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PRACTICA N 8 MEDIOS DE CULTIVO-MTODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO COMPETENCIA: Lograr el conocimiento de las necesidades nutritivas , mtodos de siembra, aislamiento y trasplante

de los microorganismos. GENERALIDADES : Los medios de cultivo son sustancias nutritivas usadas para cultivar microorganismo en condiciones de INVITRO, sus componentes bsicos deben satisfacer sus necesidades nutritivas as como sus necesidades fsico qumicas. 1.- Necesidades Nutritivas De Los Medios De Cultivo: a.- Necesidades Elementales: Son los diversos elementos que son parte de las sustancias microbiana (protenas, cidas nucleicos C,H,O,N, lpidos etc.) b.- Necesidades Energticas: Indispensables para cubrir los gastos que lleva consigo la sntesis la mayora de las bacterias utilizan energa liberada por oxidacin o por fermentacin de azcares o cidos orgnicos. c.- Necesidades Especficas de Factores de Crecimiento: Suministran cierto nmero de compuestos bien definidos que los microorganismos que son capaces de sintetizar como amino cidos, bases prica y pirimidicas, vitaminas. 2.- Necesidades Fsico Qumicas: Para un buen cultivo microbiano se deben tener en cuenta ciertas condiciones fsico qumicas como: a.- Hidratacin: El agua es un elemento necesario siendo la desecacin considerada como un factor de hidratacin. b.-Temperatura: Se debe de respetar la temperatura ptima de desarrollo de los microorganismos que vara segn la especie microbiana. c.- pH: El ptimo en la mayora de las veces es cercano a la neutralidad salvo excepciones como Ejm. Thiobacillus tioxidans, que tiene un pH ptimo de I.

d.- Presin Osmtica: La mayor parte de las bacterias son muy tolerantes a las variaciones de presin osmtica cierta bacterias necesitan una concentracin salina muy fuerte. CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO 1.- Por su Naturaleza: Se distinguen dos tipos principales de medios: a.-Medios complejos o Empricos : (medios naturales) contienen productos naturales extracto de tejidos animales o vegetales no se conoce con exactitud su composicin (frmula o concentracin de cada ingrediente), pero estos son medios ricos que les proporcionan los elementos necesarios por experiencia se sabe que los microorganismo tomaran de ellos los que les sean til los constituyentes bsicos son: Maceraciones infusiones de ciertos tejidos biolgicos que contienen en solucin sustancias muy diversas, como glucsidos, vitaminas etc. Pepotas, proviene de la degradacin enzimtica de sustancias protenicas como : carne, caserina, gelatina etc. Extracto de levadura, como fuentes de aminocidos y vitaminas hidrosolubles. b.-Medios sintticos : son soluciones de compuestos definidos qumicamente en cantidad precisa, siendo necesario conocer las necesidades nutritivas exactas de la especie que se desea cultivar , como fuente de carbono y factores de crecimiento. c.- Medios Mixtos : Existen tambin medios de cultivo que resultan de la combinacin de los dos anteriores es decir combinando un medio natural con un medio sinttico ejm: Agar sangre, Papa-dextrosa- agar (PDA). 2.- Por Su Composicin : Se clasifica en : a.- Medios Nutritivos, son aquellos que permiten el crecimiento de todo tipo de bacterias ejm. Agar nutrutivo , caldo, nutritivo etc. b.- Medios de Enriquecimiento, brindar a un grupo de bacterias, suficiente cantidad de elementos necesarios para que este pueda desarrollarse ptimamente e inhiben el desarrollo de otro tipo de bacterias ejemplo caldo selenito, que favorece el desarrollo de Salmonella. c.- Medios de diferenciacin bioqumica, una especie bacteriana se identifica segn un conjunto de caractersticas particulares de su metabolismo conocidas como caractersticas bioqumicas como formacin de gas, produccin de H2S, cambios de ph, etc. Ejemplos sugar iron agar (TSI) Lisina Iron Agar (LIA), etc. 3.- Por el Estado Fsico: Pueden ser. a.-Medios lquidos, ejm. Caldo Nutrutivo, caldo peptona, etc. b.-Medios slidos, son los tpicos agares, el agar es una sustancia que proviene del extracto de algunas algas rojas, principalmente especies del genero Gelidium, sirve como agente solidificante, esta sustancia funde a la temperatura de ebullicin de agua y el enfriar se

solidifica dando un gel homogneo, transparente que no modifica las propiedades del medio de cultivo ejm. Agar nutritivo. Agar cuenta grmenes. c.-Medios semislidos, compuesto por cualquier medio lquido al que le adiciona una concentracin de agar suficiente para obtener un estado de gal blanco (03-05%) se utiliza principalmente para la determinacin de movilidad bacteriana. PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO Materiales : o Materiales de vidrio (probetas, matraces, baguetas, placas petri, tubos de ensayo.) o Equipos ( autoclave, balanza, phmetro, o Otros (trpode, agua destilada, malla de asbesto, etc. o Medios de cultivo (caldo BHI, Agar Mac Conkey, medio SIM). Procedimiento: 1. Limpiar las mesas con solucin desinfectante. 2. Pesar el medio de cultivo de acuerdo a las condiciones que vienen impresas en la etiqueta del recipiente de acuerdo a la firma comercial que la expide. 3.Utilizar agua destilada o agua desionizada para no variar el pH del medio de cultivo. 4. Si es agar disolver y licuar al calor hasta el punto de ebullicin. 5. Esterilizar el medio de cultivo en autoclave, segn las indicaciones de acuerdo al uso se colocaran en tubos de prueba debidamente taponados, o se dejarn en los recipientes de preparacin para despus autoclavar, plaquear (a placas petri estriles) y dejar que solidifique. 6. Llevar a la incubadora por 24 horas a 37C para controlar la esterilidad del medio de cultivo. 7. Guardar en refrigeracin hasta el momento de su uso.

SIEMBRA ASILAMIENTO Y TRASPLANTE -Siembra: Es el proceso por el cual se pone en contacto al microorganismo con el medio de cultivo, para que en condiciones optimas de temperaturas y tiempo de incubacin pueda desarrollar y multiplicarse IN VITRO, se siembra con la finalidad de realizar un aislamiento y un trasplante para obtener un cultivo puro de bacterias a partir de una nuestra problema.

-Aislamiento: Permite la separacin de los microorganismo al estado de pureza a partir de una muestra problema, se requiere un medio slido con gran superficie para que los microorganismos al ser diseminados sobre el medio generen su progenie (cepa) para la formacin de colonias separadas. -Trasplante: Significa la separacin primaria de la cepa a un medio de cultivo apropiado en tubo que puede ser lquido o slido, mediante los trasplantes en medios especiales se logra conocer las propiedades culturales y bioqumicas dando como resultado la identificacin de la especie. Los trasplantes se pueden realizar: a.- De lquido a slido b.- De lquido a lquido c.- De slido a slido d.- De slido a lquido METODO DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS AEROBIAS EN PLACAS PETRI Todo el aislamiento implica el agotamiento de una muestra sobre la superficie del medio Slido se va descargando gradualmente el inoculo los mtodos de aislamiento varian el dispositivo de siembra y la forma de distribuir el inoculo cualquiera sea el mtodo ensayado, aprovechamiento el mximo de superficie del medio se logra el aislamiento del mayor nmero de colonias. 1. Mtodo Del Estriado o Agotamiento En Superficie. Procedimiento: Con el asa de siembra , previamente esterilizad, tomar una pequea porcin del inocuo y trazar estras sobre la superficie del medio siguiendo las lineaciones de las indicaciones dadas en la practica . Rotula e incubar a 37 C por 24 horas, colocando las placas en la incubadora en posicin invertida. 2. Mtodo de Aislamiento Por Diseminacin Procedimiento: Tomar 0.1ml. de3l cultivo problemas con una pipeta y depositar sobre el margen del medio de la placa petri que descansa en posicin normaql sobre la mesa. Si queda el inoculo en la pipeta devolver al tubo de cultivo.

Diseminar las gotas del cultivo con la esptula de Driglasky por la superficie del medio evitando pasar 2 veces por el mismo plano. Desechar la esptula en solucin desinfectante. Rotular el nombre muestra y fecha. Incubar a 37 C por 24 horas, en la incubadora en posicin invertida .

3.- Mtodo De Aislamiento Por Dilucin Procedimiento: Numerar los tubos contenido 9 ml de agua peptona con 10-1, 10-3. 10-4 , etc al igual que las placas petri vacas y estriles. Con la pipeta estril, tomar 1ml de la muestra problema y depositar en el tubo 10-1 mezclar y de este volver a tomar 1ml y depositar en el tubo 10 -2 , y as sucesivamente . De cada dilucin depositar 1 ml en las placas petri ya marcadas. Adicionar agar fundido a 45 y mezclar, rotando en sentido de las agujas del reloj y sentido contrario. Esperar que solidifique e incubar como en los casos anteriores. METODOS DE TRASPLANTE DE CULTIVO PURO 1.- Mtodo De Cultivo Lquido A Medio Lquido. Procedimiento : Tomar el cultivo con la mano izquierda a la altura de la llama del mechero con la mano derecha destapar el tapn con el dedo meique y margen cubital de la mano derecha. Con el asa esterilizada, extraer el inocuo sin hacer rozar la paredes internas del tubo Colocar en la gradilla el tubo con el cultivo inicial. Deslizar al inocuo por agitacin en el nuevo de cultivo flameando el tubo antes y despus de trasplantar la cepa. Quemar al rojo vivo el asa de siembra . Rotulare incubar a 37 C por 24 horas. Nota : Para el trasplante de slido a l lquido, preferible disolver el inoculo inclinando en el medio lquido agitado en las paredes internas del tubo seguir con las indicaciones del mtodo anterior. 2.- Mtodo De Transplante De Cultivo Slido A Medio Slido Procedimiento.

Por estras en superficie, consiste en tomar inoculo de la base del cultivo sin cargar demasiado al asa de siembra deslizar el inoculo en sentido ascendente por la superficie del medio, sembrando por estras en Zigzag. Por picadura se realiza el transplante en medio semi solidificados en posicin vertical la picadura se realiza con agua en la parte central del tubo introducido profundamente. Por picaduras y estras en superficie el trasplante se realiza por picadura en la porcin central del tubo que contiene el medio de cultivo en posicin vertical y estras en la superficie inclinada.

CUESTIONARIO 1.- Defina los siguientes trminos: a. Medio de cultivo. Un medio de cultivo consiste en un gel o una solucin que cuenta con los nutrientes necesarios para permitir (bajo condiciones favorables de pH y temperatura) el crecimiento de microorganismos, clulas o incluso pequeas plantas. Segn qu se quiera hacer crecer, el medio requerir unas u otras condiciones. Generalmente se presentan desecados en forma de polvo fino o granular antes de ser preparados, al prepararse podemos encontrarlos en estado slido, semislido y lquido. El objetivo ltimo del cultivo es variado: antibiograma, identificacin, multiplicacin b. Mtodo de Siembra. Esta definido por el tipo de aislamiento que lograremos a partir de una muestra, sobre la superficie del medio Slido o liquido inoculada por la misma, los mtodos de siembra deberan siempre aprovechar el mximo de superficie del medio para lograr un numero considerable de colonias aisladas c. Tipo de cultivo. Los tipos de medio de cultivo son sustancias nutritivas que variaran segn la muestra usadas esto para lograr el metabolismo del microorganismo en condiciones adecuadas logrando obtener el aislaminto de muestras especificas requeridas. 2.- Qu tipo de sustancias contienen: a. Los medios nutritivos. b. Los medios selectivos. Favorecen el crecimiento de un gnero o de una especie concreta de microorganismos. Son muy tiles para aislar ciertos microorganismos a partir de una poblacin mixta. Por ejemplo, si a un cultivo se le aade un inhibidor del crecimiento de bacterias Gram +, como el cristal violeta, nos

aseguramos de que en ese cultivo slo van a crecer bacterias Gram-. Pertenecen a esta categora el caldo lactosa bilis verde brillante o el agar Salmonella-Shigella. Segn el procedimiento que se utiliza para favorecer el crecimiento de microorganismos concretos, podemos distinguir entre medios de cultivo diferenciales y medios de enriquecimiento.

Los medios de diferenciacin bioqumica. Utilizan propiedades diferenciales del crecimiento microbiano. El medio de cultivo con agar sangre diferencia las bacterias hemolticas de las no hemolticas, el medio de cultivo de McConkey diferencia a las que son lactosa (+) de los lactosa (-). 3.- Indicar cuales son las ventajas y cuales las desventajas que presentan los cultivos en medios lquidos frente a los cultivos en medios slidos.

c.

http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioMedios.htm http://egg.umh.es/frvalera/manualDePracticas.pdf http://www.mailxmail.com/curso-analisis-clinicos/analisis-microbiologicos-medioscultivo-tipos----------------------

PRCTICA N 11 EL ANTIBIOGRAMA

COMPETENCIA: Conocer en que se base la eleccin de un antimicrobiano para el tratamiento de una infeccin, los motivos por los que se realiza las pruebas de sensibilidad y cuando est indicado hacerlas. GENERALIDADES : El antibiograma es el procedimiento por el cual se determina la sensibilidad o resistencia de un microorganismo (bacteria) frente a la accin de determinadas concentraciones (mcg, UI, etc) de antibiticos y/o quimioterpicos, contenidos en discos de papel especialmente destinados para este uso o en diluciones en medio lquido. Se utiliza el trmino antimicrobiano para referirse a los antibiticos y quimioterpicos. Clasificacin de los antimicrobianos por su accin frente a los microbianos: 1. Antimicrobianos que actan sobre la pared celular de las bacterias: - Penicilinas naturales - Penicilinas semi sintticas - Cefalosporinas naturales - Cefalosporinas semi sintticas - Bacitracina - Vancomicina - Cicloserina - Novobiocina Antimicrobianos que actan sobre la membrana citoplasmtica : - Polimixina - Colistina - Tirotrisina La accin de estos antimicrobianos es afectando el proceso osmtico de la membrana a manera de detergente sobre los lpidos. Por lo tanto, permiten el paso de otros antimicrobianos que antes no podan actuar sobre el microorganismo. Por ejemplo la colistina facilita la accin de la eritromicina. Antimicrobianos que inhiben la sntesis proteca - Cloranfenicol - Tetraciclina

2.-

3.-

- Eritromicina 4.-

- Estreptomicina

Antimicrobianos que actan sobre la sntesis proteica. - Gentamicina - Kanamicyna - Amikacina - Sisomina - Tobramicina - Dibekacina Las sulfas impiden la sntesis de cido flico a partir del cido p-aminobezoico y la conversin de cido flico en cido folnico en la formacin de los nucletidos.

Uso de pruebas de sensibilidad antimicrobiana: - Las pruebas de sensibilidad antimicrobianas son necesarias para los siguientes organismos: Enterobacterias Staphylococcus Enterococos Pseudomonas Organismos que producen cuadros clnicos donde es necesaria una terapia bactericida de inmediato. Ejm. Meningitis bacteriana, endocarditis y osteomielitis. Organismos que se vuelven resistentes en el curso del tratamiento. - No es necesario realizar estas pruebas estas pruebas en los casos de organismo que tiene un patrn de sensibilidad establecido. Ejm. Brucella Corynebavterium diptheriae . Clostridium perfringens Actynomices Streptococcus beta hemoltico del grupo A. - Los antimicrobianos que deben ser probados usualmente son los siguientes: Para organismos Gran positivos: Amikacina Gentamicina Ampicilina Meticilina u oxacilina Cefalosporinas Penicilina Cloranfenicol Tetraciclina Clyndamicina Vancomicina Eruromicina Cicloserina Para organismos Gran negativos Amikacina Norfloxacina Ampicilina Tetraciclina Carbenicilina Tobramicina Cefalosporinas Trimetosphrin sulfametoxazol Colistina o Polimixtina B Kanamicina Cloranfenicol Gentamicina Slo para infecciones del tracto urinario

Nutrofurantona Acido Nalidxico MATRIALES : Cultivo de 24 horas de antigedad. Hisopos de algodn. Medio de cultivo Mueller Hinton. Caldo BHI Discos de sensibilidad e diferentes antibiticos. Incubadora. Pinzas. PROCEDIMIENTO: a.- Preparacin del inculo.1. Seleccionar 3 a 4 colonias similares. 2. Transferir estas colonias (obtenidas con el asa de Kolle por contacto con la parte 3. convexa o superior de las colonias). Colocar en un tubo conteniendo cerca de 5 ml. de un medio lquido adecuado, tal como el caldo Trypticasa soya o BHI segn la USP. 4. Incubar el tubo inoculado a 3537C hasta que se produzca una suspensin de microorganismos con moderada turbidez (2 a 8 horas). Si la suspensin muestra mucha turbidez se pueden hacer diluciones con solucin salina estril hasta obtener una turbidez equivalente al Patrn de Mac Farland (obtenido por adicin de 0.5 ml. de solucin de cloruro de bario 2H0 al 1.175% a 99.5ml. de cido sulfrico 0.36 N-1%). Otra forma de estandarizar la densidad del inculo es por medio del mtodo fotocolorimtrico. b.- Inoculacin de las placas.1. Empapar una torunda (aplicador) estril introduciendo en el inculo diluido apropiadamente. Remover el exceso de inculo del aplicador por rotacin varias veces con presin firme sobre la pared interna del tubo de prueba que contiene el cultivo. 2. Refregar con el aplicador sobre la superficie del agar de la placa sucesivamente en tres direcciones diferentes fin de obtener una distribucin uniforme del inculo. Colocar la tapa de la placa y dejar reposar de 3 a 5 min. 3. Colocar los discos de sensibilidad sobre la superficie del medio inoculado, con una punza esterilizada por flameo y enfriada entre cada uso, presionando suavemente cada disco a fin de asegurarlos . El espacio de los discos a si colocados deben de ser de 10 a 15 mn. del borde de la placa y suficientemente separados uno del otro (15-20mm) para evitar sobreposicin de zonas de inhibicin . Dentro de los 30

min, colocar la placa en un inhibidor bajo condiciones aerbicas a temperatura constante de 35-37C. c.- Lectura de placas.- El registro de la medida del dimetro de cada zona de inhibicin (incluyendo dimetro de disco) lo ms exacto posible, se realiza midiendo hasta el punto de competa inhibicin. Preferible leer por debajo de la placa petry sin remover a quintar la cubierta, empleando una regla en mm. RESULTADOS: CONCLUCIONES: IMYERPRETACIO: CUESTIONARIO: 1.- Cundo se dice que un antibitico es Sensible, Intermedio y Resistente?

Los antibiticos
Un antibitico ha sido definido como una sustancia qumica producida por un microorganismo capaz de inhibir el desarrollo de otros microorganismos. Los antibiticos modificados por manipulaciones qumicas aun se consideran como tales. Un agente antimicrobiano es activo contra los microorganismos y puede ser producido en forma natural por microorganismos o sintticamente en el laboratorio. El trmino agente quimioterpico ha sido empleado para referirse a agentes antimicrobianos sintticos o no y tambin se refiere a agentes que actan contra clulas humanas como inmunomoduladores y drogas antitumorales. Los trminos agente antiviral y agente antimictico son trminos ms especificos, incluidos dentro de la categora ms general de agentes antimicrobianos. La determinacin de la Concentracin Inhibidora Mnima (CIM) es la base de la medida de la sensiblidad de una bacteria a un determinado antibitico. La CIM se define como la menor concentracin de una gama de diluciones de antibitico que provoca una inhibicin de cualquier crecimiento bacteriano visible. Es el valor fundamental de referencia que permite establecer una escala de actividad del antibitico frente a diferentes especies bacterianas. Hay diferentes tcnicas de laboratorio que permiten medir o calcular de rutina, y de manera semicuantitativa, las CIM (mtodos manuales y mtodos automatizados o semiautomatizados). Estos diferentes mtodos de rutina permiten categorizar una cierta cepa bacteriana en funcin de su sensibilidad frente al antibitico probado. Esta cepa se denomina Sensible (S), Intermedia (I) o Resistente (R) al antibitco. Para un determinado antibitico, una cepa bacteriana es, segn la NCCLS:

Sensible, si existe una buena probabilidad de xito teraputico en el caso de un tratamiento a la doss habitual. Resistente, si la probabilidad de xito teraputico es nula o muy reducida. No es de esperar ningn efecto teraputico sea cual fuere el tipo de tratamiento. Intermedia, cuando el xito teraputico es imprevisible. Se puede conseguir efecto teraputico en ciertas condiciones concentraciones locales o aumento de la posologa). (fuertes

Ciertas molculas son representativas de un grupo de antibiticos. Los resultados (S, I, R) obtenidos con estas molculas pueden ser ampliados a los antibiticos del grupo, que en ese caso no es necesario ensayar

2.- Cuando va aplicar un tratamiento en base a un antibiograma Cul de los parmetros anteriores deber de elegir?

http://danival.org/600%20microbio/6200microclin/antibiot/antibiot_100_antibiotico.html http://www.portalesmedicos.com/publicaciones/articles/418/1/Antibioticos-Tipos-eindicaciones-Apuntes-de-infectologia-Enfermedades-infecciosas-Apuntes-demedicina.html