PRÁCTICA 5

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

Introducción más métodos.

- Estudiar la morfología de cada colonia.
En la naturaleza, la mayoría de los microorganis-
mos no se encuentran aislados, sino integrados
en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estu- Material
dio de estos microorganismos y de sus propieda-
Asa de siembra, cayado, pipeta graduada, placas
des, es necesario separar unos de otros y trabajar
de Petri con medio de cultivo sólido y cultivo de
con especies aisladas, obteniendo cultivos axéni-
microorganismos.
cos o puros.
Un cultivo axénico o puro es aquel que contiene
un sólo tipo de microorganismo y que procede Técnicas
generalmente de una sola célula; el crecimiento
de ésta origina, en medio sólido, una masa de Existen distintas técnicas que pueden utilizarse:
células fácilmente visible que recibe el nombre de
colonia. a) Extensión en superficie con cayado
Para obtener cultivos axénicos o puros a partir de
una población microbiana mixta, se utilizan las
denominadas técnicas de aislamiento, que fueron
Serie de
desarrolladas durante el siglo XIX. En un principio, diluciones
Lister utilizó diluciones seriadas en medio líquido conocidas de
la muestra
con esta finalidad, pero la presencia de contami-
nación, es decir, de microorganismos no desea-
dos, dificultó el aislamiento. La escuela de Robert
Koch introdujo los medios sólidos, complementa- Cayado
dos con agar, y las placas de Petri en
Bacteriología, permitiendo así la separación física
de las colonias sobre la superficie del medio de
cultivo o en el interior del mismo.
El aspecto de las colonias sirve para diferenciar Figura 5.1. Siembra por extensión en
distintas especies microbianas.
superficie para recuento.

Objetivos Depositar sobre la superficie de una placa con

agar nutritivo una gota ó 0,1 ml de una determina-
- Familiarizarse con el manejo de microorganis-
da dilución del cultivo de microorganismos proble-
mos y con las técnicas de aislamiento en placa de Petri.
ma y extenderlo con ayuda del cayado, previa-
- Obtener colonias separadas, utilizando uno o
mente esterilizado, en todas las direcciones hasta

Primera diseminación Segunda diseminación Última diseminación

Carga (1ª estría) (3ª estría)
(2ª estría) (4ª estría)

Figura 5.2. Técnica de aislamiento por estría en superficie.

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que esté completamente seco. Incubar la placa,
en posición invertida, a la temperatura deseada
(durante 24, 48 ó 72 horas) según el tipo de micro-
organismo. La posición invertida evitará que el
agua de condensación se deposite sobre la super-
ficie del medio, dificultando la obtención de colo-
nias aisladas.
Es una técnica usada para el aislamiento de colo-
nias, que permite igualmente el recuento de bac-
terias viables en la muestra, si conocemos exac-
tamente el volumen de muestra sembrado.
b) Estría múltiple en superficie
Con un asa de siembra, previamente esterilizada,
se toma una muestra del cultivo de microorganis-
mos y se extiende sobre un área pequeña de la
superficie de la placa con agar nutritivo, en forma
de estrías muy juntas, pero sin hacer presión para
no dañar el agar.
Se flamea el asa, se enfría y después de rozar la
siembra realizada previamente, se extiende de
nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas
estrías. Este proceso se repite sucesivamente, fla-
meando y enfriando el asa al comienzo de las
sucesivas siembras en estría. Se lleva la placa a
incubar, a la temperatura adecuada, siempre en
posición invertida.
Mediante esta técnica se obtienen colonias aisla-
das a partir de una muestra que contenga un ele-
vado número de bacterias.
c) Dilución en masa
En una placa de Petri vacía se deposita un
pequeño volumen conocido de muestra y a conti-
nuación se añade el medio de cultivo (agar nutriti-
vo) fundido y atemperado aproximadamente a
45ºC. Se mezclan ambos por rotación suave de la
placa. De esta forma los microorganismos se dis-
tribuirán de forma homogénea en el medio de cul-
tivo, permitiendo el desarrollo de colonias separa-
das por todo el agar.
Otra variación de esta técnica consiste en inocular
Medio fundido
Medio
atemperado
fundido
Inóculo
Inóculo atempera
calibrado
calibrado
Homogeneizar
Homogeneiz
Figura 5.3. Siembra por dilución en masa
o inclusión en agar.
24
el medio de cultivo, fundido y atemperado, conte-
nido en un tubo, con un determinado volumen de
la muestra. La homogeneización de la muestra y
el medio de cultivo se realiza por rotación del tubo
entre las manos, antes de verterlo sobre la placa.
En ambos casos, trás homogeneización, se dejan
enfriar las placas hasta que se solidifique el medio
y posteriormente se incuban a la temperatura ade-
cuada (siempre en posición invertida).
Aunque con esta técnica se obtienen colonias ais-
ladas, generalmente sólo se utiliza para determi-
nar el número de microorganismos viables en una
muestra, cuando éstos son anaerobios facultati-
vos o microaerófilos.
Resultados
a) Extensión en superficie: Tras el período de
incubación se examinarán las placas. Las colonias
aparecen sobre la superficie, distribuidas unifor-
memente si la siembra se ha realizado de forma
correcta. Podrán diferenciarse las colonias de
acuerdo a su tamaño, forma, color, textura, etc.
Esta técnica de siembra, además de permitir que
se distingan las colonias por su morfología, permi-
te el recuento de microorganismos viables. La
expresión de este recuento se hace en "unidades
formadoras de colonias" (UFC) ya que cada una
procede de un sólo microorganismo (o de un
grupo de microorganismos, pues en algunos
casos éstos tienden a formar agregados). A partir
de las colonias aisladas, los microorganismos
pueden transferirse a otros medios de cultivo para
su estudio.
b) Por estría múltiple en superficie: Tras la incuba-
ción, se observarán las colonias aisladas en algu-
na región de la placa inoculada. Con esta técnica
se logra la separación de los microorganismos
que se encuentran
en un cultivo
mixto, o bien que
proceden de
m u e s t r a s
homogéneas,
pero en las que
existe un elevado
número.
En las zonas
donde existen
colonias aisladas
se puede estudiar Figura 5.4. Aislamiento
la morfología colo- por estría en superficie.
nial.
c) Dilución en masa: Aparecen las colonias distri-
buidas por toda la masa del agar. Aquellas que
están en la superficie tendrán distintas caracterís-
ticas, dependiendo del tipo microbiano, mientras
que las colonias que se desarrollan en el interior,
bajo la superficie del agar, tienen forma lenticular,
aunque los microorganismos que formen las dis-
tintas colonias sean de distinto tipo. Por tanto, las
colonias que aparecen en la profundidad del agar
son siempre biconvexas y no se diferencian unas
de otras por su morfología.

Figura 5.5.
Aislamiento por dilución en masa.

Forma Borde Elevación Superficie

Puntiforme Entero
Puntifor Entero Plana
Plana LisaLisa o
o rugosa
me
Circular
Circular Ondulado Elevada
Elevad Mate
Mate o o
brillante
Ondulad
Rizoide o
Convexa
Convex Seca o cremosa
Seca o
Rizoide
Lobulado
Irregular Invasiva oo
Lobulad Crateriforme
Crateriform Invasiva
Irregular superficial
o
Filamentosa Filamentoso Acuminada
Acumina
Filamentos Filamentoso
d
a
Figura 5.6.
Aspectos más comunes de las diversas colonias microbianas aisladas sobre medio
sólido.

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PRÁCTICA 6

SIEMBRAS
Objetivos c) En medio sólido (agar inclinado): Con el asa
de siembra estéril tomar los microorganismos de
- Aprender a inocular distintos medios de cultivo la muestra e inocular el tubo realizando un movi-
contenidos en tubo: Caldo, agar inclinado y medio miento de zig-zag en la superficie. El proceso se
semisólido sembrado en profundidad. inicia en el fondo y se va avanzando hacia arriba
- Observar el crecimiento bacteriano en los distin- por el área inclinada.
tos medios de cultivo. Incubar en estufa durante 28-48 horas a la tempe-
- Comprobar la movilidad de determinados micro- ratura más adecuada.
organismos.
Siembra enen
Siembra
Material zig-zag en
zig-zag
la
Asa de siembra, hilo de siembra, pipetas Pasteur
o pipetas graduadas, suspensión de microorganis- Asa de
mos y tubos con medio de cultivo líquido, sólido siembra
inclinado y semisólido.

Técnica
a) En medio líquido con asa: Transferir aséptica-
mente, con el asa de siembra, una pequeña mues-
tra de los microorganismos, desde el tubo que
contiene el material problema al tubo con medio
de cultivo estéril. Sumergir el asa en el líquido y
agitar para desprender y diluir la muestra. Incubar
el tubo recién sembrado en estufa, durante 24-48
horas a la temperatura óptima de crecimiento.
Flameado Flameado
Muestra Medio(agar
Muestra Medio (agar inclinado)
Figura 6.2.
Siembra en un tubo de agar inclinado.
d) En medio semisólido: La siembra en este tipo
de medio, que contiene una proporción menor de
agar que los medios sólidos y que se envasa en
tubos, se lleva a cabo con un hilo de siembra este-
rilizado, con el cual se toma la muestra. El medio
queda inoculado al introducir el hilo en profundi-
dad hasta el fondo del tubo, retirándolo posterior-
mente por la misma trayectoria utilizada al realizar

Punción
Muestra Inoculación Incubación Punción
limpia
Muestra Inoculaci Incubació
limpia
Figura 6.1.
Inoculación de un caldo de cultivo
(ver también figura III, pág. 4).
Filamento
Filamento
b) En medio líquido con pipeta: Introducir asép-
ticamente la pipeta Pasteur o la pipeta graduada
en el medio líquido que contiene los microorganis-
mos y, aspirando de forma adecuada, sacar una Muestra Medio (agar semisólido)
cantidad establecida de material que se transfiere Muestra Medio (agar
al tubo con medio de cultivo estéril. Incubar en Figura 6.3.
estufa durante 24-48 horas a la temperatura más Inoculación de un medio semisólido por
adecuada. picadura con hilo de siembra.

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la picadura. Una siembra con asa o con un cierto temperaturas de 4ºC.
movimiento de vaivén podría originar un patrón de d) En medio semisólido se podrá comprobar si el
crecimiento que se interpretaría erróneamente microorganismo es o no móvil, ya que en el primer
como movilidad bacteriana. caso se observará que el crecimiento difunde alre-
Incubar durante 24-48 horas a la temperatura ópti- dedor de la zona donde se hizo la picadura,
ma de crecimiento. detectándose turbidez. Por eso es tan importante
que, cuando se inocula el medio de cultivo, no se
distorsione el agar y se vuelva a sacar el hilo por
Resultados
el mismo sitio de inoculación. Los microorganis-
a y b) En los cultivos líquidos mos inmóviles crecerán únicamente a lo largo de
A B
no tiene lugar la formación la picadura.
de colonias, por lo tanto se Este tipo de siembra en picadura sirve, también,
examinará la existencia de como otro de método de conservación de microor-
enturbiamiento más o menos ganismos anaerobios facultativos.
intenso, la formación de una
película o velo sobre la
superficie, la aparición de
sedimento en el fondo del
tubo, etc. La utilización de
medios de cultivo líquidos
permite la obtención de una 1 2 3
población microbiana gran-
de, con un elevado número Figura 6.4.
de microorganismos, para Aspecto de cul-
tivos en agar
ser utilizados posteriormen-
te. inclinado (A) y
semisólido (B)
c) En medio sólido (agar tras la
inclinado) se observará el incubación.
aspecto general del medio y
la aparición de crecimiento Figura 6.5.
sobre su superficie. Este tipo de siembra permite Prueba de movilidad en agar semisólido.
el cultivo de microorganismos aerobios o anaero- 1. Microorganismo móvil.
bios facultativos. Además, se utiliza para almace- 2. Microorganismo inmóvil.
nar cultivos durante cortos períodos de tiempo, a 3. Tubo control sin inocular.

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