_________________________________________________________Microbiología General
PRÁCTICA Nro. 9
OBTENCIÓN DE CULTIVO PURO o AXÉNICO
MÉTODOS DE SIEMBRA
OBJETIVOS
✓ Obtener colonias aisladas
✓ Conocer las diferencias técnicas de aislamiento en medios de cultivo sólido para la
obtención de cultivos puros de bacterias.
En la naturaleza los microorganismos se
encuentran en comunidades más o menos
complejas. Una técnica esencial en
microbiología es la que permite la obtención
de cultivos puros o axénicos (contienen un
solo tipo de microorganismos), a partir de los
cuales son posibles estudios sobre las
propiedades de un microorganismo
concreto. Aunque existen numerosas
técnicas de aislamiento, las más utilizadas
emplean un medio de cultivo sólido sobre el
que desarrollaran colonias macroscópicas
como resultado del crecimiento y división de
los microorganismos. Teóricamente cada
colonia procede de la multiplicación de una
sola célula; sin embargo, una colonia
también puede ser resultado de la
multiplicación de un agregado de células. Por
otra parte, no todas las células bacterianas
son capaces de formar colonias, ya que no
crecen en medios de cultivo. Por ello, lo más
correcto es hablar de UNIDADES
FORMADORAS DE COLONIAS (UFC) al
referirnos al origen de una colonia.
Obtención de cultivos puros
Se trata de obtener el cultivo de un solo tipo
microbiano en un medio de cultivo, para ello,
se obtiene una pequeña cantidad de masa
bacteriana y se siembra en medio sólido,
para el crecimiento de colonias separadas.
Es aconsejable hacer un segundo aislamiento
antes de obtener el cultivo puro. Si todas las
colonias de la segunda placa resultan
idénticas, puede usarse una de ellas para
establecer el cultivo puro. Obtenido el
cultivo puro es conveniente comprobar su
pureza mediante tinción de Gram. Los
cultivos puros de microorganismos son
mantenidos en el laboratorio por
RESIEMBRAS (pase de un medio de cultivo a
otro).
El aislamiento requiere un reducido inóculo
de partida. Un error frecuente consiste en
tomar muestras grandes, lo que es
innecesario. Una colonia de bacterias del
tamaño de la cabeza de un alfiler contiene
varios millones de microorganismos, es obvio
que con una cantidad pequeñísima (casi
invisible) que se adhiera al asa, será más que
suficiente para efectuar una transferencia
exitosa.
1. Técnica de inoculación en tubos
Los medios en tubo pueden ser líquidos,
semisólidos (0,3 – 0,5% de agar) o sólidos (1-
2% de agar). Quitar el tapón con los dedos
meñique y anular como demuestra la figura.
Al inocular en medio líquido, el tubo debe
estar inclinado 30° aproximadamente, con el
asa se toca la superficie interna del vidrio,
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por encima del punto donde la superficie del
medio forma un ángulo agudo, cuando el
tubo se vuelve a colocar en posición vertical,
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el área inoculada queda sumergida en el
medio, agite ligeramente el asa.
Los picos de flauta, slant (planos inclinados)
de agar se inoculan atravesando primero
hasta el fondo del agar, realizando una
punción sin tocar el fondo del tubo a más o
menos 0,5 cm de distancia y luego se retira
con movimientos en “S” a través del agar, en
estría. En otros casos solo sembrar la
superficie en “S”.
Cuando se realiza siembra en agar semisólido
(para pruebas de motilidad), la siembra es en
picadura, es importante que con la aguja
bacteriológica se realice la punción hasta el
fondo del tubo y que sea retirado por el
mismo camino manteniendo el pulso firme.
2. Técnica de inoculación en caja Petri
a. Técnicas de siembra por estría en placa:
Con un asa de siembra se toma una muestra
de la población mixta y se hacen estrías
sobre la superficie de un medio sólido.
En el aislamiento por estría (agotamiento) se
puede diferenciar:
1. Estría única, depositamos la muestra lo
más alejado del operador y realizamos
la siembra en forma de zig-zag, así,
vamos descargando la muestra del asa.
Es importante no volver a repasar el
trozo de medio de cultivo que ya hemos
sembrado, para que al final de la estría
obtengamos colonias aisladas, además
es importante que al principio las estrías
estén más juntas y que la cantidad de
muestra tomada sea la adecuada.
2. Estría múltiple. Se realiza varias estrías,
esto se puede llevar a cabo flameando
el asa de paso en paso, es decir, de
estría en estría, o sin flamear el asa.
Además, dependiendo de la forma en
que hagamos las estrías, existen varios
tipos de estriados.
- Estriado sobre 4 cuadrantes: se utiliza
para conservar algunos
microorganismos de interés. Consiste en
sembrar uno a uno los cuadrantes, sin
flamear el asa entre estría y estría, de
tal forma que en el 4to cuadrante, al ir
agotando la muestra del asa, tendremos
los microorganismos aislados.
- Esterilizando el asa entre siembra y
siembra: consiste en realizar un primer
estriado en uno de los extremos de la
placa, esterilizar el asa, girar un poco la
placa y realizar otro estriado
introduciendo el asa en el primer
estriado para ir arrastrando la muestra y
volver a repetir esta operación con un
tercer estriado.
- Sin esterilizar el asa entre siembra y
siembra: se lleva a cabo igual que en el
caso anterior salvo que no se flamea el
asa entre los estriados y por lo tanto, no
es necesario arrastrar la muestra de las
primeras siembras.
Es muy importante realizar el mayor número
de estrías posible. En las primeras estrías
aparecerán colonias confluentes o una masa
continua de microorganismos. En las estrías 39
finales deberán aparecer colonias separadas
unas de otras. El propósito de esta técnica es
diluir el inóculo para obtener colonias
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aisladas para poder subcultivarlas en otros
medios y obtener cultivos puros.
b. Los métodos de vertido en placa y
extensión en placa
Las suspensiones de células microbianas se
diluyen antes de su siembra en placa. Se
siguen estas técnicas cuando la muestra
contiene tantos microorganismos, que la
dilución no se puede realizar en una sola
etapa. Ej. Una suspensión con mil millones
de células por mililitro debe ser diluida varias
veces (diluciones seriadas) para obtener una
suspensión que al colocar en medió sólidos
puedan diferenciarse colonias.
A continuación, se puede proceder de 2
maneras diferentes. En el método de vertido
en placa o siembra en profundidad, las
muestras diluidas se mezclan con agar
fundido y atemperado a 45-50°C, para luego
verterlo en la caja de Petri vacía. Tras
distribuirlo uniformemente, se deja enfriar
hasta su solidificación. Algunas colonias
quedarán embebidas en el agar y otras
crecerán en la superficie.
En el segundo método (extensión en placa),
las muestras diluidas se siembran
directamente en la superficie de la placa de
agar ya solidificado, extendiéndolas con
ayuda de un asa de Drigalsky de cristal
estéril. La suspensión se absorbe en el agar,
dejando las células microbianas sobre la
superficie.
Las 2 técnicas de siembra por dilución
presentan la ventaja de que permiten
obtener un mayor número de colonias
aisladas que el método de siembra por
estría, por tanto se eligen cuando se ha de
seleccionar una cepa a partir de una mezcla
con varios tipos de microorganismos.
Criterios para la diferenciación de colonias
Tras la incubación en condiciones adecuadas,
cada célula viable origina una colonia visible
resultado de sucesivas divisiones celulares.
La interpretación de los cultivos luego de
incubar 24 a 48 hrs requiere la evaluación de
las colonias para decidir si es necesario
procedimientos adicionales. Esta valoración
de las características de las colonias se las
realiza mediante la inspección visual,
sosteniendo la placa en una mano y
observando la superficie del agar para
detectar crecimiento bacteriano bajo
iluminación directa.
Características morfológicas de las colonias
en medio sólido:
Tamaño: diámetro en milímetros
Forma, Elevación, Bordes o margen (ver
figura 3)
Color: blanco, amarillo, negro, naranja, etc.
Superficie: brillante, opaca, pulverulenta,
lisas, rugosas, etc.
Consistencia: butirosa, mucoide, dura,
blanda, etc.
En ocasiones el olor también es
característico. Ej. zumo de uva Pseudomona,
chocolate quemado Proteus, sotano mohoso
Nocardia y Streptomyces, pútrido
Clostridium.
Hemólisis en agar sangre
Alfa: parcial aclaramiento de la sangre
alrededor de las colonias, con decoloración
verde del medio.
Beta: zona de completo aclaramiento de
sangre alrededor de las colonias, debido a la
lisis de los glóbulos rojos.
Gamma: no hay cambio en el medio
alrededor de la colonia.
Producción de pigmentos
Piocianina, Pigmentos fluorescentes,
pigmentos no difundibles confinados a
colonias. Pigmentos solubles en agua
coloreando el medio.
Cambios en medios diferenciales
Distintos colorantes, indicadores de pH y
otros ingredientes están incluidos en
diferentes medios, para servir como
indicadores de actividades enzimáticas y 40
ayudar a la identificación de aislamientos
bacterianos.
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✓ La contaminación y pérdida del cultivo

PRECAUCIONES en estudio.
Para impedir la contaminación de los ✓ La salida y dispersión de
cultivos, es necesario tener plena conciencia microorganismos del cultivo, lo que
de la ubicuidad de los microorganismos, lo ocasionaría la contaminación de
que determina que el aíre y todas las utensilios, productos y del personal.
superficies estén densamente pobladas Este último aspecto es particularmente
por microorganismos, de este modo en la importante cuando se trabaja con
transferencia de una muestra microbiológica cultivos de microorganismos patógenos.
a otro recipiente, se deben tener una serie
de cuidados que eliminen los riesgos de
contaminación. Estos incluyen el área de
trabajo, el lavado de las manos, la
esterilización de todos los utensilios y medios
de cultivo a emplear, trabajar cerca de la
flama del mechero; el seguimiento cuidadoso
y detallado de las mismas evita accidentes
tales como:

Figura 1. Tipos de crecimiento en tubos con agar inclinado.

Figura 2. Tipos de crecimiento en tubos con caldo

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Figura 3. Tipos de crecimiento en caja de Petri con medio sólido

CUESTIONARIO

• ¿Por qué las placas de agar deben mantenerse invertidas durante la incubación?
• ¿Describa un procedimiento para conservan las cepas bacterianas congeladas por varios
años?

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