TECNICAS DE ANALISIS UTILIZADAS EN EL CONTROL

MICROBIOLOGICO DE AGUA DE CONSUMO Y AGUAS

RESIDUALES

TECNOLOGIA EN PROCESAMIENTO DE ALIMENTOS

PERECEDEROS

CENTRO AGROPECUARIO DE BUGA

COMPLEJO PILOTO AGROINDUSTRIAL
SENA- BUGA
NOVIEMBRE DE 2009
 INTRODUCCION

El agua potable de suministro público para consumo y uso

domestico se define como aquella que posee las
características básicas del agua: incolora, inodora e
insípida y que, además, no contiene ninguna sustancia que
pueda causar daño a la persona que la consume. Para
cumplir con estas premisas, el agua debe ser sometida a
rigurosos controles para verificar que es apta y libre de
microorganismos patógenos y/o sustancias orgánicas,
inorgánicas y radiactivas.
 Control Microbiológico del agua de consumo y agua
residual.
En el agua encontramos una enorme diversidad de microorganismos y se nos
hace muy complicado poder determinar cuales son los buenos y cuales son los
malos. Es por este motivo que se establecen distintos criterios para determinar
si el agua es apta para uso humano y el más importante desde el punto de
vista microbiológico es la presencia de de bacterias coliformes. Las
características generales que distinguen a éstas bacterias es que todas las
pertenecientes al grupo son similares morfológica y fisiológicamente, bacilos
cortos gramnegativos, anaerobios facultativos, fermentadores de la lactosa y
formadores de ácido y gas. Estas bacterias son las que se encuentran
generalmente en el tracto intestinal, tales como Escherichia coli, y se utilizan
como indicador de contaminación debido a que si se encuentran presentes en
el agua, esto significa que hay desechos fecales en el agua y no puede ser
considerada agua potable para consumo.

El método más utilizado para realizar el análisis del agua potable se lo conoce
como técnica del Número Más Probable (N.M.P.), el cual es un método
estadístico que sigue una distribución de Poisson y que considera el número de
porciones de muestra que siembra en un medio de crecimiento apropiado y el
número de coliformes presentes en dicha porción.

La determinación de que medios de cultivos utilizar esta dada por las

características antes mencionadas acerca de estos microorganismos. Mediante
el N.M.P. vamos a poder realizar el conteo de coliformes totales presentes en
la muestra de agua y luego, si hay coliformes en la muestra, también podremos
distinguir entre los coliformes de origen fecal y los de origen no fecal. El
microorganismo característico que indica la presencia de coliformes de origen
fecal es Escherichia coli, mientras que el grupo de coliformes no fecales esta
dado por un mayor número de representantes que pertenecen a las
enterobacterias, tales como Escherichia sp., Klebsiella, Enterobacter y
Citrobacter, y cuyo hábitat generalmente es el suelo y la vegetación.

Metodología e Interpretación del N.M.P.

Durante la primera parte del método se siembran 3 diluciones seriadas en base

10 de la muestra de agua a analizar en un tubo conteniendo medio de cultivo
Brila Fluorocult y la conocida “campana” de Durham. La siembra de cada
dilución se hace por triplicado. El medio de cultivo utilizado se caracteriza por
contener lactosa como fuente de carbono. Entonces, si hay coliformes,
fermentan la lactosa con la producción de gas como producto de la
fermentación y se observa la presencia de aire en el interior de la campana. El
número de coliformes totales se puede determinar eligiendo el triplete de
diluciones seriadas en el cual se observa ausencia de crecimiento en alguna de
las réplicas de la mayor dilución y crecimiento en todas las réplicas de la menor
dilución, encontrando una situación intermedia en la segunda dilución.

Una vez confirmada la presencia de coliformes, se intenta identificar en la

segunda parte del método si hay o no coliformes fecales. Existen variantes
para poder confirmar el resultado. La forma más rápida es utilizando los
mismos tubos sembrados anteriormente en el medio Brila. Otro de los
componentes de este medio de cultivo es el MUG, 4-metilumbeliferil-B-D-
glucurónido, un compuesto que puede ser sustrato de la enzima B-D-
glucuronidasa para dar otro compuesto, el 4-metilumbeliferona. Este producto
final es fluorescente al ser excitado por luz ultravioleta. De todos los coliformes
nombrados anteriormente, solo Escherichia coli es capaz de sintetizar esta
enzima, por lo tanto, si colocamos los tubos bajo la luz ultravioleta y vemos
fluorescencia, es un indicador de la presencia de coliformes fecales.

Para confirmar el resultado se calcula el N.M.P. de coliformes no fecales

sembrando las muestras, en las mismas diluciones que antes y por triplicado
también, en tubos con caldo Citrato de Koser. Este medio se caracteriza por
utilizar el citrato como única fuente de carbono y que solo los coliformes no
fecales pueden utilizar.

El N.M.P. se calcula mediante tablas de estadística que establecen la cantidad

de bacterias según la cantidad de tubos de réplica positivos y la dilución
utilizada.

En base a los resultados de estos análisis se establece el siguiente criterio para

la aceptación del agua potable para consumo:

Coliformes totales: <2,2 coliformes totales/100ml

Coliformes fecales: 0 coliformes/100ml

Control Fisicoquímico

En este control se verifican las características generales del agua que se esta
analizando en cuanto a color, olor, sabor, pH y presencia de iones.
El color del agua esta determinado por la presencia de sustancias orgánicas
y/o minerales. El análisis se realiza comparando la muestra con un patrón que
contiene distintas cantidades de platino. El rango de aceptación es entre 0,2 y
1,2 mg de platino por litro de agua.

Con respecto al olor, el agua analizada no debe tener ningún olor perceptible.
En el caso de poseer algún tipo de olor se puede ir diluyendo la muestra con
agua ya aprobada hasta determinar el valor límite (mínima dilución necesaria
para que el olor de la muestra sea imperceptible).

La medición del pH se realiza utilizando métodos potenciométricos y

estableciendo el rango de aceptación en 6,5-8,5. Como puede verse se tolera
que el agua sea ligeramente alcalina pero no se tolera la acidez.

Los parámetros químicos de mayor relevancia son la presencia de amonio,

nitrito, nitratos y cloruros, todos excelentes indicadores de contaminación
ambiental que se complementan a los estudios bacteriológicos. Todos estos
compuestos son desechos intermediarios en la degradación de
microorganismos.

Además se realizan mediciones de la dureza y alcalinidad del agua. Se dice

que un agua potable, o no, es dura cuando tiene alta concentración de sales
de calcio y magnesio disueltas. La alcalinidad del agua esta dada por la
presencia de carbonatos y bicarbonatos.
TÉCNICA DE FILTRACIÓN CON MEMBRANA

La muestra se filtra a través de un filtro de membrana de 0,45 μm. De manera

que los microorganismos quedan retenidos en su superficie. A continuación la
membrana se deposita en una placa de 55 mm que contiene el agar apropiado.
Después del periodo de incubación a una determinada temperatura, las
colonias que han crecido en la superficie de la membrana pueden ser contadas
directamente.
La técnica de filtración con membrana ofrece una serie de ventajas sobre la
tradicional técnica del número más probable (NMP):
• Muestreo mucho más representativo.
La membrana permite recuperar menos concentración de microorganismos en
mayores volúmenes de líquido. Siendo útil en aguas muy poco contaminadas.
• Resultados definitivos en menos tiempo.
• Enumeración de colonias directa y más precisa.
• Indicada para aguas muy mineralizadas que pueden producir reacciones no
deseadas en las colimetrias con medios líquidos.
• Las membranas pueden ser guardadas por largos periodos de tiempo con
fines testimoniales, sanitarios o legales.
• Ahorro considerable de espacio en el laboratorio comparado con la técnica
del NMP.
Esta técnica ha sido adoptada también para el control de aguas no destinadas
al consumo humano, por ejemplo, en agua de uso en procesos de fabricación.
También se usa para el control microbiológico de otras muestras líquidas como
zumos, leche, etc.

TOMA DE MUESTRAS
El muestreo debe ser hecho con contenedores estériles.
Opción 1: frascos o botellas de vidrio borosilicato o de plástico no tóxico (PP)
resistentes al calor.
Opción 2: bolsas de plástico no tóxico estériles de un sólo uso.
Opción 3: frascos o botellas de plástico no tóxicas
(PE) que no resisten el calor, pero que han sido esterilizadas por radiación
gamma.
Las muestras de aguas cloradas deben ser recogidas con un frasco que
contenga tiosulfato sódico.
 Enterococos
AGAR SLANETZ-BARTLEY
El medio contiene azida sódica que inhibe el crecimiento de las bacterias Gram
negativas.
La solución de TTC que se añade al medio facilita el recuento.

INSTRUCCIONES
Filtrar 100 ml de la muestra de agua através de una membrana con un tamaño
de poro
de 0,45 μm. Usar pinzas estériles para colocar, con cuidado, la cara filtrada de
la membrana boca arriba dentro de la placa de filtración.
INCUBACIÓN
Incubar durante (44 ± 4) horas a (36 ± 2) °C, es conveniente mantener un
determinado grado de humedad en la estufa con el fin de evitar una excesiva
desecación de la placa.
INTERPRETACIÓN
Las colonias capaces de crecer en presencia de azida sódica y de reducir el
TTC a formazán dando lugar a color rojo, marrón o rosa se consideran
sospechosas.
CONFIRMACION
Confirmar las colonias sospechosas por transferencia de membrana sobre agar
bilis esculina azida (01-592) observando todas aquellas colonias que sean
capaces de hidrolizar la esculina en un plazo de unas 2 horas dando lugar a
una coloración que va desde marrón a negro.

Clostridium perfringens (incluidas las esporas)

AGAR m-CP
Los clostridios hidrolizan la sacarosa formando colonias de color amarillo. Tras
la exposición a vapores de amoniaco las colonias cambian a color rojo.

INSTRUCCIONES
Filtrar 100 ml de la muestra de agua através de una membrana con un tamaño
de poro
de 0,45 μm. Usar pinzas estériles para colocar, con cuidado, la cara filtrada de
la membrana boca arriba dentro de la placa de filtración.
INCUBACIÓN
Incubar en anaerobiosis durante (21 ± 3) horas a (44 ± 1) °C.
INTERPRETACIÓN
Se consideran sospechosas todas aquellas colonias de color amarillo opaco.
CONFIRMACIÓN
La placa se somete a los efectos de los vapores de hidróxido amónico
(AM0257) durante un periodo de 20-30 segundos. Se cuentan todas las
colonias que siendo amarillas cambien a color rosa o rojo.
 Coliformes y Escherichia coli
AGAR CHAPMAN TTC
(AGAR TERGITOL® 7)
(AGAR DE LACTOSA TTC CON HEPTADECILSULFATO DE SODIO)
El Tergitol 7 inhibe el crecimiento de las bacterias Gram positivas.
La solución de TTC añadida al medio sirve como indicador del crecimiento
bacteriano
y para un reconocimiento previo de E. coli
y Enterobacter aerogenes.

INSTRUCCIONES
Filtrar 100 ml de la muestra de agua a través de una membrana con un tamaño
de poro
de 0,45 μm. Usar pinzas estériles para colocar, con cuidado, la cara filtrada de
la membrana boca arriba dentro de la placa de filtración.
INCUBACIÓN
Incubar durante (21 ± 3) horas a (36 ± 2) °C, evitando una excesiva
deshidratación
de la placa controlando el grado de humedad.
INTERPRETACIÓN
Las colonias capaces de fermentar la lactosa con la consiguiente producción de
ácido, provocando un cambio de color del medio
de verde a amarillo, son consideradas sospechosas.
CONFIRMACIÓN
Todas las colonias sospechosas deben ser confirmadas mediante la prueba de
la oxidasa
y del indol. Deben ser consideradas coliformes todas las colonias
características
que son oxidasa negativas.
Las colonias oxidasa negativas e indol positivas son consideradas Escherichia
coli.