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QUUIIM
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CAAB
BIIO
OLLO
OGGIIC
CAA IIII

Laboratorio Nº 1
Tema: EVALUACIÓN DEL EFECTO DEL FLUORURO COMO
INHIBIDOR DE LA GLUCÓLISIS ANAERÓBICA

Contenidos conceptuales: Glucólisis. Etapas. Glucólisis en condiciones

anaeróbicas. Inhibidores.

Contenidos procedimentales: Toma de muestra de sangre por venipuntura.

Determinación enzimática de glucosa en suero y plasma por métodos colorimétricos,
con y sin inhibidor de glucólisis a diferentes tiempos.

Contenidos actitudinales: Integración en trabajo grupal. Predisposición para la

resolución de problemas con espíritu crítico y rigor científico. Bioseguridad en el
laboratorio. Autoconfianza. Precisión, sistematización y coherencia en los
planteamientos. Responsabilidad para con las tareas encomendadas.

Objetivos:
 Adquirir destreza en venipunturas.
 Verificar el efecto del inhibidor F– en la vía glucolítica.
Química Biológica II Laboratorio Nº 1
FACENA, UNNE 2013

Fundamentos Teóricos
El uso de inhibidores enzimáticos ha posibilitado el estudio de secuencias
específicas y de metabolitos intermedios. Cuando una enzima es inhibida, se
establece un bloqueo o interrupción de una vía metabólica, se acumula el sustrato
correspondiente de esa enzima, y eventualmente otros intermediarios que preceden a
la reacción bloqueada. Además, puede ocurrir con frecuencia la falta de síntesis final
de compuestos vitales para las células (Ej. ATP), lo que en última instancia conduce a
la muerte celular.
MECANISMO DE
ENZIMA INHIBIDOR
INHIBICIÓN
Compuestos sulfhidrilos,
Hexoquinasa (HK) fenilalanina
EDTA, citrato, oxalato Complejación
Glucoquinasa (GK) EDTA, citrato, oxalato Complejación
ATP, ácidos grasos de Condiciones energéticas
Fosfofructoquinasa I (PFK I) cadena larga, fenilalanina elevadas
Citrato Complejación

Proceso fosfolítico inhibido

Metales pesados (arsénico,
por arseniato que compite
Gliceraldehído-3-fosfato- mercurio)
con el fosfato inorgánico
deshidrogenasa (G3PD)
Agentes alquilantes
Bloqueo del sitio activo
(yodoacetato)
Formación del complejo
Enolasa Fluoruro
fluorfosfato de magnesio
Formación de un complejo
Calcio inactivo por competencia
2+ 2+
con Mg y Mn
ATP, AG de cadena larga, Condiciones energéticas
Piruvatoquinasa PK hepática alanina, acetilCoA elevadas
(PK)
Citrato Complejación

Glucagón y adrenalina Fosforilación

PK muscular Fenilalanina

Piruvato en altas
Lactato deshidrogenasa (LDH)
concentraciones

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Esquema de la vía glucolítica:

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El uso de inhibidores naturales de tipo metabólico o artificiales con reacciones

espontáneas no enzimáticas puede constituir una herramienta para el estudio de los
metabolismos celulares.
Nota: La glucemia disminuye un 30% por hora sino se conserva la muestra con
inhibidor, debido a que los eritrocitos consumen glucosa.

Materiales y métodos  Gradillas

 Guantes descartables  Marcador
 Jeringas de 5 ml y agujas para  Centrífuga
venipuntura de 23/8” (estériles,
descartables)  Baño a 37° C

 Lazo de goma  Micropipeta automática de 10

μl
 Alcohol y algodón
 Pipetas de vidrio de 1 ml
 Anticoagulante EDTA-F-
 Propipetas
 Anticoagulante Heparina
 Kit de reactivos para
 Descartador de agujas determinación de glucemia
 Lavandina  Reloj o timer
 Tubos de hemólisis  Espectrofotómetro

Precauciones:
 Las muestras se tomarán siguiendo las normas de bioseguridad; con guantes,
jeringas y agujas descartables bajo la supervisión de los docentes.
 Las muestras de sangre se recogerán con anticoagulante heparina, EDTA-F–
comercial y sin anticoagulante. Esta se colocará en baño a 37° C hasta
retracción del coágulo; luego se centrifugará 5 minutos a 1000 rpm, y por último
se separará la mitad del suero en otro tubo, dejando el resto con el paquete
globular.
A. Tubo 1: Suero
B. Tubo 2: Suero + Paquete globular
C. Tubo 3: Plasma con Heparina + Paquete globular. Proporción: 50 l de
Heparina para un máximo de 5 ml de sangre
D. Tubo 4: Plasma con EDTA-F– + Paquete globular. Proporción: 20 l de
EDTA-F- para un máximo de 2,5 ml de sangre, o 50 l de EDTA-F- para
un máximo de 7 ml de sangre.
 Cada comisión realizará los pipeteos utilizando la misma micropipeta, con el
mismo tipo de tip (punta de pipeta), y si es posible debe ser llevada a cabo por
el mismo operador.
 Cada comisión realizará las diferentes incubaciones en el mismo baño de
agua.
 Cada comisión llevará a cabo las lecturas en el mismo espectrofotómetro y
utilizando la misma celda.

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Método
Determinación de glucemia (método enzimático)

Fundamento:
GOD
Glucosa + O2 + H2O ác. glucónico + H2O2
POD
2 H2O2 + 4-AF + fenol quinonimina roja + 4 H2O

Ref.: GOD: Glucosa-oxidasa; 4-AF: 4-amino-fenazona; POD: peroxidasa

Procedimiento:

B S D
Estándar - 10 ul -
Muestra - - 10 ul
Reactivo 1 ml 1 ml 1 ml

Incubar 5 minutos en baño de agua a 37° C o 25 minutos a 15-25° C. Luego leer en

espectrofotómetro a 505 nm o en fotocolorímetro con filtro verde (490-530 nm),
llevando el aparato a cero con el blanco.

Estabilidad de la mezcla de reacción final:

El color de reacción final es estable 30 minutos, por lo que la absorbancia debe ser
leída dentro de este lapso.

Cálculo de los resultados:

[Glc] (g/l) = AD x [S] [S] = 1.00 g/l

AS Ref.: Glc: Glucosa; D: Muestra; S: Estándar

Valores de referencia de glucemia en ayunas para el método enzimático: 0,7-1,1g/l.

Experiencia:
 Determinar glucemia basal en todas las muestras.
 Determinar glucemia a la hora y 2 horas de realizada la extracción en todas las
muestras.

Informe
Basal (Hora: : ) 1hora (Hora: : ) 2 horas (Hora: : )
Absorbancia Concentración Absorbancia Concentración Absorbancia Concentración
S
1
2
3
4

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Conclusiones:
1) ¿Qué diferencia espera de la absorbancia entre las muestras con y sin agregado del
inhibidor?
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
2) ¿Se confirman los resultados esperados? Analice las posibles causas de error.
Tubo 1: .............................................................................................................................
Tubo 2: .............................................................................................................................
Tubo 3:..............................................................................................................................
Tubo 4:..............................................................................................................................

3) Calcule el porcentaje de variación de la glucemia en las muestras a diferentes

tiempos y complete la siguiente tabla, eligiendo la Condición de acuerdo a la validez y
comparabilidad de las lecturas para los diferentes tubos en dos tiempos, p. ej. [(Basal-
2da hora)/Basal] x 100, o [(Basal-1ra hora)/Basal] x 100.

Tubo n° Condición % de variación

Bibliografía:

- Bioquímica de Harper. Murray R. B. 17ma edición. Editorial Manual Moderno. 2007.

- Bioquímica. Roscoski. Ed. Mc. Graw Hill. 3ra edición. 2000. Capítulo 25.
- Química Biológica. Blanco A. 9na edición. Editorial El Ateneo. 2011.

Alumno: .......................................... Comisión Nº: ...... Grupo: ...... Fecha: ..../..../....