Trichoderma harzianum es el hongo más utilizado en el control biológico de fitopatógenos como

Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani y Phytophtora cinnamoni (Sylvia, 1998), se encuentra
distribuido principalmente en suelos con alto contenido de materia orgánica, en la superficie de
raíces de diversas plantas y sobre la corteza en descomposición de ciertas plantas. Trichoderma
harzianum utiliza diferentes mecanismos físicos y bioquímicos para ejercer el control biológico
entre los que se destacan amensalismo, competencia y micoparasitismo (Márquez et al., 2001)

Es un hongo que puede crecer sobre diferentes medios de cultivo comerciales (PDA, Saboreaud,
YPG, entre otros) y subproductos agroindustriales (Arroz, cebada, trigo, suero de leche, etc.)
(Otálora, 2001). La fermentación sobre sustrato sólido supone un crecimiento de los hongos
sobre material orgánico sólido, en la ausencia o baja cantidad de agua libre. Los productos finales
de la fermentación pueden ser conidios y micelio que se mezclan con diferentes materiales como
coadyuvantes y excipientes para obtener una formulación en polvo, granulados o líquidos, que
mantengan sus características como controlador biológico (Doelle et al., 1992).

Por otra parte, los hongos del género Trichoderma en especial la especie harzianum ha sido
ampliamente utilizada alrededor del mundo como organismo de control biológico dadas sus
propiedades de competir por espacio y nutrientes lo que puede realizar debido a su rápida tasa
de reproducción metabólica. Es importante buscar estrategias alternativas que permitan
minimizar el uso de fungicidas y plaguicidas de tipo orgánico debido a la contaminación a largo
plazo que puede ejercer sobre los suelos.

2. Objetivos

2.1. Objetivo General

• Realizar la producción de Trichoderma harzianum mediante fermentación sólida sobre

un sustrato complejo.

2.2. Objetivos Específicos

• Determinar características microscópicas y macroscópicas del microorganismo de

producción.
• Producir un inoculo de concentración conocida en conidios/mL, por medio de la técnica
de desprendimiento con perlas de vidrio.
• Realizar una fermentación sólida para la producción de conidios/g de Trichoderma
harzianum sobre arroz.

3. Reactivos
 • Agar PDA
• Agua destilada con Tween 80 al 0,1% (v/v)

4. Materiales

• Cajas de petri con agar PDA sembradas con T. harzianum.

• Perlas de vidrio
• Tubos de 16X150 mm
• Tubos de 13X100 mm
• Pipetas de 1 mL
• Pipeta Pasteur o pipeta de 5 mL
• Bandeja de Aluminio de 11 X 10,5 X 3 cm 3
• Frascos tapa azul de 100 mL
• Tubos capilares

5. Equipos

• Microscopio
• Cámara de Newbauer

6. Metodología

6.1. Reactivación de la cepa a partir del banco primario

Retirar un tubo eppendorf del refrigerador de 4ºC, dejar a temperatura ambiente antes de
sembrar. Bajo condiciones de esterilidad destapar el tubo, flamear la boca y retirar con asa curva
previamente esterilizada un disco de agar que contiene la cepa preservada. Transferir y sembrar
en disco invertido de tal manera que el micelio quede en contacto con el agar PDA. Incubar las
cajas a 25ºC por 5 días.

6.2. Determinaciones en el Laboratorio

6.2.1. Identificación microscópica y macroscópica

Realizar una preparación con azul de lactofenol y observar al microscopio con lente de 40x, para
verificar la morfología microscópica del microorganismo de producción. Adicionalmente, describir
las características macroscópicas y comparar con la bibliografía.

6.2.2. Obtención de la suspensión concentrada de conidios por desprendimiento

físico y químico con perlas de vidrio y agua destilada con tween 80 al 0,1% (v/v).

Adicionar 19 mL de agua con tween 80 al 0,1% (v/v) a la caja con T. harzianum, colocar las perlas
de vidrio dentro de la caja de petri y con ayuda de una aguja de disección desprender por
remoción física los conidios. Transferir con la ayuda de la pipeta Pasteur la totalidad de la solución
concentrada al tubo de 16X150 mm.

6.2.3. Recuento de conidios/mL en cámara de Newbauer

A partir de la solución concentrada realizar diluciones seriadas 10 -1, 10-2, 10-3. Posteriormente
colocar con la ayuda de un tubo capilar 10 µL de la dilución en la que se va a realizar el conteo
en la cámara y realizar el recuento de conidios/mL utilizando la cuadrícula central contando en
los cuadrados de los extremos y en el central. Para informar tenga en cuenta la fórmula universal
de la cámara de Newbauer:

6.2.4. Inoculación del arroz en bandejas de aluminio como sustrato sólido

Bajo condiciones de esterilidad retirar el vinipel e inocular la totalidad de la solución concentrada

de conidios, distribuir uniformemente sobre el sustrato sólido. Adicionar 50 mL de agua destilada
para humedecer el sustrato y tapar nuevamente. Incubar ppor ocho días a temperatura ambiente.

7. Resultados

7.1. Caracterización macroscópica y microscópica

Tabla 1. Caracterización macroscópica y microscópica de Trichoderma harzianum

Características macroscópicas Características microscópicas
Descripción escrita Descripción escrita

Características microscópicas Características macroscópicas

Representación gráfica Representación gráfica

7.2. Recuento de conidios/mL en cámara de Newbauer

Conidios/mL: _______________________________
 7.3. Muestra de cálculo

Demostrar matemáticamente como realizó los cálculos para cada determinación.

8. Bibliografía:

• Doelle, H., Mitchell, D y Rolz, C. 1992. Solid substrate cultivation. Elsevier Applied
Science, London and New York. 466p.
• Márquez, M. Martínez, M.M, Pedroza, A.M., Franco, M. 2001. Actinomycetes y
Trichoderma hamatum, como microorganismos antagonistas en el control del
marchitamiento vascular del clavel. Ascoflores. 81: 72-78.
• Sylvia. D. J. Furhrmann. P. Hartel & D. Zuberer. 1998. Principles and applications of soli
microbiology, New Jersey. Editions Prentice Hall.

Laboratorio # 9

Evaluación del Producto obtenido mediante fermentación sólida siguiendo el Manual de

Cenicafé

1. Introducción

Los productos a base de Trichoderma harzianum obtenidos por fermentación sólida deben pasar
por varias pruebas de control de calidad para determinar si el producto cumple con los
requerimientos mínimos, que evalúan si la fermentación fue satisfactoria y si es factible su
comercialización o formulación. Ya sea como producto en polvo, líquido o granulado (Dávila y
López, 2002). Por otro lado, también se debe garantizar la efectividad contra los diversos
microorganismos blanco (Márquez et al., 2001). Algunas de las pruebas que se realizan son la
determinación del número de conidios por gramo de sustrato, capacidad germinativa de las
unidades infectivas, porcentaje de pureza y pruebas de antagonismo.

Como técnicas modelo se utiliza el boletín técnico CENICAFÉ publicado por Vélez et al., 1997.
Este documento presenta la metodología detallada para el control de calidad de formulaciones
de hongos entomopatógenos a base de Bauveria bassiana. En esta práctica se hacen algunas
modificaciones para poder extrapolar las técnicas al control de calidad de Trichoderma
harzianum.

2. Objetivos

2.1. Objetivo General

• Realizar el control de calidad a productos obtenidos mediante fermentación sólida de T.

harzianum en medio arroz.

2.2. Objetivos específicos

• Determinar el número de conidios/g de producto obtenido a partir de fermentación sólida.
• Determinar el porcentaje de germinación de conidios de Trichoderma harzianum.
• Determinar el porcentaje de pureza en el producto obtenido por fermentación sólida.
• Determinar las propiedades como controlador biológico de Trichoderma harzianum frente
a Fusarium oxysporum, Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus sp y
Pseudomonas sp.

3. Reactivos

• Agar Agua.
• Agar PDA
• Agua destilada con tween 80 al 0,1% (v/v)
• Azul de Lactofenol
• Agar ISP2.

4. Materiales

4.1. Concentración de Conidios/g de producto

• Paleta
• Erlenmeyer de 250 mL
• Vaso de Precipitados de 250 mL
• Colador plástico mediano
• Gasa de 30 cm X 30 cm
• Tubos de 13 X 100 mm
• Pipetas de 1 mL

4.2. Germinación de Conidios

• Caja de Petri
• Pipeta automática de 1 – 5 µL
• Puntas amarillas
• Láminas portaobjetos
• Láminas cubreobjetos

4.3. Prueba de Pureza

• Cajas de Petri
• Pipetas de 1 mL

4.4. Equipos
 • Microscopios
• Cámara de Newbauer

5. Metodología (Velez et al., 1997)

5.1. Determinación del número de conidios/g de producto

Bajo condiciones de esterilidad retirar el vinipel y adicionar 200 mL de agua destilada con tween
80 al 0,1% (v/v). Posteriormente, remover los conidios con la ayuda del baja lenguas, recuperar
por filtración utilizando el colador y la gasa la suspensión concentrada en un vaso de precipitado.
A partir de la suspensión concentrada preparar diluciones seriadas desde la 10 -1 hasta 10-8 y
realizar el recuento en cámara seleccionando la dilución en la que se observe en promedio más
de 20 conidios por campo microscópico. Emplear la cuadrícula central contando en los 25
cuadrantes. Para obtener el número de conidios/mL utilizar la formula universal de la cámara de
Newbauer. El recuento se debe realizar SEIS VECES. Finalmente, el número de conidios/g de
producto se puede obtener a partir de la siguiente fórmula.

5.2. Determinación del porcentaje de germinación de conidios

Tomar 5 µL de la dilución en la que realizó el recuento y depositarlos en la caja de agar agua
como se muestra en la figura 1. A razón de 5 alícuotas por caja, dejar absorber la muestra por 10
minutos y llevar a incubar 24 horas a 30ºC. En la zona donde se realizó la siembra de las alícuotas
agregar una gota de azul de lactofenol y cortar con bisturí cuadrados de 1 cm X 1 cm. Retirar
cada cuadrado y colocarlo en una lámina portaobjetos, cubriendo el cuadrado de agar con una
laminilla. Posteriormente, enfocar con lente de 40X y contar 100 conidios registrando los
germinados y no germinados en cada cuadrado. Con los datos calcular el porcentaje de
germinación. El valor permitido debe estar por encima del 85%.

5 µL Cuadros
muestra en de 1 cm X
cada punto 1 cm
Figura 1. Determinación del porcentaje de germinación.

5.3. Determinación del porcentaje de pureza

Tomar las diluciones 10 -7 y 10-8, sembrar en superficie 0,1 mL en el agua agar PDA. Incubar las
cajas a 25ºC por siete días y realizar revisiones diarias para verificar la presencia de
microorganismos contaminantes. El porcentaje de pureza se determina utilizando la siguiente
fórmula:

La pureza debe ser superior al 90%.

6. Resultados

6.1. Determinación del número de conidios/g de producto

Tabla 1. Determinación del número de conidios/g de producto

Repeticiones de la lectura en Cámara
Muestra
1 2 3 4 5 6 Σ X

Dilución: _________

Volumen de
solución madre:
_________________

Conidios/g

6.2. Porcentaje de Germinación

Tabla 2. Porcentaje de Germinación de Conidios

Número de conidios observados en las alícuotas
1 2 3 4 5 Totales
G NG G NG G NG G NG G NG G NG G+NG %G

6.3. Porcentaje de Pureza

Tabla 3. Porcentaje de Pureza

Dilución 10-7 Dilución 10-8
 UFC/mL UFC/m UFC/mL UFC/m
Dí Contaminant % de Contaminant % de
Trichoderm L Trichoderm L
a es Pureza es Pureza
a Totales a Totales

6.4. Método de Igarashi

Para la implementación de la técnica de Igarashi seguir la metodología descrita en la figura.

Tenga en cuenta que es muy importante que al realizar la siembra de Trichoderma harzianum en
cada cuadrante medir 3 cm del borde de la caja hacia adentro.

Siembre masivamente
en cada cuadrante Siembre por punción
Trichoderma harzianum central Fusarium
con un asa redonda. oxysporum a 4,5 cm del
Recuerde que el área de borde de la caja
siembra debe ser de 3
cm.
 6.5. Técnica de enfrentamiento

Para la técnica de enfrentamiento se realizarán dos metodologías diferentes. La primera

conocida como enfrentamiento dual, donde observaremos la competencia por espacio y por
nutrientes de Trichoderma harzianum vs Fusarium oxysporum. La segunda corresponde a una
técnica conocida como enfrentamiento por estría.

6.5.1. Enfrentamiento dual

Tome la caja de agar PDA y siembre por punción o disco invertido cada uno de los hongos en un
extremo de la caja. Procure dejar unos 2 a 3 cm desde el borde para hacer la siembra. Verificar
el crecimiento diariamente por 8 días e ir anotando cada uno de los resultados que vaya
observando. Puede utilizar la siguiente imagen como referencia.

Siembre por punción Siembre por punción

central o disco invertido central o disco invertido
de Trichoderma de Fusarium oxysporum
harzianum.

6.5.2. Enfrentamiento por estrías:

Tomar la caja con agar ISP2, y sembrar 0,5 cm de Trichoderma harzianum en el centro de la caja.
Posteriormente, tomar una asada de cada una de las bacterias y sembrar estrías de 0,5 cm de
largo sobre la siembra de Trichoderma. Es muy importante que no se mezclen ni se toquen
durante la siembra para garantizar los resultados.

Escherichia coli Staphylococcus aureus

Trichoderma

Bacillus sp. Pseudomonas sp.

 7. Resultados pruebas de control biológico

7.1. Prueba de antagonismo por Igarashi

Microorganismos Inhibición (mm)

Trichoderma vs Fusarium

7.2. Técnica de enfrentamiento dual

Microorganismos Radio de crecimiento (mm)

Trichoderma vs Fusarium

7.3. Técnica de enfrentamiento por estrías

Microorganismos Inhibición (Positiva o Negativa)

Escherichia coli
Pseudomonas sp.
Bacillus sp.
Staphylococcus aureus

8. Representación Gráfica de los Resultados

Realizar una gráfica integrada en la modalidad de barras que permita visualizar la cantidad de
conidios/g de sustrato, porcentaje de pureza y porcentaje de germinación, obtenidos de la
fermentación sólida.

9. Muestra de Cálculos

Demostrar matemáticamente como se realizaron los cálculos necesarios para las

determinaciones de la práctica.

10. Bibliografía

• Dávila, D., López, L. 2002. Evaluación de diferentes soportes para la preformulación de

un producto termofílico acelerador de compostaje. Trabajo de grado Microbiología
Industrial. Pontificia Universidad Javeriana. 157p.
• Márquez, M., Martínez, M. M., Pedroza, A. M., Franco, M. 2001. Actinomycetes y
Trichoderma harzianum, como microorganismos antagonistas en el control del
marchitamiento vascular del clavel. Ascoflores. 81: 72-78.
 Laboratorio de Biología
Informe No. 7 y 8.

Nombre:
Fecha en que realizó el laboratorio:

Producción de Trichoderma harzianum mediante fermentación solida sobre medio arroz y

Evaluación del producto obtenido mediante fermentación sólida siguiendo el Manual de
Cenicafé

1. Anexe registro fotográfico de los resultádos obtenidos y explique detálládámente que sucedio
en cádá uno de los trátámientos reálizádos. Compáre sus resultádos con reportes de
literáturá. (Discutá los resultádos obtenidos).
2. Respondá todás lás táblás presentes en ámbos informes de láborátorio. Análice los resultádos
obtenidos y determine si sus resultádos corresponden á lo esperádo.
3. ¿Cuáles son lás principáles cárácterísticás que permiten seleccionár á Trichoderma
harzianum como un microorgánismo controládor biologico?
4. ¿Como se dá el comportámiento de ámbos microorgánismos en lá pruebá de enfrentámiento
duál? ¿A que se debe el comportámiento que observo en lás plácás?
5. ¿Que cárácterísticás á nivel de crecimiento, metábolismo y á nivel generál se deben tener en
cuentá párá seleccionár cuálquier microorgánismo como un potenciál controládor biologico?
6. ¿Porque el ágár águá es requerido párá poder observár el porcentáje de germinácion de los
conidios? ¿Podríá reálizár lá pruebá con un medio de cultivo diferente?
7. ¿Que es el ágár Rosá de Bengálá, cuáles son sus componentes y su importánciá á nivel del
ánálisis de pobláciones de hongos y levádurás en lá industriá?