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UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS

INFORME DE PRACTICA
Facultad de la salud
LABORATORIO N° 5
Programa de Fisioterapia

EXTRACCIÓN DEL ADN DE LA CEBOLLA

Dayra lizhet Alfonso


131104801
Mariana sofia Baquero Ardila
131104804
Emanuel Enrique Barbón Guevara
131104806

1) RESUMEN  Presenciar la deshidratación del reactivo


En esta práctica de laboratorio se pudo hablar y Bial que reacciona con el orcinol
observar sobre que es el piruvato, su producción y  Generar un compuesto coloreado
las reacciones enzimáticas que se involucran para
que se lleve a cabo el proceso. Este proceso se  Permitir que los nucleótidos se unan entre sí
conoce como glucolisis o fermentación. Se
explicará paso a paso las reacciones y los resultados
de estas, de tal manera que se puedan analizar los METODOLOGÍA
resultados. Esto se llevará a cabo teniendo en cuenta Evidencia de producción de piruvato
las teorías relacionadas con los procesos de
fermentación y glucolisis.  Preparar 2 soluciones de levadura al 10%
p/v, la primera usando como solvente
fosfato de sodio dibásico (solución 1) y la
PALABRAS CLAVES: segunda usando como solvente solución de
Prueba, NAD, glucolisis, piruvato, fosfato de sodio, fosfato de potasio monobásico (solución 2).
fosfato de potasio, 2,4 dinitrofenilhidracina, ATP,  Agitar en bortex para homogenizar
ATA . soluciones.
 En dos tubos de ensayo marcados como A y
B agregar a cada uno 2,5 ml de solución de
OBJETIVO GENERAL: glucosa al 10%
Desarrollar técnicas moleculares que permitan  Al tubo A agregar 2,5 mL de la solución 1 y
caracterizar una especie en estudio, identificando su al tubo B agregar 2,5 ml de la solución 2.
composición por desoxirribonucleotidos, que, a su  Colocar en baño maría a 37 °C por 1 hora
vez, están formados por -D desoxirribosa y por un  Agregar a cada tubo 2 mL de ATA al 10%
ion de fosfato, logrando establecer la relación entre p/v.
el proceso de extracción y las propiedades químico-  Mezclar vigorosamente y centrifugar 10
físicas. minutos a 2500rpm.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:  Transferir un 1 ml de cada sobrenadante a
tubos de ensayo diferentes y agrégueles 0,5
 Purificar y extraer el ADN ml de solución saturada de 2,4
 Identificar los monosacáridos formados por dinitrofenilhidracina en HCl 2M.
una cadena de cinco átomos de carbono  Mezclar fuertemente
 Transferir nuevamente 0,5 ml de esta
 Cumplir una función estructural mezcla y agregue 1 ml de NaOH al 10% y

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0.5 ml de agua. oxidación de compuestos orgánicos nitrogenados.


 La formación de un color rojo indica la [2]
presencia de piruvato.
 Repetir esta prueba usando una solución de
glucosa en vez del sobrenadante. ¿Qué es un piruvato?

Es un compuesto muy importante para la célula ya


que es un sustrato clave para la producción de
energía y de la síntesis de glucosa

¿Cómo se produce el piruvato?

El piruvato se produce por glucólisis en el


citoplasma, donde las moléculas de piruvato se
forman durante una serie de reacciones
importantes llamadas glucólisis. La glucólisis es la
vía de descomposición de las moléculas de glucosa
y el primer paso de la respiración celular. Una vez
que la glucosa se descompone, se forman moléculas
2) INTRODUCCIÓN de piruvato. Estas moléculas luego continúan
produciendo más energía para las células. [3]
En el proceso de fermentación del piruvato, se
puede identificar como es producido por una serie ¿Qué es glucolisis?
de reacciones enzimáticas que involucran ciertos
intermediarios a este proceso se le domina Es el proceso en el cual las células, en las
glucolisis. En este proceso se transfieren dos pares reacciones enzimáticas que no necesitan oxígeno y
de átomos de hidrogeno de la glucosa NAD+. descomponen parcialmente la glucosa (azúcar). La
Los metabolitos de piruvato se encuentran glucólisis es uno de los métodos que usan las
normalmente en bajas concentraciones, por lo tanto, células para producir energía. Cuando la glucólisis
para comprobar su existencia es necesario impedir se vincula con otras reacciones enzimáticas que
su transformación. El piruvato descarboxilasa no es usan oxígeno, se posibilita una descomposición más
activa en soluciones ligeramente alcalinas, de completa de la glucosa y se produce más energía.
manera que el piruvato se acumula y su presencia se [4]
demuestra con la 2,4-dinitrofenilhidracina. [1]
¿Dónde se produce la glucolisis?
¿Qué es la fermentación?
Este proceso ocurre en el citoplasma celular, en el
La fermentación es un cambio químico que produce cual una molécula de glucosa se escinde en dos
un organismo vivo o una enzima, especialmente moléculas de 3 carbonos de piruvato (ácido
bacterias o microorganismos que se producen en pirúvico). Este proceso da como resultado un
plantas unicelulares tales como levadura, mohos u rendimiento neto de dos moléculas de ATP (a partir
hongos. La reacción incluye la descomposición de de ADP y fosfato inorgánico) y dos moléculas de
los azúcares y almidones a alcohol etílico y dióxido NADH (a partir de NAD+) [5]
de carbono, la acumulación de la leche o la

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3) SECCION EXPERIMENTAL
MATERIALES:

Tubos de centrifuga: son elementos esenciales


para el aislamiento, la estratificación o la separación
de muestras por gradiente de densidad al utilizar
centrífugas o micro centrifugas.

Pipeta graduada de 25 ml: se utilizan para medir


con precisión y transferir líquidos

Vaso de precipitado: es un recipiente cilíndrico de


vidrio boro silicato fino que se utiliza muy
comúnmente en el laboratorio, sobre todo, para
preparar o calentar sustancias, medir o traspasar
líquidos.

Balón aforado: se usa como material volumétrico.


Se emplea para medir un volumen exacto de líquido
con base a la capacidad del propio matraz, que
aparece indicada.

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Gradilla para tubos de ensayo: sirve para


almacenar y transportar muestras contenidas en
dichos tubos. Son de gran utilidad en laboratorios

Tubos de ensayo: se utiliza principalmente como


contenedor de líquidos y sólidos a los cuales se les
va a someter.

La centrífuga: es un equipo de laboratorio que


genera movimientos de rotación, tiene el objetivo de
separar los componentes que constituyen una
sustancia.
REACTIVOS

 Glucosa al 10 %
 Fosfato de sodio dibásico al 0.5 M
 Fosfato de sodio monobásico al 0.5 M
 Ácido tricloroacetico al 10%
 2,4 dinitrofenilhidracina saturado en
HCl 2M
Pinzas para tubo de ensayo: sirven para sujetar los
tubos de ensayo mientras se calientan o manipulan.  NaOH al 10%
 Levadura

4) RESULTADOS

4.1 Evidencia de producción de piruvato

PREPARACIÓN SOLUCIÓN DE LA
FRESA

50g de fresa licuada


con 100ml de la
solución de lisis

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A la solución de la fresa se le agrego la solución de


lisis que ya estaba preparada y en el proceso de
filtración de esta mezcla se obtuvo 95 ml
observados en la probeta posteriormente se tomó 4
ml de esta mezcla filtrada en un tubo de ensayo y se
le agrego 8 ml de etanol gota a gota, este tubo
servirá para la extracción del ADN para las
siguientes tablas.

RESULTADOS DE FORMACIÓN DE
Filtrado de la PRECIPITADO
solución de -------------- Antes de Después de
fresa+lisis calentar calentar
Tubo A

Se le agrego
1ml de agua
y 2 ml de di
fenilamina
95 ml de la
solución filtrada

Tubo B

Se le agrego
2 ml de
difenilamin
a y 1 ml de
extracto
precipitado
Se tomó 4 ml de la
solución filtrada y
se le agrego 8 ml de
etanol gota a gota

Tubo C

Se agregó 2
ml de
Tabla 1. RESULTADOS OBTENIDOS DEL PROCESO difenilamin
DE PREPARACION DE LA FRESA a y 1 ml de
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la solución Tubo B
de fresa con
etanol Se le agrego
2 ml del
reactivo de
Bial y 1 ml
de extracto
precipitado

Tabla 2. RESULTADOS OBTENIDOS EN LA PRIMERA


TABLA PARA LA FORMACION DE PRECIPITADO.
Tubo C
Después de agregar a cada tubo lo dicha en la tabla,
se llevó a calentar durante 10 minutos y ver la Se agregó 2
coloración presente en cada uno de ellos. ml del
reactivo de
IDENTIFICACIÓN DE PENTOSAS Bial y 1 ml
-------------- Antes de Después de de la
calentar calentar solución de
Tubo A fresa con
etanol

Se le agrego
1ml de agua
Tabla 3. PROCEDIMIENTO DE EL DESARROLLO DE
y 2 ml del IDENTIFICACION DE PENTOSA.
reactivo de
Bial En cada uno de los tubos se le agrego lo indicado en
el procedimiento y posteriormente se le puso a
calentar por 10 minutos para observar la coloración
final respecto a la función del reactivo de Bial.

IDENTIFICACIÓN DE GRUPO FOSFATO


-------------- Antes de Después de
calentar calentar
Tubo A

Se le agrego
0.1ml de
agua, 0.5 de
ácido
molibdico
y 0.5 ml de
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ácido
ascórbico

Tubo B

Se le agrego Tubo 1
0.1 ml del
extracto, 0.5 Precipitado de la
de ácido mezcla anterior y 5 ml
molibdico de agua.
y 0.5 ml de
(sometido a calor (baño
ácido
maría) durante 10
ascórbico
minutos)

Tubo C Duración de la caída


del líquido: 3.16
Se le agrego segundos
0.1ml de la
solución de Tubo 2
fresa con
etanol, 0.5 Precipitado de la
de ácido mezcla anterior y 5 ml
molibdico y de agua.
0.5 ml de Sometido a frio durante
ácido 15 minutos
ascórbico
Duración de la caída
del líquido: 4
Tabla 4. RESULTADOS DE LA IDENTIFICACION DE segundos
GRUPO FOSFATO.

VISCOSIDAD EN DIFERENTES
CONDICIONES
Tabla 4. RESULTADOS DE LA VISCOSIDAD EN
solución de la fresa(10 DIFERENTES CONDICIONES
ml del filtrado) con
etanol (25 ml) 5) ANALISIS DE RESULTADOS

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Para la extracción del ADN en la fresa se debe tener


en cuenta que estas tienen una ventaja que nos
facilitara la extracción de este pues estas son
organismos octaploide por lo cual esto nos
favorecerá en el proceso de extracción.

Para la extracción de ADN se requiere una serie de


etapas básicas. En primer lugar, se debe romper la
pared celular y la membrana plasmática para poder
acceder al núcleo de la célula. luego debe romperse
también la membrana nuclear para dejar libre el Figura 1. PROCESO DE EXTRACCION DEL ADN
ADN. Por último, hay que proteger el ADN de
enzimas que puedan degradarlo y para aislarlo hay Luego de lo realizado con cada reactivo, para
que hacer que precipite en alcohol finalizar con la extracción por completo del ADN se
usa el ultimo reactivo y es el etanol el cual va hacer
Para esto primero se realiza el corte de las fresas la función de “hacer flotar el ADN de la fresa” pues
con el fin de librear o romper las células y que lo al contrario que en el agua el ADN no es soluble en
que estén dentro de esta salga y este procedimiento alcohol por lo cual al agregar el etano gota por gota
se logra completar al momento de licuar la fresa, sin la moléculas del ADN ya no se pueden disolver y
embargo, otro factor decisivo es la solución de lisis acaban fumándose juntas en la superficie del tubo
que se usó al momento de licuar la fresas pues esta de ensayo y es lo que se logra ver como la
solución está compuesta por: formación de la telita blanca en la parte superior de
la solución.
SDS (sodio dodecil sulfató): Es un detergente
aniónico que solubiliza los lípidos y proteínas, y
desestabiliza la estructura de la membrana
celular (Rocha, 2002).

EDTA (Ácido etilendiaminotetraacético): Una vez


el ADN es liberado del núcleo, queda expuesto a las Figura 2. PROCESO REACCION DEL ADN CON UN
enzimas DNAsas de la célula que degradan el ADN. ALCOHOL
Para evitar la degradación se usa el EDTA, agente
quelante que atrapa los iones Mg2+ usados por las En la imagen se puede observar como el ADN se
DNAasas como cofactores ( Sambrook, Fritsch & forma en la parte superior del recipiente.
Maniatis, 2001). La inhibición de las
enzimas también puede realizarse mediante métodos Con los resultados obtenidos en el propia de la fresa
físicos, como la desnaturalización por calor (a proceso de extracción de ADN de la fresa por medio
temperaturas de 65 °C) (Rocha, 2002). del proceso ya mencionados y posterior
identificación de algunos grupos:
Por lo tanto, esta solución lo que permitió fue la
liberación por completo del ADN contenido en el Formación de precipitado
núcleo de las células y además a evitar la
degradación o alteración de esta cadena genética. Para evidenciar la presencia de ácidos nucleicos
(ADN) en extractos celulares vegetales se requiere

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células en cantidad suficiente y en medio libre de


interferencias que puedan causar lisis celular
o hidrólisis de los ácidos nucleicos por nucleasas
esto ya se logró con el procedimiento anterior y la
adición del etanol.
Una completa extracción de ácidos nucleicos es
fundamental para la determinación indirecta.Una
hidrólisis ácida remueve todas las bases púricas
(hidrólisis de uniones N-glicosídicas entre pentosa y
las bases púricas) sin afectar las uniones
fosfodiester del esqueleto nucleotídico.
lo tanto se obtiene como producto ácido nucleicos
sin bases púricas. Las desoxipentosas debido al
hidrólisis ácida sufren deshidratación dando
aldehídos δhidroxi-levulínicos. Estos reaccionan
con difenilamina dando un producto de compuestos Figura3. REACCION DE EL ENSAYO DE BIAL A UNA
color azul. (Zhao, Y., Xiang,S., Dai, X. y col, 2013) PENTOSA

La reacción de difenilamina servirá para Según lo observado en los resultados, los tubos B Y
caracterizar, indirectamente la presencia de DNA. C que contenían la solución de la fresa dieron una
coloración verdosa o negra oscura siendo el tubo C
un poco más oscuro que el B, por otro lado, el tubo
A no tuvo ninguna reaccion y siguió teniendo una
coloración amarilla antes y después del baño maría.

El nombre ácido desoxirribonucleico viene de su


estructura. La desoxirribosa es la azúcar, y el
nucleico es el ácido que se forma con un fosfato y
una base nitrogenada (adenina, timina, guanina o
Figura 3. ESTRUCTURA DE LA DIFENILAMINA.
citocina) por lo tanto el ensayo de Bial reacciona
con la pentosa del DNA y RNA puede evidenciarse
Identificación de pentosas por la reacción.

El ensayo de Bial se usa para detectar la presencia Identificación de grupo fosfato


de pentosas. El reactivo de Bial está compuesto por
orcinol, ácido clorhídrico y cloruro férrico. Si una El Ácido Molibdico se utiliza como reactivo de
pentosa está presente, se deshidratará para formar laboratorio para análisis, investigación y química
furfural que reaccionará con el orcinol para general fina.
un compuesto coloreado
El ácido ascórbico es uno de los reductores más
potentes que existen en forma natural en los tejidos,
y actúa como cofactor en un gran número de
reacciones de hidroxilación y amidación, al
transferir electrones a las enzimas que proporcionan
equivalentes reductores.
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por un tiempo establecido. Cuando una sustancia


Por lo tanto, en la reaccion estos dos reactivos está a temperatura ambiente, la molécula permanece
funcionan en conjunto para identificar el grupo estable. Del mismo modo, a medida que aumenta la
fosfato por medio de la reacción para fósforo temperatura, la molécula se desnaturaliza, ya que
inorgánico, en medio ácido, con el Molibdato (A.M) los enlaces de hidrógeno se rompen, formando una
da fosfomolibdato, color amarillo, que es reducido separación de su doble hélice. Y a medida que la
luego por el ácido ascórbico a azul de molibdeno. temperatura desciende, la molécula tiende a
estabilizarse (P. Moreno - D. Rueda).

Con lo obtenido del experimento se logró ver que a


temperaturas altas el líquido cayo más rápido que a
temperaturas bajas logrando concluirse que la
viscosidad es mayor en temperaturas bajas.

CONCLUSIONES

Tras la práctica de laboratorio se logran los


Figura4. ESTRUCTURA DEL GRUPO FOSFATO
objetivos expuestos y se infiere que los nucleótidos
desempeñan una amplia variedad de funciones en el
Para las reacciones de cada proceso y la
metabolismo celular, al ser partícipes en
identificación de cada tabla se logra observar que se
transacciones metabólicas, siendo nexos químicos
están identificando los componentes que hacen
en los sistemas celulares, de igual forma, se
parte de los ácidos nucleicos pues se identificaron
determina la importancia de romper la pared celular
pentosas y grupos fosfatos que hacen parte de los
y la membrana plasmática para lograr el acceso al
nucleótidos que son las unidades monoméricas que
núcleo de la célula y para posteriormente, generar la
componen los ácidos nucleicos RNA y DNA.
liberación del ADN. Se concluye que la obtención
de ácido desoxirribonucleico es primordial para los
análisis genéticos a través de la reacción en cadena
de la polimerasa.

Bibliografía
[1] Marco Antonio Martínez Ramírez, P. M. (2016).
Producción de piruvato durante la
fermentación. StuDocu. Obtenido de
Figura5. ESTRUCTURA DE LOS NUCLEOTIDOS https://www.studocu.com/co/document/uni
versidad-de-cordoba-colombia/
¿A qué se debe la diferencia de viscosidades del bioquimica/produccion-de-piruvato-
DNA observada en los experimentos? durante-la-fermentacion-practica-
laboratorio-n8/9770893
La viscosidad experimentada en el último
procedimiento se debe a los factores en los cuales se [2] vadequimica. (s.f.). Fermentacion. Quimipedia.
le sometió pues son las mismas soluciones, pero en Obtenido de
ambientes distintos pues a una se puso en
temperaturas altas y la otra en temperaturas bajas
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INFORME DE PÁRCTICA DE LABORATORIO

https://www.vadequimica.com/quimipedia/f
/fermentacion/

[3] metabólica, G. (2014). ¿Qué es el piruvato?


Guía metabólica. Obtenido de
https://metabolicas.sjdhospitalbarcelona.org
/ecm/deficiencia-piruvato-carboxilasa-pc/
info/es-piruvato

[4] Agrarias, F. d. (s.f.). GLUCÓLISIS Y


RESPIRACIÓN CELULAR. Universidad
Nacional de Mar del Plata. Obtenido de
https://campus.mdp.edu.ar/agrarias/pluginfile.ph
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[5] OpenStax, B. (2015). La oxidación del piruvato.


Khan Academy. Obtenido de
https://es.khanacademy.org/science/biology
/cellular-respiration-and-fermentation/
pyruvate-oxidation-and-the-citric-acid-
cycle/a/pyruvate-oxidation#:~:text=El
%20piruvato%20se%20produce
%20durante,para%20llegar%20a%20la
%20matriz

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