DILUCIN Y RECUENTO EN PLACA

RESUMEN Las bacterias son los ms pequeos y numerosos microorganismos que se encuentran en el suelo, el nmero de bacterios en el suelo puede oscilar desde o menos a varios millones, las estimaciones se realizan en cultivos o mediante examen microscpico directo. La tcnica de dilucin en placa es utilizada para aislar hongos y bacterias a partir de sustratos masivos como suelo, compost, alimentos, agua, etc. Para el experimento se tomo una muestra representativa del suelo para hacer el aislamiento se midi 1 ml, Se coloc esta cantidad en un tubo de 9 ml de agua destilada esterilizada, se agit bien y luego con una pipeta tambin estril, se transfiri un ml de la mezcla a un segundo tubo con 9 ml de agua destilada esterilizada, Se repiti este procedimiento hasta completar una serie de diluciones, se siembro 1 ml de cada tubo en una caja de petri con medio de cultivo seleccionado. Palabras claves. Dilucin, factor de dilucin, recuento en placa, cultivo, colonia, bacteria, INTRODUCCIN Las bacterias son los ms pequeos y numerosos microorganismos que se encuentran en el suelo, el nmero de bacterios en el suelo puede oscilar desde o menos a varios millones, las estimaciones se realizan en cultivos o mediante examen microscpico directo. La tcnica de dilucin en placa se usa ms frecuentemente. Una suposicin en est tcnica es que cada bacteria viable de la suspensin del suelo usado como inoculante se desarrollar en una colonia visible durante la incubacin. Los bacterios ms abundantes del suelo son pequeos bastones cocoides de morfologa variable, (Burges A 1971) Mtodo de dilucin (Rivero M 2000) Este procedimiento es utilizado para aislar hongos y bacterias a partir de sustratos masivos como suelo, compost, alimentos, agua, etc. Se toma una muestra representativa del material del cual se va a hacer el aislamiento y segn su estado se mide 1g o 1 ml Se coloca esta cantidad en un tubo que contenga 9 ml de agua destilada esterilizada, se agita bien y luego con una pipeta tambin estril, se transfiere un ml de la mezcla a un segundo tubo con 9 ml de agua destilada esterilizada. Se repite este procedimiento hasta completar una serie de diluciones proporcional a la concentracin y/ o contaminacin del material en estudio. En caso de trabajar con soluciones poco densa o contaminadas o agua una serie de 4 a 6 diluciones puede ser suficiente, pero en caso de tratarse de suelo, es necesario llegar a unas 8 a 10 diluciones. Una vez completada la serie, se procede a sembrar 0.5 a1 ml de cada tubo en una caja de petri con medio de cultivo seleccionado. Esta siembra puede hacerse de dos formas diferentes: por mezcla de la muestra con el medio de cultivo tibio para luego vertirse en la caja de petri o bien esparcido de la muestra sobre la superficie del medio de cultivo ya solidificado y fro. Este segundo mtodo es ms sencillo y no pone en riesgo el aislamiento por la alta temperatura del medio. Despus de la incubacin se cuenta el nmero de

colonias que se han desarrollado sobre la placa y de este modo se puede calcular el nmero presente pro gramos de suelo aunque el nmero as calculado solo puede considerarse equivalente al presente por g de suelo si: Cada colonia desarrollada sobre la placa proceda solo de una bacteria. (Orjuela B H 1989) Todas las bacterias de las muestras del suelo se hallen en suspensin. (Orjuela B H 1989) Todas las bacterias de la suspensin puedan crecer sobre el medio nutritivo utilizado. (Orjuela B H 1989) Una colonia bacteriana sta formada por la poblacin de bacterias que crece en un mismo lugar y que es originada por la multiplicacin sucesiva de las clulas. Al igual que los hongos es posible apreciar visualmente algunas caractersticas de las colonias bacterianas las cuales ayudan a distinguirlas un poco y apreciar el resultado del aislamiento. Entre estas caractersticas podemos mencionar. (Rivero M 2000) Color: Suele ser homogneo en toda la colonia. Aspecto: Se califica como brillante, opaco, filamentoso compacto, mucoide. Elevacin: En vista lateral de la colonia puede ser plana convexa, o umbonada cuando presenta una prominencia en el centro. Bordes: Pueden ser enteros, ondulados, lobulados, filamentosos. Consistencia: Se puede apreciar el contacto del asa bacteriolgica con la superficie de la colonia y se describe como; butirosa o semejante a la mantequilla, viscosa cuando se adhiere formando hilos, membranosa o cerosa cuando es muy seca. Pigmentos difusibles: pueden producirse pigmentos que se esparcen en el medio de cultivo variando su color caracterstico. El objetivo de este informe es aplicar la metodologa de recuento en placa y de

dilucin y sembrar utilizando la tcnica de siembra por estra en placa. METODOLOGA Se diluyo una muestra de 1 gramo de suelo en agua estril, esta se agito para homogeneizar la solucin, se transfiri con una pipeta estril 1ml a 9 cc de agua estril sucesivamente hasta llegar a 9 ml de la solucin de agua destilada para obtener el grado de dilucin requerido. Para cada dilucin se hizo una repeticin. Se aadi 0.1 ml de cada dilucin en una placa con el medio a travs del mtodo de estra en placa. RESULTADOS Y DISCUSIN Factor de dilucin:
Gramos de la muestra = FC Gramos de la muestra + vol. de la solucin

10 g = 0.1 ml 10 g + 90 ml

N de colonias * 1 * 1 =UFC FC ml de la muestra

Tabla No 1 Resultados preliminares.

CUESTIONARIO Datos obtenidos promediados en dos tomas. 1. Consulte y complete la metodologa de siembra por estra en placa. Dilucin Rep. N de Colonias 10-7 1 39 + 2 tipos de hogos 2 36+2 tipos de hongos 10-6 1 152 2 101 10-5 1 47 + gran cantidad de micelio 2 46 + gran cantidad de micelio -4 10 1 82 2 2 10-3 10-2 10-1 Control 1 2 1 2 1 2 1 2 incontable incontable incontable incontable incontable incontable 8 mas dos tipos de hongos. 8 mas dos tipos de hongos.

obtencin de colonias aisladas. Es una tcnica usada para el aislamiento de colonias, que permite igualmente el recuento de bacterias viables en la muestra, si conocemos exactamente el volumen de muestra sembrado. Estra Mltiple En Superficie Con un asa de siembra, previamente esterilizada, se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre un rea pequea de la superficie de la placa con agar nutritivo, en forma de estras muy juntas, pero sin hacer presin para no daar el agar. Se flamea el asa, se enfra y despus de rozar la siembra realizada previamente, se extiende de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estras. Este proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las sucesivas siembras en estra. Se lleva la placa a incubar, a la temperatura adecuada, siempre en posicin invertida. Mediante esta tcnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado nmero de bacterias. a Fig 1 Mtodo de siembra en placa por estra para obtener un cultivo axnico (puro). (a) Se esteriliza el asa y luego se extrae con ella un inculo del tubo. (b) Se b hacen estras sobre la placa con el agar estril, extendiendo los microorganismos. Tras las estras iniciales se hacen otras estriaciones formando ngulo con las primeras, y el asa c vuelve a esterilizar se entre distintas operaciones. (c) Apariencia de la placa sembrada tras incubacin. Advirtase la presencia de colonias aisladas. De tales colonias aisladas se puede obtener normalmente un cultivo axnico (puro). Tomado de Piaggio M 1998.

Tcnica de aislamiento por estra en superficie. Depositar sobre la superficie de una placa con agar nutritivo una gota 0,1 ml de una determinada dilucin del cultivo de microorganismos y extenderlo con ayuda del cayado, previamente esterilizado, en todas las direcciones hasta que est completamente seco. Incubar la placa, en posicin invertida, a la temperatura deseada (durante 24, 48 72 horas) segn el tipo de microorganismo. La posicin invertida evitar que el agua de condensacin se deposite sobre la superficie del medio, dificultando la

2. Explique en que consiste un cultivo axnico El cultivo puro es equivalente a cultivo axnico (xeno = algo extrao) Cultivo libre de microorganismos que no se desean. Cultivo de una sola especie. Cultivo que presenta nicamente un organismo. Consiste en un solo tipo de microorganismo derivado de una sola clula. el crecimiento de sta origina, en medio slido, una masa de clulas fcilmente visible que recibe el nombre de colonia. En el proceso de identificacin de un hongo o una bacteria requiere que estos organismos una vez aislados en el medio de cultivo se separen de los posibles contaminantes que hayan podido crecer en el medio del sustrato. Es muy frecuente que a pesar de que se hayan observado todas las precauciones de asepsia en el proceso de aislamiento, se obtenga ms de un organismo en el medio de cultivo porque hay varios microorganismos o porque no se pudo evitar la presencia de contaminantes. La primera etapa para obtener un cultivo axnico es la eliminacin de todos los microorganismos de un material. Todos los instrumentos y materiales utilizados para obtener un cultivo axnico deben ser esterilizados, incluyendo el medio de cultivo. (Rivero M 2000) 3. Diferencie Clon, colonia y cepa Clon: uniformidad gentica en una lnea de descendencia. Poblacin de clulas que descienden todas de una nica clula. O bien, cierto nmero de copias de un fragmento de DNA obtenidas al dejar que el fragmento original se replique insertado en un fago o plsmido. (Piaggio M 1998)

Cepa: Poblacin celular descendiente de una nica clula; clon. Conjunto de virus, bacterias u hongos que tienen el mismo gentico. (Piaggio M 1998) Colonia: poblacin de clulas que pueden observarse microscpicamente y que crecen en un medio slido, procedentes de una sola clula. (Piaggio M 1998) desarrollo de un microorganismo en masa, especialmente como un cultivo puro en el laboratorio. 4. Que desventajas se encuentran en la metodologa de recuento en placa y dilucin. Con estos mtodos la poblacin microbiana no puede determinarse con precisin en una muestra dada de suelo. Esta metodologa lleva a subestimar el nmero de bacterias u hongos que se encuentra en el suelo. Puede determinar menor nmero de bacterias de la cantidad que realmente existen en el suelo (Orjuela B H 1989) Las poblaciones bacterianas del suelo como quedan determinadas con este mtodo de cultivo puede oscilar desde pocos miles de clulas por gramo de suelo a varios d cientos de millones, valores que se aproximan muy poco a las estimaciones de la poblacin bacterial realizadas mediante procedimientos microscpicos directos que han presentado rangos que oscilan entre dos y 9 mil millones de clulas vegetales por gramo (Orjuela B H 1989). En hongos del suelo por medio de este mtodo se puede obtener el nmero de colonias por gramo de suelo seco, sin embargo el nmero de hongos en el suelo es poco significativo ya que durante al manipulacin una sola hifa puede romperse en fragmentos donde cada uno puede contarse como un hongo, adems el mtodo se ha considerado muy selectivo

particularmente para especies que esporulan ya que muchos hongos se aslan raramente en placas.

BIBLIOGRAFA Coyne M 1999. Microbiologa del suelo: Un enfoque exploratorio. Ed paraninfo. Madrid Espaa. 416 p. Orjuela B H 1989. El suelo: Una visin sobre sus componentes bioorgnicos. Ed Universidad de Nario. Pasto Colombia. 447 p Rivero C M 2000. Reconocimiento y diagnstico de enfermedades de plantas. Guas para las prcticas de laboratorio de fitopatologa general. Universidad nacional de Colombia. Facultad de agronoma. Bogot. 52 p http://caldum.um.es/~patricio/Propio/Proye ctos/apuntes/micro/Microbiologia.pdf Fecha de consulta: 26 de septiembre del 2005 http://www.analizacalidad.com/bio3.htm Fecha de consulta: 26 de septiembre del 2005 Piaggio M 1998 http://micol.fcien.edu.uy/atlas/glos98.htm Fecha de consulta: 26 de septiembre del 2005 www.ucm.es/info/mfar/pdfs/GuiaMicro2.p df Fecha de consulta: 26 de septiembre del 2005