Está en la página 1de 47

PRÁCTICAS DE MICROBIOLOGÍA

2º Curso Licenciatura de Farmacia

Universidad Miguel Hernández


Campus de San Juan

Profesor:
Dr. Francisco Rodríguez Valera
(Catedrático de Universidad, Área de Microbiología)
normas generales de uso del laboratorio

Para el desarrollo de las prácticas es conveniente tener en cuenta algunas normas


elementales que deben ser observadas con toda escrupulosidad:

1. Antes de realizar una práctica, debe leerse detenidamente el guión para adquirir una
idea clara de su objetivo, fundamento y técnica. (Los resultados deben ser siempre
anotados cuidadosamente apenas se conozcan).
2. Accidentes personales, tales como derrame de reactivos, cortes y quemaduras,
deben comunicarse inmediatamente al Instructor.
3. El orden y la limpieza son esenciales en todas las experiencias de laboratorio. En
consecuencia, al terminar cada práctica se procederá a limpiar cuidadosamente el
material que se ha utilizado. Cada grupo de prácticas se responsabilizará de su zona de
trabajo y de su material.
4. Los productos inflamables (gases, alcohol, éter, etc.) deben mantenerse
alejados de las llamas de los mecheros. Si se manejan mecheros de gas se debe
tener mucho cuidado de cerrar las llaves de paso al apagar la llama.
5. Cuando no se utilizan los mecheros, éstos deben guardarse y se debe estar seguro
que se les ha apagado al final de cada laboratorio.
6. Antes de utilizar un compuesto hay que fijarse en la etiqueta para asegurarse de que
es el que se necesita y de los posibles riesgos de su manipulación.
7. Todo el material, especialmente los aparatos delicados, como lupas y microscopios,
deben manejarse con cuidado evitando los golpes o el forzar sus mecanismos.
8. Todos los materiales de desecho que hayan entrado en contacto con
microorganismos (como pipetas usadas, placas petri o tubos), deben colocarse en
bolsas de autoclave preparadas para tal efecto y proceder posteriormente a su
esterilización. Las pipetas Pasteur de cristal y los cubres y portas usados se colocarán
en un recipiente especial para vidrio.
9. Usar siempre “bata” en el laboratorio.
10. Nunca deben sustraerse cultivos de microorganismos del laboratorio.
11. Lavarse las manos con jabón o con un desinfectante si es necesario, antes de dejar
el laboratorio.
…..algunas precauciones:

1. Se debe trabajar en las proximidades de un mechero, PERO SIN QUEMARSE EL


PELO!.
2. Los medios inoculados deben colocarse en las cámaras de cultivo con su
identificación respectiva, ej.: número de mesa, nombre, naturaleza del espécimen o
sustrato del cual se aísla
3. Las pipetas se cogerán de forma que sea el dedo índice el que tape su extremo
superior para regular la caída de líquido.
4. Las cubetas para el espectrofotómetro, y los cubreobjetos y portaobjetos deben
cogerse por los bordes para evitar que se engrasen.
5. Los tubos de ensayo que contengan medios de cultivos o cultivos de
microorganismos, nunca deben abrirse en posición vertical, sino lo más horizontalmente
posible (inclinados) y para quitar el tapón se mantendrán inclinados con una mano y se
abrirán con la otra, que sostendrá a su vez el asa. Una vez abierto, se flamea por
algunos segundos el orificio, repitiendo dicha operación una vez realizada la siembra (el
tapón nunca debe dejarse sobre la mesa).
6. Antes de utilizar las asas con hilos de platino que sirven para las siembras, éstas
deben flamearse al rojo en posición vertical bajo la acción de la llama; también debe
flamearse el mango. Antes de efectuar la siembra debe esperarse algunos segundos a
que se enfríen, pudiendo enfriarse también en el borde de la placa de Petri que contiene
el medio de cultivo. Inmediatamente después de haberlas utilizado, deben flamearse
nuevamente.
Índice:

PRÁCTICA 1
Trabajo en condiciones estériles y manipulación de microorganismos
Medios de cultivo
i. Distintos tipos de medios de cultivo.
ii. Preparación y esterilización de medios de cultivo.
Práctica Día 1

PRÁCTICA 2
Esterilidad y contaminación
o Métodos de esterilización
 Agentes físicos
 Agentes químicos
Aislamiento y recuento de bacterias
i Técnicas de aislamiento para la obtención de cultivos puros.
ii Métodos de recuento y medida del crecimiento
o contaje directo en cámara de recuentos
o Medidas de masa molecular y turbidez
o Densidad óptica en espectrofotómetro
o Otras medidas (peso seco, proteínas, etc.)
o Cuantificación de células viables
Práctica Día 2

PRÁCTICA 3 y 4
Efecto de factores ambientales sobre el crecimiento. Técnicas de incubación.
Microorganismos productores de antibióticos
Instrucciones para el aislamiento de microorganismos productores de antibióticos
Agentes antimicrobianos. Antibiograma
o Características generales de los antibióticos
o Actividad de un antibiótico
o Antibiograma
o Concentración mínima inhibitoria
Diferentes Análisis microbiológicos
i. Microbiología ambiental y sanitaria: Ej. Análisis de agua
ii. Microbiología industrial: Ej. Análisis de alimentos
Microbiología industrial
Métodos de identificación bacteriana
i. Métodos de identificación tradicionales
Sistema de identificación API
Observación de bacterias al microscopio
ii. Microscopia- Microscopios
iii. Tinciones
o Tinciones simples
o Tinciones diferenciales
Tinción de Gram
Práctica Día 3
Práctica Día 4

PRÁCTICA 5: (Sala ordenadores) Algunos enlaces de interés en Microbiología Molecular. BLAST


PRÁCTICA 1
TRABAJO EN CONDICIONES ESTÉRILES Y MANIPULACIÓN DE
MICROORGANISMOS

El trabajo con microorganismos no se realiza con células aisladas, sino con poblaciones extensas y
homogéneas del microorganismo a estudiar, por lo que el microbiólogo utiliza técnicas que permiten obtener un
cultivo puro, y luego cultivar a gran escala dicho microorganismo.

Importancia de:

- La esterilización del material de trabajo (asas de siembra, medios de cultivo, frascos de


toma de muestras, etc.)
- El mantenimiento de un ambiente estéril (mechero bunsen, campanas de flujo laminar) para
la manipulación de microorganismos.

ESTERILIZACIÓN DE ASAS DE SIEMBRA (Figura 1, 2)

Aspectos básicos para:


- toma de muestras
- inoculación o siembra de microorganismos
Siembra por extensión (Figura 3)

MEDIOS DE CULTIVO

DISTINTOS TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el crecimiento de los


microorganismos.

Composición de un medio de cultivo:


- componentes indispensables: agua, nutrientes orgánicos (hidratos de carbono,
aminoácidos, vitaminas, etc.), nutrientes inorgánicos ( P, e, N, Mg, S, etc.)
- componentes alternativos: isosmotizantes (NaCl), agente solidificante (agar-agar),
tampones, indicadores de pH, etc.

Tipos de medios de cultivo:

En función de su consistencia:
- medios líquidos
- medios sólidos (en tubo, en placa)
- medios semisólidos

En función de su composición:
- medios complejos (caldo ordinario, extracto de levadura)
- medios sintéticos
Existen medios de cultivo cuya composición permite el crecimiento de una gran diversidad de
microorganismos (agar nutritivo, caldo ordinario). Otros en cambio, se utilizan para la selección de
determinados grupos de organismos, o se desarrollan para el estudio de determinadas pruebas
fisiológicas o test bioquímicos.
- medios selectivos
- enriquecimientos
- medios para test bioquímicos (utilización de citratos, acidificación a partir de azúcares, etc.).

Ejemplos de medios selectivos:


PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO

Preparación de un medio de cultivo:


- Pesar y disolver los componentes en el medio en el volumen indicado de agua destilada
- Ajustar el pH del medio, si procede
- Para la preparación de medios sólidos se adiciona agar-agar como agente solidificante. Para
asegurar la completa disolución del agar, el medio se calienta hasta ebullición al mismo tiempo
que se somete a agitación previamente a su esterilización en el autoclave.

Esterilización de medios de cultivo:


Una vez preparado el medio, éste se debe esterilizar lo antes posible para evitar el crecimiento
de microorganismos:
- Medios sólidos en placa - tapar el matraz con tapón de algodón graso y cubrir con papel de
aluminio para llevar a esterilizar en el autoclave (121º C, 15-20 min). Una vez estéril repartir el
medio en placas de Petri estériles y dejar en reposo para su solidificación.
(Figura 4)

- Medios sólidos en tubo (agar inclinado) - tras la ebullición del medio con agar, éste se reparte
en los tubos de cristal, de forma que queden llenos hasta aproximadamente la mitad. Los tubos
se cubren con tapón (de aluminio), etc.). Para llevar a autoclavar. Una vez esterilizado, los tubos
se disponen en posición inclinada para su solidificación.
- Medios líquidos – una vez disueltos los componentes del medio en el matraz, repartir en su
caso en tubos a razón de 2-4 ml por tubo, cubrir con tapón y llevar a esterilizar en el autoclave.
Alternativamente, se puede esterilizar el medio en el matraz, y posteriormente repartirlo con la
ayuda de pipetas estériles en tubos de plástico estériles.
- Medios semisólidos – se preparan con concentraciones inferiores de agente solidificante (agar-
agar). El medio se reparte en tubos. En caso de desear proporcionar condiciones anaeróbicas,
existen diversas metodologías para ello. Los medios semisólidos se utilizan para el crecimiento
bacteriano a lo largo del tubo. Los niveles de difusión de oxígeno en las distintas capas
condicionará el crecimiento de distintos tipos de microorganismos (aerobios, anaerobios).
Práctica DÍA 1

PREPARACIÓN DEL MATERIAL A ESTERILIZAR


Colocar un filtro de algodón en el extremo posterior de las pipetas con ayuda de la aguja enmangada
(con precaución de que el algodón no quede excesivamente compactado). Las pipetas deberán ser
autoclavazas empaquetadas. Se debe tomar la precaución de orientar las pipetas, de forma que todas
ellas se puedan extraer posteriormente sin ser expuestas a contaminación.

6 Pipetas Pasteur ------ + algodón --------- empaquetar y marcar ---------- AUTOCLAVAR

PREPARACIÓN / MANIPULACIÓN DE MATERIAL ESTÉRIL (en condiciones estériles / Bunsen)


(suero fisiológico = NaCl al 0,9%)
Con ayuda de pipetas de plástico estériles:
- 4 tubos estériles ---------------------- + 4,5ml de suero fisiológico estéril
o Se usarán en la práctica del día 2 en el Banco de diluciones
- 1 tubo estéril --------------------------- + 6ml de suero fisiológico estéril
o Se usa en la práctica de aislamiento de microorganismos del suelo (ver a
continuación)
- 1 tubo estéril --------------------------- + 8ml de YE (extracto de levadura) estéril
o Se usa para realizar la curva de crecimiento (ver a continuación)

CURVA DE CRECIMIENTO (en condiciones estériles / Bunsen)


- Inocular 1 colonia del organismo en el tubo con 8ml de YE. Usar para ello el asa de platino
esterilizada a la llama del mechero tal como se muestra en la Figura 2.
- Agitar en vórtex.
- Marcar el tubo con el número de mesa.
- Incubar el tubo con el cultivo a 37º C en la cámara de incubación correspondiente.

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEL SUELO (en condiciones estériles / Bunsen)


Por cada mesa:
- Resuspender 0,1-1gr de suelto en el tubo con 6ml de suero preparado anteriormente.
- Agitar bien en vórtex. Dejar sedimentar las partículas.
- Tomar una muestra con pipeta de 2ml estéril y extender con el asa de vidrio (previamente flameada
con alcohol) en 1 placa de Agar Nutritivo. Figura 2 y 3.
- Incubar:
Mesa par: 30º C
Mesa impar: 37º C
(Marcar la placa con el número de mesa y la temperatura de incubación)
PREPARACIÓN DE PLACAS DE MEDIO SÓLIDO
(en condiciones estériles / Bunsen)

Dispensar aproximadamente 20-25ml del medio autoclavado (tras dejar enfriar a 55-60º C) en placas
Petri estériles. 1 botella por cada par de mesas o bancada. Figura 4.

AGAR MAC CONKEY– Marcar como MAC


- Peptona de caseína.......................................... 17,0 g.
- Peptona de carne............................................... 3,0 g.
- Cloruro de sodio............................................... 5,0 g.
- Lactosa........................................................... 10,0 g.
- Sales biliares..................................................... 1,5 g.
- Rojo neutro.................................................... 0,03 g.
- Cristal violeta............................................... 0,001 g.
- Agar.............................................................. 13,5 g.
- Agua destilada c.s.p. .......................................... 1 lt.
- pH = 7,1 ± 0,1

AGAR MUELLER-HINTON – Marcar como MH


- Infusión de carne..........................................5,0 g.
- Caseina hidrolizada.....................................17,5 g.
- Almidón........................................................1,5 g.
- Agar............................................................12,5 g.
- pH = 7,4 ± 0,2

MF – C: Preparar la suspensión – hervir - dejar enfriar a 55-60º C – añadir el ácido rosólico –


homogeneizar – dispensar en placas – Marcar como MF-C

AGAR NUTRITIVO – Marcar como AN


- Extracto de carne..................................... 3,0 g.
- Peptona de carne...................................... 5,0 g.
- Agar....................................................... 15,0 g.
- Agua destilada c.s.p. .................................. 1 lt.
PRÁCTICA 2
ESTERILIDAD Y CONTAMINACIÓN

(Conceptos generales). Esterilización y contaminación. Desinfectantes y antisépticos.

El concepto de esterilización implica la eliminación de todas las formas vivas. Según dicha
definición, estéril significa libre de organismos. Otras metodologías, como desinfección, pasteurización,
etc., conllevan una eliminación parcial de los microorganismos existentes.

Métodos de esterilización:

- Agentes físicos

a) Calor
- Calor seco: flameado, aire caliente (horno Pasteur)
- Calor húmedo: vapor saturado (AUTOCLAVE). En el autoclave la esterilización se produce
mediante vapor de agua a presión. En el autoclave se alcanza una temperatura de 121º C a
una presión de 1 atmósfera sobre la presión ambiental.

Esquema de autoclave
b) Filtración: permite la eliminación de los microorganismos de un medio líquido, sin la destrucción
de estos. Para ello se hace pasar la muestra líquida a través de un filtro de membrana con tamaño
de poro inferior al tamaño de los microorganismos (0,2-0,45 micras). Los microorganismos
quedarán retenidos en el filtro y el fluido obtenido tras la filtración estará estéril.

Micrografías al microscopio electrónico de dos membranas de filtro de diferente tamaño de poro:

Mat-type Millipore BS bacteriological filter, 2 µm pore Mat-type MicronSep bacteriological filter, 0.45 µm pore
dimensions. Bar: 20 µm dimensions. Bar: 2 µm

Micrografías al microscopio electrónico de microorganismos retenidos en los filtros:

Campylobacter jejuni bacteria on a Nuclepore Saccharomyces cerevisiae yeast cells on a Millipore EA filter, 1.0 µm pores. Joined globular
filter with 0.4 µm pores. Bar: 2 µm Millipore BS filter with 2 µm pores. Bar: 5 µm structures are part of the filter. Bar: 5 µm
c) Radiaciones:
- Rayos gamma -. Radiaciones ionizantes
- Rayos Ultravioleta – de escasa penetración y de utilidad para eliminación de
microorganismos de superficies.

Esquema de lámparas de UV Campana de seguridad con UV

- Agentes químicos: para esterilizar material (generalmente algunos tipos de plástico) que son
termolábiles. Como el óxido de etileno y glutaldehído.

Otros métodos de eliminación, si bien parcial, de microorganismos:


- calor: ebullición, pasteurización, tindalización
- agentes químicos: desinfectantes, antisépticos

AISLAMIENTO Y RECUENTO DE BACTERIAS

TÉCNICAS DE AISLAMIENTO PARA LA OBTENCIÓN DE CULTIVOS PUROS

A partir de un cultivo mixto, se pretende obtener un cultivo puro de bacterias, a través de la


obtención de colonias aisladas. Cada colonia representa una población de microorganismos
procedentes de una sola célula, a partir de la cual se posee la seguridad de obtener dicho cultivo puro
de un solo tipo de microorganismo. Para ello se utilizan diferentes técnicas de aislamiento, basadas en
diluir la muestra inicial para obtener colonias aisladas. Una vez que se ha obtenido un cultivo puro, se
puede mantener haciendo resiembras en tubos de agar inclinado o bien congelando las células en
glicerol (10-30%) a -70° C, en Nitrógeno líquido a -173° C, o mediante liofilización.
- Agotamiento. Para obtener colonias aisladas por la técnica del agotamiento la muestra se
extiende sobre la superficie según se indica en la figura, de forma que al final de dicha siembra “por
agotamiento”, la cantidad de inóculo se espera sea lo suficientemente bajo como para que se depositen
células aisladas y distanciadas en la superficie del agar a partir de las cuales surjan, tras incubar,
colonias aisladas.
- Estrías escocesas. Se procede de forma similar al caso anterior, en lo que se respecta al
método general para la siembra en placa y permite también obtener colonias aisladas.

MANIPULACIÓN DE MICROORGANISMOS. Aislamiento en estría (Figura 5)

ESTRÍAS
ESCOCESAS

(2)
(1)

ESTRÍAS POR
AGOTAMIENO

(3)
(4)
- Técnica se aislamiento y recuento. Banco de diluciones. Técnica que consiste en obtener una
suspensión de la mezcla de microorganismos y hacer diluciones seriadas que se vierten en una placa Petri hasta
conseguir colonias aisladas.
Instrucciones: Se debe trabajar, como siempre, en condiciones estériles, flameando la boca de los
tubos antes y después de introducir la pipeta, en las proximidades del mechero.
Mediante una pipeta estéril, tomar una muestra del cultivo mixto, y depositar 1ml en el primer
tubo con 9ml de suero fisiológico ( ó en nuestro caso: 0,5ml en 4,5ml respectivamente) (dilución 10-1).
Agitar hasta conseguir una suspensión homogénea. Tomar otra pipeta estéril, y transferir de esta
primera dilución 0,1ml al siguiente tubo con 10ml de suero fisiológico (10-2), y así sucesivamente. A
partir del tubo con dilución 10-2 y 10-4, con una pipeta estéril , inocular 0,1ml en placa AN extendiendo
la muestra sobre la superficie con el asa de vidrio, la cual se debe esterilizar mediante su introducción
en alcohol y posterior flameado, por lo que se pasa el asa impregnada en alcohol por el mechero y se
deja consumir el alcohol completamente.
Tras incubar se podrán obtener colonias aisladas. El recuento de estas colonias permitirá
conocer el número de células existentes en el cultivo original.

Figura 6: Diluciones seriadas

Ci = N x D x 10
Ci = Concentración inicial (unidades: número de células / ml)
N = nº de colonias
D = dilución
MÉTODOS DE RECUENTO Y MEDIDA DEL CRECIMIENTO BACTERIANO

- Contaje directo en cámara de recuentos


Se basa en el recuento directo del número de células en un volumen determinado, prefijado en
la cámara de recuento, mediante su observación al microscopio. El método no permite distinguir entre
células viables y no viables.
Ejemplo de cámara de recuento

- Medición de la densidad óptica en el espectrofotómetro


Se trata del método más habitual para el seguimiento del crecimiento de un cultivo bacteriano.
La medición de alícuotas o muestras del cultivo a lo largo del tiempo, permite desarrollar curvas de
crecimiento de la población bacteriana. Ello permitirá, a su vez, la comparación de tasas de
crecimiento en diferentes condiciones, el establecimiento de las condiciones óptimas, etc.
El incremento en el número de células es lento al principio y después llega a ser de forma exponencial.
La gráfica anterior es característica de un cultivo en un recipiente cerrado en el que los nutrientes son limitados.
En la curva se distinguen:
1. Fase de latencia. Fase de adaptación de las células a las nuevas condiciones del medio de incubación al que
han sido transferidas. Las células no crecen inmediatamente sino después de este tiempo de latencia. Las
células son metabólicamente activas, se adaptan al medio y eventualmente lo modifican. Para un mismo inóculo,
esta fase de latencia varia dependiendo del medio al que se transfieren y de las condiciones de incubación.
2. Fase de crecimiento exponencial. Fase en la que las células se están dividiendo regularmente a ritmo
constante. En condiciones apropiadas durante esta fase, el grado de desarrollo es máximo. Es en este periodo
donde puede calcularse el tiempo de generación de un microorganismo.
3. Fase estacionaria. El nº de células no se incrementa más porque los nutrientes del medio se van agotando y
posibles sustancias tóxicas pueden ir acumulándose. No hay incremento neto del nº de células, el nº de células
que se originan es igual al nº de las que mueren.

- Recuento de viables
Se determina el número de células capaces de generar colonias sobre la superficie de un
medio sólido. En la práctica habitual se considera que el número de colonias en una placa debe oscilar
entre 30 y 3000, con objeto de que la muestra sea estadísticamente representativa, y evitando que
aparezca crecimiento confluente.
o Mediante la realización de diluciones, en caso de muestras concentradas.
o Mediante técnicas de filtración, de volúmenes determinados, y posterior incubación del
filtro en que han quedado retenidos los microorganismos sobre la superficie de medios
sólidos. Ello permite el uso de medios selectivos para el aislamiento y cuantificación de
determinados grupos de microorganismos.

Recuento de viables
Práctica DÍA 2

Ver resultados del aislamiento de microorganismos del suelo


- comparar si existen diferencias de crecimiento entre 30º y 37º C – anotar los resultados
- observar posibles halos de inhibición del crecimiento de otros microorganismos alrededor de colonias

CURVA DE CRECIMIENTO (en condiciones estériles / Bunsen)


- Tomar 1ml del cultivo en Y.E. creciendo a 37º C con Pipeta Pasteur estéril.
- Medir D.O. en el espectrofotómetro.
- Iniciar la representación de la curva de crecimiento.

AISLAMIENTO EN CULTIVO PURO


A PARTIR DE UNA SUSPENSIÓN BACTERIANA O CULTIVO MIXTO:

Siembras: Ver esquema Figura 5 e instrucciones !!!!!!


- Agotamiento, con asa de platino y en placa de AN
Tomar una muestra del cultivo mixto, con ayuda del asa de siembras previamente flameada.
Debe flamearse la boca del tubo antes y después de tomar la muestra. La muestra se extiende
con suavidad con el asa sobre la superficie del medio de agar nutritivo en placa Petri. Para ello la
placa se destapa ligeramente en las proximidades del Mechero bunsen. Una vez finalizado se
vuelve a tapara la placa y está se dispone en posición invertida para llevar a incubar. Este es el
proceso general para la siembra de placas.
- Estrías escocesas, con asa de platino y en placa de AN
Para obtener colonias aisladas por este procedimiento, según se índice en el esquema,
se realizan una serie de estrías sobre la superficie del medio, tras lo cual se cierra la placa y se
flamea el asa. Con el asa estéril se realizan nuevas estrías arrastrando células de las estrías
anteriores, y por tanto diluyendo la muestra. El proceso se repite varias veces, flameando el asa
entre cada nuevo paso de estrías. Al final se puede realizar un pequeño agotamiento. La placa se
lleva a incubar, invertida, como en el caso anterior. Ello permitirá obtener colonias aisladas.

Incubar a 37º C (Marcar las placas con nº de mesa)

Diluciones: Ver Figura 5 e instrucciones !!!!!!!.


- realizar diluciones con pipeta de 2ml: 0,5ml en 4,5ml de suero fisiológico, según instrucciones.
- en placa de Agar nutritivo, y con asa de vidrio previamente flameada, extender 0,1ml de las
muestras:
- Dilución 10-2

- Dilución 10-4
Incubar a 37º C (Marcar las placas con nº de mesa y la dilución)
ESTERILIZACIÓN
Se pretender comprobar, la eficacia de distintas metodologías para la eliminación de
microorganismos. Para ello se utiliza un cultivo mixto y tras los diversos tratamientos se procede a
sembrar la muestra en placa de agar nutritivo.

A PARTIR DE UNA SUSPENSIÓN BACTERIANA O CULTIVO MIXTO:


- Filtración:
- Filtrar 1-2ml de suspensión bacteriana con ayuda de una jeringuilla estéril y
se hace pasar a través de un filtro de membrana de 0,45 micras de poro.
- Inocular 0,1ml en placa AN con ayuda de una pipeta de 2ml, y extender con
asa de vidrio previamente flameada.
- Efecto de Radiación UV:
- Inocular 0,1ml en placa AN con ayuda de una pipeta de 2ml, y extender con asa de
vidrio previamente flameada.
- levantar la tapa y cubrir la mitad de la placa con papel de aluminio.
- exponer a la lámpara de UV colocando la placa abierta bajo la acción de la luz
ultravioleta durante 5 minutos. Transcurrido este tiempo cerrar la placa.
- PASTEURIZACIÓN:
Es el proceso de destrucción de las bacterias patógenas que pueden existir en un líquido mediante el
calor, generalmente usado en el tratamiento de líquidos alimenticios, alterando lo menos posible la
estructura física y los componentes químicos de éste. En 1862, el químico francés Louis Pasteur creó el
proceso que lleva su nombre, comprobando que calentar ciertos alimentos y bebidas por encima de los
60º C evitaba su alteración, al disminuir de manera sensible el número de microorganismos presentes en
su composición. Se usa para fundamentalmente para destruir microorganismos dañinos en productos
comestibles. Posteriormente, los productos se sellan herméticamente con fines de seguridad. El avance
científico de Pasteur mejoró la calidad de vida al permitir que productos como la leche pudieran
transportarse sin descomponerse.

- Tomar 1 ó 2ml de la suspensión bacteriana.


- Tratar a 63º C durante 30 minutos.
- Inocular 0,1ml en la placa de AN, extender con asa de vidrio
previamente flameada.

Louis Pasteur

Incubar a 37º C. (Marcar las placas con nº de mesa y proceso)


PRÁCTICA 3 / 4
EFECTO DE FACTORES AMBIENTALES SOBRE EL CRECIMIENTO. TÉCNICAS DE INCUBACIÓN

Los distintos factores ambientales (temperatura, pH, oxígeno, concentración de solutos u


osmolaridad, etc.) afectan al crecimiento microbiano. Se debe, por tanto, tener en cuenta las
condiciones en que se debe cultivar un determinado tipo de microorganismos.

TEMPERATURA: En función de su espectro de crecimiento respecto a la temperatura, distintos tipos


de microorganismos crecerán con distintas tasas de crecimiento a una determinada temperatura. Ello
puede ser utilizado como base para el aislamiento de organismos psicrófilos, mesófilos o termófilos. Se
incubarán muestras de diversos orígenes (suelo, agua, alimentos y cultivos mixtos y puros) a distintas
temperaturas en medio sólido (agar nutritivo, medios selectivos) y se comparará el crecimiento y tipos
de microorganismos obtenidos tras su incubación.

OXÍGENO: Existen métodos para proporcionar una mayor o menor oxigenación en función del tipo de
microorganismos que se desee cultivar. Los medios líquidos permiten una mayor difusión del oxígeno
hacia las capas inferiores que los medios sólidos. Se utilizan medios semisólidos para el crecimiento
bacteriano a lo largo del tubo. Los niveles de difusión de oxígeno en las distintas capas condicionará el
crecimiento de distintos tipos de microorganismos (aerobios, anaerobios estribitos, anaerobios
facultativos, microaerófilos).

Incubación de bacterias aerobias

- Medio líquido:
o Tubo - horizontal o inclinado con agitación
o Matraz – con poca cantidad de medio, con agitación o burbujeo
- Medio sólido
o Placa – en superficie
o Tubo – agar inclinado (crecimiento en superficie)
Incubación de bacterias anaerobias
- Medio líquido
o Tubo vertical con agente reductor (tioglicolato sódico)
- Medio sólido
o Placa – en el interior de jarra de anaerobios o en estufa de anaerobios
o
- Medio semisólido
o Tubo – en tubo vertical. El medio se somete a ebullición, con objeto de eliminar el
oxígeno, previamente a la inoculación de la muestra. Se puede adicionar entonces un
agente reductor. Tras haber sembrado la muestra por picadura, se sella la parte
superior del medio (con glicerina estéril).

Jarra de anaerobios Cámara de anaerobiosis

MICROORGANISMOS PRODUCTORES DE ANTIBIÓTICOS

Los antibióticos son productos del metabolismo secundario de diversos grupos de


microorganismos (hongos como Penicillium, o bacterias fundamentalmente del grupo de los
actinomicetos, como Streptomyces, u otras bacterias del suelo), y que matan o inhiben el crecimiento
de otros microorganismos. La modificación de estos compuestos naturales permite la obtención de
nuevas variaciones de antibióticos.
Sir Alexander Fleming descubrió las propiedades inhibitorias bacterianas de un producto
metabólico de Penicilium notatum. Llamo a la sustancia penicilina. En 1929, su descubrimiento abrió la
era de los antibióticos. Por sus contribuciones, Fleming fue condecorado y compartió del Premio Nobel
de Fisiología o Medicina en 1945.
INTRUCCIONES para el aislamiento de microorganismos productores de antibióticos:

1. Se resuspende aproximadamente 0,1 – 1 gr. de una muestra de suelo en 10ml de suero fisiológico
estéril. Se siembra 0,1ml en placas de agar nutritivo, se extiende la muestra, y se incuban a
diferentes temperaturas: temperatura ambiente, 30º C y 37º C (24h – 48h).
2. Se observa la presencia alrededor de colonias de halos de inhibición del crecimiento de otros
microorganismos (de la propia muestra de suelo, o bien tras cubrir con una doble capa de una
organismo indicador).
3. La colonia de microorganismo productor seleccionada se
siembra en una nueva placa: por estría en un lados de
la placa según figura. Se incuba durante 24h. con
objeto de permitir la producción de antibiótico.

4. Una vez crecido el microorganismo productor y difundido


el antibiótico, las cepas indicadoras como posibles
susceptibles se siembran por estría perpendicularmente
al productor. Como cepas indicadoras posiblemente
susceptibles se utilizan cepas de diversos grupos
bacterianos Gram positivos y Gram negativos (ej.:
Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus
aureus, Bacillus subtilis). Se incuba 24h a 37º C.

5. Se observan las zonas de inhibición del crecimiento de


las cepas indicadoras.

FIGURA 7
AGENTES ANTIMICROBIANOS. ANTIBIOGRAMA

- Antibióticos y otros antimicrobianos


- Actividad bacteriostática o bacteriolítica
- Antibiograma
- Concentración mínima inhibitoria

Los antibióticos son compuestos orgánicos de bajo peso molecular sintetizados por microorganismos, que
a bajas concentraciones inhiben el desarrollo o matan a otros microorganismos.

CARACTERÍSTICAS GENERALES
1. Inhiben el crecimiento (bacteriostáticos) o matan (bactericidas).
2. Son efectivos a bajas concentraciones.
3. Poseen toxicidad selectiva: actúan sobre el patógeno sin afectar al organismo hospedador.
4. Pueden actuar frente a procariotas o eucariotas.
5. Pueden ser de acción muy específica o de amplio espectro.
6. Solubles en agua.
7. Poseen estabilidad química.
8. Son productos del metabolismo secundario.
Es importante tener en cuenta la posibilidad de aparición de resistencia a determinados antibióticos en algunos
microorganismos durante el tratamiento de una infección.

MICROORGANISMOS PRODUCTORES
Se encuentran tanto dentro del grupo de procariotas como en el de eucariotas.
Procariotas: Bacillus, Streptomyces, Nocardia
Eucariotas: Penicillium, Aspergillus, Cephalosporium

CLASIFICACIÓN
Hay muy diversas clasificaciones:
Según su origen
• naturales: sintetizados por microorganismos.
• sintéticos: obtenidos completamente por síntesis química.
• semisintéticos: parte de compuesto sintetizada por microorganismos y otra parte sintetizada químicamente.
Según su estructura química
• ß-lactámicos: penicilinas, cefalosporinas.
• macrólidos: eritromicina.
• aminoglucósidos: estreptomicina.
• polipeptídicos: bacitracina.
• poliénicos: anfotericina B
• tetraciclinas
• derivados del benceno: cloranfenicol.
Según su mecanismo de acción
• actúan sobre la pared celular bacteriana inhibiendo su síntesis: penicilinas.
• actúan sobre la membrana celular alterando su permeabilidad.
• inhiben la síntesis proteica.
• inhiben la síntesis de ácidos nucleicos: mitomicina.

Los antibióticos en general pueden ser de amplio espectro o de espectro reducido, estos
últimos van a matar gérmenes más específicamente. Dependiendo del origen o localización de la
infección, se va a utilizar uno u otro. Por ejemplo en una infección de garganta no se debería utilizar
uno de amplio espectro ya que mataría también a la microbiota tan importante para nosotros.

Actividad de un antibiótico:
Ejemplo de tres tipos de acción de agentes antimicrobianos. En el tiempo indicado por la flecha, se
añadió una concentración inhibidora del crecimiento, a un cultivo en fase exponencial de crecimiento.
Observar la relación entre células viables y número total de células

BACTERIOSTÁTICO BACTERIOLÍTICO BACTERICIDA


Antibiograma:
Consiste en el estudio de la sensibilidad o resistencia de determinado microorganismo (o grupo
de ellos) a varios antibióticos. Se puede utilizar para tratar un patógeno, añadir a alimentos, en
definitiva para saber como se comporta un germen frente a determinado antibiótico.
El antibiograma se puede hacer tanto en medio líquido como en medio sólido. En nuestro caso
vamos a utilizar un agar ordinario pero modificado de manera que gérmenes y antibióticos puedan
difundir correctamente: agar de Muëller-Hinton.

Actividad antibiótica por difusión en agar Actividad antibiótica por crecimiento en césped. FIGURA 8

Se siembra la cepa de
interés en la superficie de
una placa de medio Mueller
Hinton, realizando la
extensión con ayuda de un
hisopo estéril (o asa de
siembra) de forma que se
obtenga un crecimiento
confluente o en césped
distribuido homogéneamente.

Con ayuda de unas pinzas


metálicas (esterilizadas mediante
flameado con alcohol), se depositan
los discos de los distintos
antibióticos sobre la superficie

Se incuban las placas a 37º C durante 24 horas.

Se observan los halos de inhibición de cada uno de los


antibióticos ensayados sobre la cepa correspondiente. El
diámetro del halo de inhibición del crecimiento se utiliza como
indicativo de la sensibilidad o resistencia a cada antibiótico.
- Concentración mínima inhibitoria

En el manejo de estos agentes


terapéuticos se utilizan dos términos
muy importantes:

* Concentración mínima inhibitoria


(CMI): Se trata de la dosis mínima con
la que un fármaco inhibe el crecimiento
de un determinado patógeno, y es
indicativa de la eficacia del antibiótico

* Concentración mínima letal (CML):


Concentración más baja a la que un
fármaco mata al patógeno

DIFERENTES ANÁLISIS MICROBIOLÓGICOS

MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL Y SANITARIA: ejm. ANÁLISIS DE AGUA

Muestras líquidas: Aguas


En el agua pueden encontrarse una gran variedad de microorganismos, los cuales afectan en
mayor o menor medida a la potabilidad del agua y a sus características organolépticas. Además de la
flora normal (Bacillus, Pseudomonas, etc.), en el agua pueden existir microorganismos contaminantes.
Una de las fuentes principales de contaminación son las aguas residuales que contienen heces que
pueden ser vehículo de transmisión de patógenos. La presencia de indicadores de contaminación
fecal (Escherichia coli, Enterococcus faecalis) revela la existencia de contaminación fecal, y por tanto la
posibilidad de que se encuentren presentes patógenos de transmisión oral-fecal.

El agua se considera potable si los valores obtenidos en los ensayos están dentro de los límites establecidos por la ley.
Las normas legales vigentes exigen:
• Aerobios totales: No existe límite legal pero los valores máximos recomendados son:
Aerobios a 37° C: 10 /ml. Aerobios a 22° C: 100 por ml.
• Coliformes: Coliformes totales: < 1 / 100ml. Coliformes fecales: < 1 / 100ml.
• Estreptococos fecales: < 1 / 100ml.
• Clostridios sulfito reductores: < 1 / 20 ml.

Aparte del problema de transmisión de enfermedades, la contaminación del agua también acarrea otras
consecuencias. Por ejemplo, la degradación biológica por los microorganismos de grandes cantidades de residuos
orgánicos vertidos al agua hace disminuir rápidamente el oxígeno existente, creando un ambiente desprovisto de toda forma
de vida que no sea anaeróbica: mueren los peces, disminuye la vida vegetal y se produce el hedor característico debido a
las actividades de los microorganismos anaerobios.
En esta práctica tratamos de simular un aislamiento de microorganismos a partir de una
muestra (agua o alimentos contaminados...), para identificarlos posteriormente mediante un conjunto
de pruebas. Concretamente, vamos a realizar la determinación de bacterias pertenecientes al grupo de
bacilos Gram (-) anaerobios facultativos, en el que se incluyen las enterobacterias. Muchas de ellas
forman parte de la flora normal del tracto digestivo del hombre pudiendo producir enfermedades en
determinadas circunstancias. Otros como Salmonella o Vibrio pueden causar enfermedades por la
ingestión de alimentos o agua contaminados. De ahí la necesidad de desarrollar pruebas que permitan
aislar e identificar rápidamente estos microorganismos.

GRUPO DE BACTERIAS GRAM (-) ANAEROBIAS FACULTATIVAS


Son bacilos o cocobacilos, pueden crecer en presencia o en ausencia de O2 son pues
anaerobios facultativos. En anaerobiosis obtienen la energía por fermentación. En este grupo se
incluyen las familias Enterobacteriaceae y Vibrionaceae.

FAMILIA Enterobacteriaceae: Forma: bacilos, cocobacilos / Movilidad: inmóviles o móviles por


flagelos peritricos / Catalasa (+) / Oxidasa (-). La mayoría de enterobacteriáceas pueden fermentar
glucosa y otros azúcares. La capacidad o no para fermentar algunos sustratos se utiliza para la
identificación de las distintas especies. Por ejemplo, Escherichia coli, Klebsiella, Enterobacter
fermentan la lactosa, mientras que Salmonella, Shigella, Proteus no fermentan la lactosa.

FAMILIA Vibrionaceae: Forma: bacilos ligeramente curvados. Movilidad: móviles por flagelos polares.
Catalasa (+) / Oxidasa (+) . Las vibrionáceas crecen bien en medio alcalino. La mayoría son inofensivas
y se encuentran en ambientes acuáticos. Algunos son patógenos, como Vibrio cholerae que es el
agente causal del cólera.

Para este tipo de análisis se puede proceder:


- mediante realización de una siembra directa, o tras dilución, en caso de muestras
con alta carga microbiana.
- mediante filtración de una volumen determinado de la muestra (10ml, 50ml, 100ml)
(en caso de muestras con escasa concentración microbiana) a través de un filtro de
membrana de 0,2 – 0,45 micras y posterior incubación del filtro depositado sobre un medio
de cultivo sólido (agar nutritivo para bacterias totales, medio selectivos para distintos
grupos bacterianos como MacConkey para enterobacterias, etc.).
En esta práctica se investigará:
- la presencia de bacterias aerobias
totales (en agar nutritivo, incubación
a 37º C, o a 30º C)
- la presencia de enterobacterias (agar
MacConkey, 37º C)
- la presencia de coliformes fecales
(medio MF-C, incubación a 45.5º C)

Muestra sólidas: alimentos


Para analizar este tipo de muestras se procederá a homogeneizar la muestra y resuspensión
de microorganismos en suero fisiológico estéril (ej: 1 gr de muestra en 10-50 ml de suero), tras lo cual
se realizaría una siembra directa de la suspensión obtenida en medio selectivo.

Microbiología de productos lácteos y productos fermentados.


Detección de microorganismos (como bacterias del ácido láctico) utilizados en la industria para
la obtención de derivados lácteos (queso, yogur, kefir, mantequilla) y diversos productos fermentados
(aceitunas españolas, pepinillos).
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

Los microorganismos pueden ser considerados en términos generales con dos criterios que son
antagónicos:
- Uno corresponde a las actividades útiles que tienen algunos para obtener bienes o servicios
- y otro completamente distinto corresponde a los efectos perjudiciales que ocasionan que están
generalmente asociados a la producción de enfermedades, tanto en el hombre como en los animales, y que
también se pueden extender al deterioro producido sobre alimentos y materiales diversos.

La Microbiología Industrial se ocupa fundamentalmente de las actividades útiles de los


microorganismos.

Un poco de historia:
Las aplicaciones de los microorganismos datan de tiempo inmemorial. El hombre hizo uso de ellos sin
saber que éstos existían desde que inventó o descubrió al azar la manera de hacer cerveza, vinagre, vino o pan.
La cerveza era conocida antes del 6000 a.C. por sumerios y babilonios, y en el antiguo Egipto existía ya
verdadera producción en 1700 a.C.; el vinagre se producía desde antes de esa fecha y el vino es también muy
antiguo, ya que existe evidencia de su producción antes del 2000 a.C. en Egipto y China, y finalmente el pan se
conoce desde 4000 a.C. aproximadamente. A partir de 1900 comienza la etapa de producción de una serie de
productos nuevos que se suman a los conocidos desde la más remota antigüedad, y que son la levadura de
cerveza, glicerol, ácido láctico, acetona butanol y etanol. Hasta el 1945 poco se esperaba del futuro de la
Microbiología Industrial, ya que solamente unos pocos productos eran fabricados con microorganismos. Con el
descubrimiento de la penicilina en 1945 y la necesidad de su producción, se produce un impacto formidable
sobre los procedimientos microbiológicos, ya que se plantea el desafío de la producción en gran escala en
condiciones de mucho mayor control y con necesidad de operaciones más complejas para la separación y
purificación de los productos. Como consecuencia de los avances logrados en esos desarrollos se produce en
pocos años la aparición de un gran número de nuevos productos, como otros antibióticos, aminoácidos,
esteroides, enzimas, biomasa aplicada a la alimentación animal y humana (proteínas unicelulares), nucleótidos,
etc. A partir de 1979 la Microbiología Industrial recibe un nuevo y notable impulso que se suma al anterior
cuando se concretan a nivel de procedimientos prácticos las posibilidades que ofrece la ingeniería genética,
disciplina surgida como consecuencia del avance de la Biología Molecular. Este nuevo impulso posibilita la
producción industrial, basada en la utilización de microorganismos recombinantes, de sustancias nuevas
nunca producidas antes por esa vía como la insulina.

La Microbiología Industrial abarca todos aquellos procesos que se realizan con microorganismos. En
Microbiología Industrial se utilizan los términos fermentación y fermentaciones industriales, para caracterizar a
los procesos o tecnologías basados en el uso de microorganismos. El término "fermentación", que deriva del
latín fermentar (hervir), inicialmente reservado a la actividad microbiana anaerobia, se fue aplicando asimismo a
procesos aerobios y finalmente también a aquéllos que utilizan células animales y vegetales. El estudio de los
microorganismos de interés industrial, se centra en la selección, mantenimiento y mejoramiento de los
microorganismos, ya que es muy importante el aumento de la productividad de las cepas empleadas.
MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN BACTERIANA

La correcta detección e identificación de los microorganismos presentes en muestras clínicas o


de otros orígenes es imprescindible para determinar el origen de las infecciones, seguir el curso de las
enfermedades y decidir los tratamientos a aplicar. Todos los puntos del proceso son importantes,
desde la forma de tomar y mantener las muestras hasta su manipulación en el laboratorio.
Se puede decir que en el proceso de identificación de microorganismos se ponen en juego
todos los conocimientos acumulados en Microbiología. La identificación de bacterias puede basarse en
muchos caracteres: morfológicos, fisiológicos, bioquímicos, de tipo serológico y de patogenicidad.
Morfología celular:
• Forma (bacilos, cocos) y agrupamiento (diplococos, racimos, rosarios).
• Tinción (Gram, ácido-alcohol resistentes...)
• Estructuras especiales: flagelos, endosporas
Morfología de las colonias:
• Forma, color, consistencia, borde, sección...
Fisiología:
• Aerobios, anaerobios, anaerobios facultativos
• Temperatura óptima de crecimiento
• Movilidad
Bioquímica:
• Presencia o ausencia de una enzima o de toda una ruta metabólica.
• Fermentación de carbohidratos
• Utilización de citratos como única fuente de carbono
Técnicas Moleculares:
• Sondas para hibridación o para amplificación en PCR. Análisis filogenético mediante secuenciación
de 16S rRNA.

MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN TRADICIONALES

Identificación de enterobacterias: Como ejemplo, diversos géneros y especies de enterobacterias se


identificarán mediante:
- Aislamiento en medio selectivo (MacConkey)
- Tinción de Gram
- Sistema de identificación API

Prueba de la oxidasa: Una varilla de identificación de la actividad oxidasa se pone en contacto con
una masa bacteriana de la cepa a ensayar.
SISTEMA DE IDENTIFICACIÓN API.
La batería de pruebas API20E es un sistema de identificación rápida para bacterias de la
familia Enterobacteriaceae y otras bacterias Gram(-). Básicamente consta de 23 tests bioquímicos
estandarizados y miniaturizados y una base de datos. Este sistema presenta las ventajas de ser rápido,
eficaz y de permitir realizar numerosas pruebas a la vez. Cada tira de API 20E contiene 20 microtubos
o pocillos con distintos sustratos deshidratados. Cada tubo es una prueba bioquímica distinta (ver tabla
"sumario de los resultados con API 20E "). Los microtubos se inoculan con una suspensión de
microorganismos, en agua o solución salina, que rehidrata los medios. Las tiras se incuban a 37° C y
por efecto del metabolismo bacteriano se van a producir cambios de colores espontáneos o bien al
añadir reactivos. La lectura de las reacciones se hace mediante comparación con una tabla de lectura
donde se indica si los

Instrucciones API. FIGURA 9

1.- Se humidifica el sistema mediante


adición de agua destilada en los pocillos de
la base de plástico transparente.

2.- Se toma con el asa de siembras una colonia de la cepa a


analizar y se resuspende en 5ml de suero fisiológico estéril. Se
homogeneiza la suspensión.

3.- Con ayuda de una pipeta Pasteur estéril (y chupetín) se


rellenan los pocillos del sistema de identificación según las
indicaciones. Hasta el borde del tubo en todos los casos
excepto:
-en los marcados con el rectángulo abierto [_] en los que se
rellena también la cúpula (CIT, VP, GEL).
- en el caso de los tubos marcados con subrayado _ (ADH, LDC, ODC, H2S, URE), se
realizará anaerobiosis mediante adición de parafina estéril rellenando la cúpula del tubo (una
vez lleno el tubo con la muestra).
Se incuba a 37º C durante 18-24 h
Se observan los resultados de las pruebas bioquímicas en cada pocillo o microtubo:
- Tras observar el resultado de la reacción de fermentación de la glucosa en el tubo GLU ( y
anotar en hoja de resultados), en este mismo tubo se observa la reacción de reducción de
nitratos (mediante la adicción de los reactivos NIT-1 y NIT-2 sucesivamente).
- Se adicionan los reactivos indicados en los tubos correspondientes (TDA, IND, VOP-1 + VP-2)
- Los resultados se comprueban en tabla de identificación o programa de identificación. (Ver
fotocopias adjuntas al final)

OBSERVACIÓN DE BACTERIAS AL MICROSCOPIO

MICROSCOPÍA- MICROSCOPIOS

El microscopio es uno de los instrumentos más necesario para un microbiólogo, ya que permite
la observación de organismos que no pueden ser apreciados en detalle a simple vista, es decir de los
microorganismos. Existe una gran variedad de microscopios que, según la fuente de iluminación
utilizada, se agrupan en:

• Microscopios ópticos: La fuente de iluminación es la luz.

- De campo claro. Permiten la observación de preparaciones, en su color natural o contrastadas mediante


tinciones, resaltadas sobre un fondo más brillante.
- De campo oscuro. Permiten la observación de formas celulares que destacan brillantes sobre un fondo
oscuro. Este efecto se consigue utilizando diafragmas especiales.
- De contraste de fases. Gracias a la
utilización de diafragmas y objetivos
especiales, que consiguen aumentar
las diferencias en el índice de
refracción de las células y el medio
que las rodea, permiten la
observación de células vivas, ya que
no es necesario realizar ninguna
tinción de las mismas.
- De interferencia. Permiten observar
células vivas sin teñir, obteniéndose
una imagen en relieve de las mismas.
- De fluorescencia. La fuente de
iluminación proporciona luz
ultravioleta que excita ciertas
moléculas presentes en las células
(bien de forma natural o añadidas a la
preparación) que emiten
fluorescencia en el espectro visible.

• Microscopios electrónicos: La fuente de iluminación es un chorro de electrones y las lentes son


electroimanes.

- De transmisión. Permiten la observación de muestras teñidas con sustancias que son resistentes al paso de
electrones y cortadas dando lugar a láminas finas, denominadas cortes finos. Los electrones no son visibles
directamente por lo que éstos se envían a una pantalla que emite fluorescencia más o menos intensa según
el número de electrones que inciden en ella. Las estructuras celulares que se tiñan más intensamente
impedirán el paso de electrones y por lo tanto no permitirán la emisión de fluorescencia, por lo que estas
estructuras aparecerán oscuras en un fondo más brillante. Se consiguen entre 10.000 y 100.000 aumentos.
- De barrido. Permiten la observación de células enteras, sin necesidad de cortes finos, de modo que
aparecen los relieves originales y las superficies externas. Alcanzan entre 1.000 y 10.000 aumentos.
Durante las prácticas se empleará el microscopio óptico de campo claro, cuyos componentes
fundamentales (mecánicos, de iluminación y ópticos) se muestran en la figura anterior.

Para aumentar el límite de resolución, normalmente se utiliza aceite de inmersión. Es importante


recordar que no todos los objetivos son impermeables al aceite, sólo si lo son puede utilizarse este
producto. En los microscopios que se utilizarán en las prácticas, ¡¡sólo puede utilizarse el aceite de
inmersión con el objetivo de 100 aumentos!!.
PREPARACIONES DE OBSERVACIÓN EN FRESCO
- A partir de cultivos en medio líquido: cargar el asa bacteriológica con una gota de cultivo en
medio líquido, depositarla en el portaobjetos y cubrir con un cubreobjetos (procurando que
no queden burbujas de aire).
- A partir de cultivos en medio sólido: colocar una gota de agua sobre el portaobjetos con
ayuda del asa. Cargar el asa (estéril) con una pequeña cantidad de bacterias de una colonia
y resuspenderlas en la gota de agua.
Observar bacterias vivas al microscopio con el objetivo de inmersión (con una gota de aceite de
inmersión), observar motilidad, etc.

TINCIONES

Son técnicas que permiten observar microorganismos en función de la capacidad de los mismos para
retener (o no) determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la célula y del
colorante.
PREPARACIÓN DE EXTENSIONES DE CULTIVOS BACTERIANOS PARA TINCIONES
A partir de cultivos en medio líquido o bien en medio sólido, se procede como en el caso de la
preparación en fresco:
- Extender la suspensión con el asa hasta conseguir una capa fina.
- Secar la preparación acercándola a la llama del mechero, evitando que se caliente
demasiado, para no afectar a la estructura y forma normal de los microorganismos (se comprueba
con el dorso de la mano que no está demasiado caliente).
- Una vez seca la preparación se procede a la fijación de la muestra, haciendo pasar la
preparación 3-4 veces por la llama del mechero (la llama debe tocar la parte inferior del
portaobjetos).
- Una vez seca y fijada la preparación, se procede a su tinción y posterior observación.

TINCIONES SIMPLES
Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las células tienen una composición
química diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente a un
colorante. Ejem: Azul de metileno, safranina… etc.
Una vez fijada la preparación (tras esperar que se enfríe), cubrir con el colorante durante 1 minuto, lavar
a continuación abundantemente con agua destilada, y secar con papel de filtro. Observar al microscopio.

TINCIONES DIFERENCIALES
Se basan en el hecho de que distintos tipos de células tienen distinta composición química, y
por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tinción, lo que permite clasificar los
microorganismos en diferentes grupos, según su capacidad de tinción. En este apartado están dos
tinciones de importancia taxonómica y médica: la tinción de Gram y la de ácido-alcohol resistencia (de
Ziehl-Neelsen). Estas tinciones utilizan más de un colorante.

Tinción de Gram:
El fundamento radica en la diferente estructura
de la pared celular de ambos grupos: las bacterias
Gram+ tienen una gruesa capa de peptidoglicano en su
pared, mientras que las bacterias Gram- tienen una
capa de peptidoglicano más fina y una capa
lipopolisacarídica externa. Tras la tinción con el primer
colorante (Cristal violeta) se efectúa un lavado con
etanol que arrastrará al colorante sólo en las Gram (-),
mientras que en las Gram (+) el colorante queda
retenido y las células permanecerán azules. Las
células Gram (-) se teñirán después con un colorante
de contraste (safranina) para que puedan observarse.

foto de tinción mixta foto de Bacillus (G+) foto de Enterobacteria (G-)

Instrucciones para la tinción de GRAM


- Cubrir la preparación con violeta de genciana y mantener
durante 1 minuto.
- Escurrir el colorante y cubrir con lugol. Dejar actuar durante 1
minuto. Lavar con agua
- Decolorar con alcohol-acetona durante 15 segundos.
- Cubrir con el colorante de contraste (safranina). Dejar actuar
durante 1 minuto. Lavar con agua y secar la preparación.
- Observar al microscopio (objetivo de inmersión, recordar usar
aceite de inmersión).
Tinción de endosporas:
Las bacterias de los géneros Bacillus y Clostridium se caracterizan porque forman endosporas.
Las endosporas son formas de resistencia que garantizan la supervivencia de la especie ante
situaciones adversas (agotamiento de nutrientes, cambios de temperatura, acumulación de metabolitos
tóxicos...). Estas estructuras, que contienen una copia completa del genoma, se desarrollan en el
interior de la célula bacteriana, pudiendo alcanzar un diámetro considerablemente mayor que el de la
célula. La célula acaba por lisarse y morir dejando libre a la espora. Las endosporas germinarán
cuando las condiciones ambientales vuelvan a ser favorables. Algunas enfermedades muy conocidas
son producidas por especies de los géneros Clostridium: y Bacillus: C. tetani (tétanos), C. perfringens
(gangrena gaseosa), C. botulinum (botulismo), B. anthracis (antrax).
- Cubrir el portaobjetos con una solución de verde de malaquita (en abundancia), y calentar
hasta la emisión de vapores. Mantener durante 3 minutos. Lavar con agua.
- Cubrir con safranina como colorante de contraste. Dejar actuar 1 minuto. Lavar con agua y
secar.
- Observar al microscopio (objetivo de inmersión).

Las esporas aparecen teñidas de verde y las células vegetativas de rosa.

Tinción de ácido-alcohol resistencia (Ziehl-Neelsen):


Se basa en que ciertos microorganismos no son desteñidos por una mezcla de ácido y alcohol si
han sido previamente teñidos con fucsina fenicada. Se dice que son microorganismos ácido-alcohol
resistentes. Una vez realizada la decoloración con esta mezcla se utiliza un colorante de contraste (el
Azul de metileno) para poder observar las células sensibles a la decoloración por ácido-alcohol. Son
microorganismos ácido-alcohol resistentes las micobacterias, por la específica composición de su
pared celular, y algunos actinomicetos, como Nocardia. Algunos microorganismos patógenos son
ácido-alcohol resistentes: Mycobacterimum tuberculosis (tuberculosis), M. leprae (lepra).
- Cubrir la preparación con fucsina fenicada y calentar hasta la emisión de vapores. Dejar actuar
durante 5 minutos cuidando que no se deseque la preparación. Lavar abundantemente con
agua.
- Decolorar con la solución de ácido-alcohol durante 10-20 segundos. Lavar con agua.
- Teñir con azul de metileno como colorante de contraste durante 2 minutos. Lavar y secar la
preparación.
- Observar al microscopio.

Las células ácido-alcohol resistentes permanecen teñidas de fucsia, ya que retienen el primer
colorante, mientras que las no resistentes se decoloran con el ácido-alcohol y se teñirán de azul con el
colorante de contraste.
Práctica DÍA 3

Ver resultados del aislamiento en cultivo puro:


- Agotamiento
- Estrías escocesas
- Diluciones: realizar recuento

Ver resultados de la esterilización:


- Filtración
- UV
- pasteurización

CURVA DE CRECIMIENTO- adición de antibiótico (en condiciones estériles / Bunsen)


- Tomar 1m de cultivo con Pipeta Pasteur estéril y medir D.O y anotar.
- Añadir al cultivo una solución del antibiótico suministrado. (0/60/200/600 µl del stock
preparado)
Continuar la incubación del cultivo a 37º C

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DEL SUELO PRODUCTORES DE ANTIBIÓTICOS


Leer instrucciones previamente !!!
- Seleccionar colonias productoras de halo de inhibición del crecimiento
- Sembrar “estría” en placa de AN ( en lateral, según FIGURA 7 )
Incubar a 37º C – 24 horas para permitir producción del antibiótico

ANÁLISIS DE AGUAS

Sistema de filtración
- Introducir filtro de 0,45mm
en sistema de filtración (con pinzas
metálicas previamente flameadas)

- Filtrar 50-100ml de la
muestra

- Depositar filtro (con pinzas


metálicas previamente flameadas)
en placa de:
 Agar nutritivo –
marcar- incubar a 37º
C
 MacConkey – marcar
– incubar a 37º C
 MF-C – marcar –
incubar a 44,5 º C

ANÁLISIS DE ALIMENTOS
Homogeneizar muestra

Inocular 0,1ml en placa de AN, y extender con asa de vidrio previamente flameada.
Lavar después el asa de vidrio

TINCIONES : Realizar TINCIÓN DE GRAM (según instrucciones anteriores)


Práctica DÍA 4

Ver resultados del análisis de agua y análisis de alimentos

CURVA DE CRECIMEINTO- EFECTO DE ANTIBIÓTICO


- Tomar 1ml de la muestra (con pipeta Pasteur estéril)
- Medir D.O.
Representación gráfica
Comparar resultados de soluciones de antibiótico diferentes entre las mesas

CONTINUAR OBRSERVACIÓN DE TINCIONES

MICROORGANISMOS PRODUCTORE DE ANTIBIÓTICOS


Una vez crecido el microorganismo productor y difundido el antibiótico:
Sembrar estrías de cepas indicadoras, perpendicularmente a la estría del organismo
productor de antibiótico (según indicaciones en Figura 7, paso 4)

Incubar a 37º C.

ANTIBIOGRAMA. (Ver instrucciones en Figura 8)


- Tomar, son un HISOPO estéril, una muestra de la cepa suministrada
- Extender con la ayuda del HISOPO con objeto de obtener crecimiento en césped
- Depositar los discos de antibiótico (con pinza metálica previamente flameada)

Incubar a 37º C

IDENTIFICACIÓN BACTERIANA. SISTEMA API. (Ver instrucciones en Figura 9)


- Resuspender 1 colonia de la cepa problema suministra en 6ml de suero fisiológico estéril.
- Inocular la muestra (con pipeta Pasteur estéril) en microtubos del sistema de identificación API
- Cubrir con parafina estéril los tubos indicados en el sistema
- Incubar a 37º C
Práctica DÍA 5

Ver resultados de microorganismos productores de antibióticos


Observar la inhibición del crecimiento en las distintas cepas indicadoras

Interpretation of Zone Diameters of Test Cultures


Abbr RESISTANT Intermediate Susceptible
(mm or less) (mm range) (mm or more)
Ampicillin AM 20 21-28 29
Amikacin AN 14 15-16 17
Aureomycin A 14 15-18 19
Bacitracin B 8 9-12 13
Cephalothin CR 14 15-17 18
Chloramycetin C 12 13-17 18
Colymycin CL (colistin sulfate) 8 9-10 11
Erythromycin E 13 14-17 18
Gantrisin G 12 13-16 17
Gentamicin Gm 12 13-14 15
Kanamycin K 13 14-17 18
Lincomycin L 13 14-17 18
Methicillin ME 9 10-13 14
Nalidixic Acid NA 14 14-18 19
Novobiocin NB 17 18-21 22
Oxacillin OX 9 10-13 14
Penicillin P 20 21-28 29
Polymyxin B PB 8 9-11 12
Streptomycin S 11 12-14 15
Sulfadiazine SD 12 13-16 17
Triple sulfa SSS 10 11-15 16
Tetracycline TE 14 15-18 19
Tobramycin TM 12 13-14 15
Ver resultados de curva de crecimiento – efecto de antibiótico
- Tomar 1ml de la muestra (con pipeta Pasteur estéril)
- Medir D.O

Representación gráfica
Compara resultados de soluciones de antibiótico de diferente concentración.

Ver resultados de antibiograma


Medir halos de inhibición y comparar resultados con tablas de sensibilidad

Ver resultados del sistema de identificación API


Ver resultados (tras adición del reactivo indicado en su caso)
Identificación de la cepa problema

SALA INFORMÁTICA
Algunos enlaces de interés en Microbiología Molecular

General
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ (Centro de Información Biotecnológica de EEUU)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed (Base de datos de publicaciones científicas)
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Taxonomy (Identificación del grupo taxonómico al que
pertenece una especie)

Identificación de Secuencias
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ (BLAST frente a GenBank o Banco de datos genético
mundial)

Microbiología en España
http://www.semicro.es/ (Sociedad Española de Microbiología)
http://www.inab.org/ (Instituto Nacional de Bioinformática)
http://www.redgb.org (Red Nacional de Genómica Bacteriana)
http://www.cect.org/ (Colección española de cultivos tipo)
-medios de cultivo
-catálogo de especies

Listado de genomas completos y proyectos en curso


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genomes/static/eub_g.html

Información detallada de funciones y análisis metabólico

http://www.genome.jp/kegg/kegg2.html

(metabolic pathways, gene maps, catálogo de medicinas con sus estructuras y fórmulas, etc)

-Haz clic en “PATHWAY” en la parte superior de la página


-Selecciona una ruta metabólica (por ejemplo, metabolismo de la galactosa)
Ahora aparece la ruta de referencia potencial, indicando las enzimas involucradas en la
producción de los compuestos señalados.
-Selecciona una especie de entre la lista que aparece en la pestaña (por ej. E coli), y pulsa “Go”.
Observa que aparecen marcados en color los genes presentes. Ahora sabemos qué rutas
metabólicas de la galactosa puede realizar la bacteria seleccionada.
-Selecciona otra bacteria (por ej. Bacillus anthracis, la bacteria causante del ántrax).
Como ves, muchos de los genes presentes en E coli no están presentes en esta especie;
hay rutas que no es capaz de realizar.
-Selecciona, por curiosidad, Homo sapiens con alguna ruta metabólica.
-Vuelve a la página principal (KEGG2) y haz clic en “LIGAND” en la pestaña superior.
-Ve al apartado de Search Drug (Búsqueda de medicina) y selecciona “name”. Introduce un nombre en
inglés (por ejemplo, aspirin).
Aparecerá información sobre la aspirina, tipo de efecto terapéutico, etc.
-Ve al apartado de Search Compound (Búsqueda de compuesto) y selecciona “name”. Introduce un
nombre en inglés (por ejemplo, kanamycin).
Aparecerá información sobre los distintos tipos de kanamicina, fórmulas, etc.
Realizar un BLAST

1º/ BLAST:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/

2º/ Nucleotide-Nucleotide BLAST : (blastn) ( 3º opción dentro del apartado “Nucleotide”)


Observar que se abre una pantalla nueva.

3º/ Abrir el documento en el que están depositadas las secuencias en formato FASTA. (“>”) y “copiar”
toda la secuencia (en el escritorio: “Secuencia X”)

4º/ Volver a la ventana del BLAST y “pegar” la secuencia en la ventana “Search”


Observar que pasa a otra pantalla “con una numeración”. Haz click en FORMAT

5º/ Pasado unos segundos, aparece el resultado de la búsqueda:

Tratar de encontrar la siguiente información:


- Microorganismo al que pertenece la secuencia “con probabilidad”
- Indicar a qué pertenece esa secuencia
- Quién depositó esa secuencia en el Banco de Genes

Realizar una búsqueda bibliográfica

1º / Pubmed:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi

Observar que existen varias opciones de búsqueda: proteínas, genomas completos, nucleótidos… etc. En
nuestro caso, si lo que queremos son publicaciones tendremos que buscar en “Pubmed”.

2º/ En la ventana de “for”: introducir el parámetro de interés


Probar resultados, por ejemplo con:

Rodriguez-Valera F
Marshall BJ o Warren JR
Watson JD o Crick FH (1953)
Tabla de lectura del sistema API20E®