FUNDAMENTOS. ESPECTROFOTOMETRIA 4.

0 / M4 / FISICA

FUNDAMENTOS. ESPECTROFOTOMETRÍA/
Versión 4.0/
MODULO 4/
CÁTEDRA DE FÍSICA/
FFYB/
UBA/

Cátedra de Física-FFYB-UBA [1]

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Para profundizar los contenidos teóricos que se abordan en ésta guía es aconsejable que
consulten la Bibliografía indicada en el campus.
Ir

Dentro de la misma y también en el campus, se encuentran los Anexos sobre

Espectrofotometría y Espectrometría UV, visible e IR. Ambas guías complementan la
información descripta a continuación.
Ir Ir

El término espectrofotometría hace referencia a una serie de técnicas analíticas que se fundamentan en la
espectroscopía atómica y molecular. Permiten obtener información a partir del análisis de las distintas
interacciones de las radiaciones electromagnéticas con la materia.
En la química analítica, una manera práctica y precisa de conocer la concentración de una solución consiste
en medir el efecto que dicha concentración tiene sobre la intensidad de un haz de luz luminoso que incide
sobre ella.
Para comprender que ocurre en el seno de una solución cuando un haz de luz la atraviesa, consideremos
una cubeta de material transparente y no absorbente que contiene la solución con el analito cuya
concentración se desea conocer. Si se ilumina la solución con luz monocromática (luz de una sola longitud de
onda) ocurrirá que parte de la intensidad de esa luz (Io) será absorbida por las moléculas que están en dicha
solución (Ia), parte se reflejará (Ir) y parte será transmitida (It).
Podemos representarlo esquemáticamente como se muestra en la figura 1:

Figura 1: Luz que incide sobre un tubo conteniendo una solución coloreada

Para que se cumpla el principio de conservación de la energía, la suma de éstas tres últimas será igual a Io:

Io = Ir + Ia + It Ecuación 1

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Si la incidencia del haz de luz es normal a la pared del tubo que contiene la solución, la luz reflejada será
despreciable y la ecuación se reduce a:

Io = Ia + It Ecuación 2

Si se divide esta expresión por Io, y se llama absorción ( S ) a la relación Ia / Io y transmitancia ( T ) a la

relación It / Io, se obtiene la expresión:
1= S+T Ecuación 3
Esta es la expresión matemática de la ley de Grotthus - Draper.
¿Cómo resultará la intensidad transmitida con respecto a la incidente si aumenta o disminuye la intensidad
de la fuente? ¿Y si se aumenta o disminuye el espesor de la cubeta que contiene a la solución?
La expresión matemática que involucra a estos parámetros es la siguiente:

dI dI
-  = k. l reordenando:  = - k. l Ecuación 4
I I

Lo que significa que la variación (disminución) de la intensidad es directamente proporcional al espesor del
material interpuesto ( l ) y a una constante k propia de cada material, llamada coeficiente de absorción.
Si procedemos a integrar la ecuación anterior entre ciertos límites se obtiene:

It dI l
∫  = - k ∫ dl Ecuación 5
I0 I 0

Resolviendo
It It
-(k.l)
ln  = - k . l Ecuación 6 ⇒  = e Ecuación 7
I0 Io

Despejando It
-(k.l)
It = Io . e Ecuación 8

Esta fórmula es una expresión matemática de la ley de Lambert, que dice que la intensidad de la luz
monocromática transmitida decrece en forma geométrica cuando el espesor del medio absorbente crece en
forma aritmética.
¿Qué ocurre si manteniéndose constante la intensidad incidente y el espesor, se aumenta o disminuye la
concentración de la solución atravesada por la luz?

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Un desarrollo matemático análogo, sustituyendo a dl por dc (variación de la concentración), lleva a la

siguiente expresión matemática:
- (k′.c)
It = Io . e Ecuación 9

La intensidad de luz monocromática transmitida por la solución de una sustancia determinada decrece en
forma geométrica cuando su concentración aumenta en forma aritmética.
Si se repite la experiencia variando a la vez el espesor bajo el cual se observa y la concentración de la
solución, cambiando además la base e a base decimal, se llega a la siguiente expresión:

-a.c.l Ecuación 10
It = Io . 10

Esta expresión se conoce con el nombre de Ley de Lambert - Beer, donde a es una constante denominada
absortividad. Esta ley se cumple trabajando a bajas concentraciones y en presencia de luz monocromática.
Reordenando y reemplazando obtenemos una relación entre transmitancia ( T ) y concentración ( c ):

It
-a.c.l
T =  = 10 Ecuación 11
Io

Según la ecuación no existe una relación lineal entre ambas, sino que se observa que la transmitancia decae
en forma exponencial con la concentración. La misma relación se mantiene para T% (que es la T expresada
en porcentaje) y concentración según se muestra abajo, en el gráfico de la figura2.

Figura 2: T% en función de la concentración

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Recordando que a es una constante, la misma es propia de cada sustancia y depende de la longitud de onda,
la temperatura y el solvente con que se trabaje. Para comprender mejor su significado, a partir de la ley de
Lambert – Beer (ecuación 10) aplicando logaritmos y reordenando a queda expresada como:

- log It / I0 - log T
a =  =  Ecuación 12
l.c l.c
A partir de la ecuación 12 surge un nuevo parámetro: la absorbancia (Abs) que es – logaritmo T (o bien,-
log It /I0 ).
Entonces, reordenando y reemplazando:

- log It / I0 = Abs = a . c . l Ecuación 13

Reordenando la ecuación anterior la absortividad (a) se puede definir como la absorbancia (Abs) que
presenta una solución de concentración unitaria de una sustancia, observada bajo un espesor unitario.

a = Abs / ( l . c ) Ecuación 14

El valor numérico de a depende de las unidades de concentración empleadas. Si c se expresa en g/mL, se

-1
obtiene la absortividad específica (ao) y [ a ] = mL . (gr . cm) . Si c se expresa en moles por litro, se obtiene
-1
absortividad molar o coeficiente de extinción molar ∈, y sus unidades serán L . (mol . cm) . Notar además

que Abs es una magnitud adimensional.

Relacionando las ecuaciones anteriores se obtienen:

Abs = a . l . c = - log T = - log It / I0 Ecuación 15

y T = 10-Abs Ecuación 16

Según la Ecuación 15, si se representa gráficamente Abs = f ( c ) en teoría, el gráfico mostrará una relación
lineal entre las dos variables, siempre que se trabaje con luz monocromática y a bajas concentraciones. Esto
sin embargo, puede cumplirse para algunas sustancias pero no para otras. Si se trabaja con una sustancia
determinada y midiendo la absorbancia de distintas concentraciones de la misma se obtiene una
representación lineal entre las absorbancias medidas y las correspondientes concentraciones, entonces “esa
sustancia“ cumple la Ley de Lambert Beer en el rango de concentraciones usadas.

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Es importante recalcar que la variable física “real” es la transmitancia y no la Absorbancia. El instrumento de

medida, que es el espectrofotómetro, determina Transmitancia a partir de la medida de Intensidad
transmitida comparándola con la intensidad Incidente. El parámetro Absorbancia es creado a partir de una
relación matemática para simplificar el tratamiento. Como vimos ésta, a diferencia de la transmitancia,
presentará una relación directamente proporcional con la concentración de una sustancia que cumpla con la
ley.

Valores límites de absorbancia y transmitancia:

Analizando las ecuaciones anteriores podemos establecer los límites de estos parámetros:

Si no hay absorción ⇒ It = Io, entonces T = 1 y Abs = 0

Si hay absorción total ⇒ It = 0, entonces T = 0 y Abs = ∞

T varía entre 0y1⇒T% varía entre 0 y 100 %.

Abs varía entre 0 e ∞.

El espectrofotómetro posee dos tipos de tipos de escalas: la escala de transmitancia %, que es lineal y

abarca de 0 a 100% y la escala de absorbancia que es logarítmica y abarca de 0 a ∞. Si bien en los

espectrofotómetros analógicos éstas se pueden visualizar, en nuestros instrumentos de medida como el
display es digital, muestra directamente el valor de T% ó de Abs, según se seleccione. Ver más en anexo Ir
de espectrofotometría.
Antes de introducirnos en la instrumentación, es importante recordar que a partir de la ley de Lambert-Beer
se pueden estudiar sustancias coloreadas en el visible aportando mucha información acerca de ellas
(también se pueden estudiar compuestos que absorban en el UV y en el IR). Para esto una de las primeras
herramientas es la realización de un barrido espectral. El mismo se obtiene trabajando con una misma
solución coloreada (de concentración constante) y midiendo los valores de Absorbancias correspondientes
a distintas longitudes de onda seleccionadas dentro de un determinado rango de trabajo. El gráfico de
Absorbancia en función de longitud de onda constituye el espectro de absorción de la sustancia y es
característico de cada sustancia. En general cuando no se sabe nada de la sustancia coloreada en estudio se
realiza un barrido a lo largo de todo el visible es decir de 400 a 700 nm.

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Dicho espectro podrá presentar uno o varios picos de máxima absorción, propios de cada sustancia en
particular. En el TP lo analizarán por ejemplo, con el azul de Metileno y el Paranitrofenol. El espectro de una
sustancia puede utilizarse también como criterio de identificación. Para ello se debe disponer de antemano
de un espectro de la “supuesta” sustancia con el cual se pueda comparar el barrido espectral realizado con
sustancia en estudio. Además, como nos permite visualizar la variación de la Abs y de la absortividad (dado
que la concentración es constante) con la longitud de onda, ello puede ser aplicado para decidir una
longitud óptima de trabajo en el caso que por ejemplo, se quiera realizar la cuantificación de una sustancia.
(Ver más adelante en Elección de la longitud óptima de trabajo). Ir
Otra aplicación consiste en utilizar un barrido espectral de una sustancia en particular, para evaluar el
comportamiento de parte del instrumental. En este caso se debe conocer previamente el espectro de la
sustancia elegida y en el mismo deben aparecer picos bien definidos de máxima absorbancia.
Específicamente lo trabajarán en el TP cuando realicen el control de centro de banda que se verá en el
apartado de controles espectrofotométricos.
Ir

Instrumentación
Para comprender el funcionamiento del espectrofotómetro se puede analizar el siguiente esquema básico:

Fuente de Ranura de Sistema de Ranura de Cubeta Detector

luz entrada monocromación/ salida con
selector de λ muestra

Figura 3: Esquema de un espectrofotómetro

La fuente de luz proporciona un haz policromático que es colimado al atravesar la ranura de entrada.
Este haz llega a un sistema de monocromación y después con el selector de longitud de onda, se aísla un
haz monocromático de la longitud de onda deseada. Luego, el rayo de luz monocromático incide
perpendicularmente sobre la pared de la cubeta, la cual contiene la muestra. El haz de luz transmitido al salir
de la muestra impacta sobre el detector, donde la intensidad luminosa se convierte en intensidad eléctrica,
mediante un proceso electrónico. Luego, dicha señal se transforma en una lectura de transmitancia
porcentual o absorbancia que aparece en el display.

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El espectrofotómetro es una herramienta importante del laboratorio y de su buen funcionamiento depende

la calidad de los resultados que se obtienen. Para informar un resultado confiable es necesario estar seguros
de que el equipo utilizado funcione correctamente, por ello se realizan los controles espectrofotométricos.
Éstos permiten controlar y analizar determinados parámetros y verificar si se encuentran dentro de los
rangos de aceptabilidad establecidos, o bien en caso contrario, proceder a calibrar o a reparar. A su vez, la
realización de los controles espectrofotométricos deben efectuarse con cierta periodicidad que dependerá
de cada control en particular.

A- CONTROLES ESPECTROFOTOMÉTRICOS

1. Control de luz espuria accidental

La luz espuria accidental o errática es toda luz que llega al detector sin haber atravesado la muestra cuya
absorbancia se quiere medir, pudiendo ser de la misma o de diferente longitud de onda que la seleccionada.
Se puede ver esquemáticamente en figura 4.

Figura 4: Luz espuria. 1: reflexiones internas, dentro del tubo;

2: luz que pasa por “arriba del menisco” de la solución;
3: luz que llega por los costados del tubo sin atravesar la muestra

Observando la figura, la luz que llega al detector puede provenir de reflexiones internas dentro del tubo o
cubeta (1). En otros casos puede “pasar por arriba del menisco” de la solución a medir (2), por ejemplo
cuando se trabaja con un volumen inferior al volumen mínimo. También puede pasar por los costados del
tubo o cubeta por afuera (3), cuando el espesor del tubo o cubeta es menor al que le corresponde de
acuerdo al portatubo o portacubetas del instrumento. Otra situación donde hay luz espuria accidental,
ocurre cuando hay un inapropiado cierre del compartimento donde se ubica el tubo con la muestra.
También puede deberse a la presencia de “goteras” en el del aparato (orificios en la carcasa del aparato por
donde entra luz) que pueden detectarse iluminando el instrumento desde el exterior con una linterna,
cuando el mismo está siendo usado en la zona del visible. La “gotera” puede corregirse tapándola con cinta
negra. Otra causa de producción de luz espuria accidental puede ser el mal alineamiento de la cubeta o del
sistema porta cubeta o de la fuente de luz.

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La luz espuria se mide en porcentaje de transmitancia y es importante que dicho porcentaje sea bajo. De lo
contrario, se pueden producir desviaciones de la linealidad instrumental, dado que llega al detector más luz
de la que debería. El porcentaje máximo aceptado de luz espuria es del 1 %.
Los métodos para detectar la luz espuria accidental incluyen filtros o soluciones que son “opacos” en los
rangos habituales de trabajo. Así se puede utilizar una cubeta de obstrucción de paso de luz (que es una
cubeta pintada de negro o sea un cuerpo negro) o bien una solución hiperconcentrada de colorante. En
todos los casos se leerá la transmitancia contra una cubeta con agua, a la λ seleccionada dentro del visible. El
valor leído representa directamente el % de luz espuria accidental.
Además de la luz espuria accidental existe la luz espuria parásita, que es la radiación electromagnética de
longitud de onda distinta a la seleccionada con el selector de λ que llega al detector, pasando o no por la
muestra. Es decir es luz de “distinta λ” (luz de distinto color) que la nominal. Como consecuencia de ello,
hay un aumento no deseado de transmitancia (o, una disminución de la absorbancia), dado que la luz
espuria parásita no es absorbida por la solución en la misma proporción que la nominal. Como este
fenómeno es más frecuente en los extremos del espectro visible, es común utilizar para su detección
paranitrofenol, que es un colorante que tiene su pico de absorción en uno del los extremos del visible (405
nm) donde se supone que la luz parásita se observa en mayor proporción. Este control de luz parásita debe
hacerse con una solución hiperconcentrada en una zona de máxima sensibilidad y el detector debe recibir
luz, o sea que la solución contenida en el tubo debe permitir el pasaje de luz. Por ello no puede emplearse
un cuerpo opaco (cubeta negra) pues obstruiría el pasaje de luz al detector de cualquier tipo de luz espuria
(parásita o accidental). La luz parásita está relacionada con fallas en el sistema de monocromación,
especialmente cuando se utilizan redes de difracción donde la calidad de la misma puede variar según su
construcción (ver redes de difracción en anexo espectrofotometría) Ir
Este control debe realizarse trimestralmente.

2. Control de volumen mínimo

Se considera como volumen mínimo, al mínimo volumen contenido en una cubeta a partir del cual la lectura
se estabiliza y no varía con el agregado de más líquido. Dicho control nos asegura que toda la luz pase por la
solución y no pase “por arriba” o por el menisco, lo que produciría resultados erróneos.
Este control es importante también desde el punto de vista económico, pues cuanto menor sea el volumen
mínimo, más economía se puede lograr en el uso de reactivos. Es fundamental realizarlo cuando se lo utiliza
por primera vez y sobre todo cuando el aparato es nuevo pues muchas veces el fabricante indica un valor
mínimo inferior al real, lo que puede acarrear serios errores en las determinaciones.

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Ahora en la práctica, no se coloca en la cubeta un volumen igual al volumen mínimo, sino que se utiliza un
volumen superior a éste en un 20% que se denomina volumen de trabajo. Esto se hace pues muchas veces
al realizar el trasvasado desde el tubo primario (donde por ejemplo, se realiza la reacción colorimétrica) a la
cubeta de lectura, puede que quede una pequeña porción del volumen en el tubo de reacción. Como
consecuencia si el volumen en el tubo primario corresponde al volumen mínimo calculado, el volumen que
llegue a la cubeta de lectura puede que sea menor a éste. Por esta razón, al usar el volumen de trabajo nos
asegurarnos que en la cubeta de lectura, el volumen siga siendo apropiado para leer correctamente.

3. Control de cubetas
Se realiza para comprobar las cualidades ópticas y de construcción de las cubetas de medida. Se mide la T %
de las cubetas llenas de agua o solución diluida de colorante, tomando una de las cubetas cargadas como
referencia y verificando las desviaciones de las demás. Para poder usarlas entre la cubeta de referencia y
cada una de testeadas no debería existir una variación superior al 1% de T, que se deberá corregir como
error sistemático, siempre que la diferencia sea pequeña.
La finalidad de tener varias cubetas de iguales características es agilizar el proceso de medida, sobre todo
cuando son varias las muestras a analizar. Para trabajar la idea es conseguir al menos dos o tres cubetas que
cumplan con el control. En el caso de no conseguir cubetas que reúnan esta condición se deberá trabajar
siempre con la misma cubeta y manteniéndola en la misma posición de lectura.
Este control se debe realizar cada vez que se usen las cubetas.

4. Control de centro de banda:

Este control tiene como finalidad verificar la concordancia entre la longitud de onda fijada con el selector del
instrumento (la leída en el display) y la real que es la que llega efectivamente a la muestra, en aparatos de
rango continuo.
Para realizar este control debe hacerse un barrido espectral con una sustancia conocida tomada como
referencia y de espectro conocido. Estas sustancias deben presentar en su espectro uno o más picos de
absorción que deben ser estrechos y estar bien definidos. Esto implica que deben conocerse las longitudes
de onda máxima, que son las longitudes de onda correspondientes al valor de máxima absorción de cada
uno de los picos, con un alto grado de confianza. Además, los picos deben estar
distribuidos dentro de todo el intervalo espectral del instrumento (recordar que abarcan las zonas del visible
y parte del UV e IR). Así son ideales los filtros de cristales de holmio que presentan varios picos
característicos a: 333, 418, 453, 536 y 636 nm. También los filtros de didimio y las soluciones de dicromato

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de potasio cumplen con estos requisitos. Sin embargo, muchas veces por una cuestión económica o de
complejidad en la preparación, no se dispone de sustancias de referencia que abarquen todo el rango
espectral, entonces puede recurrirse a sustancias que abarquen un rango más estrecho y que serán útiles
para un determinado rango de trabajo. Supongamos que se realiza el barrido espectral con una sustancia de
referencia que presenta un solo pico en el visible y del cual se conoce su correspondiente longitud de onda
máxima. Si luego de haber realizado la medición el valor de la longitud de onda correspondiente al valor de
máxima absorbancia leído, coincide con el valor de longitud de onda de referencia de dicho pico, podremos
asegurar que en esa zona el aparato trabaja a las longitudes de onda indicadas por el selector pudiendo
trabajar con confianza en ese intervalo. Ahora bien, esto no asegura que en otros rangos de longitud de
onda exista igual correlación, por ello se utilizan otras sustancias con máximos en otras zonas para poder
complementar el control.
Otro método de control de centro de banda es el método del punto isosbéstico. El punto isosbéstico se
define como la longitud de onda a la cual las formas ácida y básica de una misma sustancia, en
concentraciones equivalentes, tienen igual absorbancia. Las sustancias que cumplen esta condición son
algunos indicadores colorimétricos de pH como el rojo congo, rojo fenol, azul de bromofenol, entre otros. La
importancia del método radica en que el punto isosbéstico es independiente de la concentración de la
sustancia y de la temperatura entre 4º y 45º C. Se deben realizar los espectros de absorción de alguna de las
sustancias mencionadas en sus formas ácida y alcalina en igual concentración, y a partir de ellos determinar
gráficamente el punto isosbéstico (ver figura 5). Obsérvese que también es un control zonal.

1,2

0,8
Absorbancia

S. Alcalina
0,6
S. Ácida

0,4

0,2

0
400 450 500 550 600
Longitu de onda (nm)

Punto Isosbéstico

Figura 5. Espectros de un colorante en sus formas ácida y básica

para determinar el punto isosbéstico

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Luego de realizado el control, el resultado puede indicar que la λ real y la leída coincidan o bien puede haber
una diferencia entre ambas. Esa diferencia se la conoce como desplazamiento o corrimiento de la longitud
de onda y se mide en nm. Si ésta es pequeña y entra dentro del rango de aceptabilidad estipulado se la pude
considerar como error sistemático y corregir. En caso contrario de debe realizar un ajuste de la escala de
longitudes de onda por parte del servicio técnico.
El control de centro de banda debe realizarse al instalar o reinstalar el aparato, al cambiarlo de ubicación, al
cambiar la lámpara y por lo menos semestralmente.
Por último, hay que tener presente que en muchas de las determinaciones colorimétricas utilizadas en la
práctica profesional, se conoce de antemano la longitud de onda óptima de trabajo (ver apartado más Ir

adelante), como Uds. lo verán en el TP en la determinación de proteínas por el método de Biuret. Esto es útil Ir
pues conociendo dicho valor, se evita realizar un barrido espectral y se ahorra tiempo. Teniendo en cuenta
que la longitud de onda óptima de trabajo seleccionada se corresponde con un máximo de absorción del
cromógeno en la mayoría de los casos, si ésta por corrimiento del selector, no coincide con la estipulada, lo
más probable es que se pierda sensibilidad al realizar las medidas. Si además, el pico es muy estrecho, la
bajada de absorbancia alrededor de dicha longitud óptima será muy abrupta y al variarse mínimamente la
longitud de onda con el selector se producirá un error muy significativo en el valor de la lectura (ver el
apartado desviaciones de la ley en Anexo de Espectrofotometría). En otros casos, para calcular la actividad
Ir
de una enzima, la técnica directamente incluye el uso de “un factor” a aplicar a las lecturas para conocer
directamente dicha actividad. Si la longitud de onda no es la correcta el resultado no será válido, pues
estaríamos cometiendo error en la medida de absorbancia al trabajar a otra longitud de onda.

5. Control de linealidad fotométrica:

Indica la linealidad de respuesta del sistema de detección, y por ende el rango de utilidad de medida del
instrumento. En espectrofotómetros de alta calidad se obtienen respuestas lineales hasta valores cercanos a
2,000 de absorbancia.
Para este control se debe trabajar por ejemplo con algún colorante en solución, que se sabe que cumple con
la Ley de Lambert-Beer, es decir que presenta un comportamiento lineal entre absorbancia y concentración
en el rango de trabajo utilizado.
Para realizarlo, se deberán medir las absorbancias de soluciones de concentraciones crecientes del colorante
utilizado y contrastar dichos valores con las absorbancias de referencia certificadas (que figuran en el inserto
que viene con las soluciones o en el rótulo de los envases de las soluciones de referencia). Si el equipo

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cumple con el control, el gráfico de absorbancia experimental en función de absorbancia de referencia será
lineal hasta el último valor de absorbancia experimental y éste último valor será “el máximo valor de
absorbancia aceptable” para cualquier otra medida. En el caso de que el equipo testeado no presente
linealidad en todo el rango, se deberá informar hasta que valor de absorbancia experimental hay linealidad.
Para realizar este control, cuando no se dispone de los valores de referencia de absorbancias y sí se conocen
las concentraciones de las soluciones a medir, se puede realizar un gráfico de absorbancia en función de
concentración a partir del cual también se podrá evaluar la linealidad fotométrica. Por cualquiera de los dos
procedimientos empleados, el valor máximo de absorbancia obtenido si bien es medido a una determinada
λ, será también el máximo valor aceptable a cualquier otra λ del espectro visible.
La baja linealidad puede ser debida a problemas electrónicos, presencia elevada de luz espuria (mayor al 1%
de T) entre otros factores y debe ser corregida por el servicio técnico del equipo. Este control se debe
realizar trimestralmente.
Por otra parte, es importante no confundir linealidad fotométrica, que es la que se verifica con este control,
con el cumplimiento de la Ley de Lambert-Beer por parte de una sustancia dentro de un determinado rango
de concentraciones. Con este control se ve si efectivamente “el instrumento responde linealmente”. Por
esto es que se debe elegir una sustancia que sepamos de antemano que cumple con Lambert-Beer en los
rangos de concentración utilizados.
Supongamos ahora que disponemos de un instrumento que responde correctamente al control de linealidad
fotométrica en todo el rango de trabajo medido y que con él queremos estudiar una sustancia cuyo
comportamiento es desconocido. Si luego de realizadas las medidas de absorbancia correspondientes a
distintas concentraciones de la sustancia, el resultado indica que la relación no es lineal, esto nos permitirá
afirmar con seguridad el no cumplimiento de Lambert-Beer por parte de esta sustancia, aseveración que no
podríamos mantener si nuestro aparato no hubiese respondido linealmente.

6. Control de veracidad fotométrica:

A través de éste control se verifica la concordancia entre la absorbancia de referencia, obtenida con una
solución estándar de referencia certificada medida en un equipo calibrado, y la absorbancia de la misma
solución medida en el equipo que se está controlando. Por lo tanto el control permite analizar la veracidad
de los resultados obtenidos con el equipo controlado.
La veracidad fotométrica se calcula mediante el cálculo del error fotométrico porcentual (EF%) según la
siguiente expresión
(Abs exp – Abs ref) . 100
EF % = +/- Ecuación 17
Abs ref

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Donde la Abs exp corresponde al promedio de la serie de medidas realizadas de la solución de referencia con
el instrumento a controlar.
En la práctica el valor leído de absorbancia no debe variar significativamente del valor de referencia, pues a
partir de una absorbancia leída se puede determinar, como comentamos anteriormente, la concentración un
analito o una actividad enzimática. En ésta última muchas veces aplicando solo un factor de cálculo y de
acuerdo a los valores informados a veces implica cambiar el rumbo en una investigación o en otros casos,
una toma de decisión por parte del médico en cuanto a resolver un diagnóstico, medicar o suprimir la
medicación del paciente. De allí la importancia de este control en los aparatos de medida. Luego, ese valor
será confiable solo en el caso de que haya veracidad fotométrica.
Estos controles deben realizarse con estándares que cumplan ciertos requisitos tales como tener un valor de
absorbancia estable a la longitud de onda de trabajo, presentar un pico ancho de absorción, un alto
coeficiente de extinción molar, ser mínimamente sensible a las variaciones de geometría del haz de luz,
como así también a la variación del coeficiente de extinción con la temperatura. Se utilizan como patrones
filtros de vidrio neutros que poseen absorbancia conocidas a distintas longitud de onda, también soluciones
de dicromato de potasio en medio ácido para UV, y soluciones como la cianmetahemoglobina, sales de
cobalto o de cobre, en medio ácido.
Algunas de las fallas por las que el instrumento pueda no cumplir satisfactoriamente con este control
pueden ser: el envejecimiento de la lámpara, el agotamiento del fototubo, un defecto en la calibración de la
longitud de onda, el compartimento de muestra mal centrado con respecto al sistema óptico del
instrumento, una elevada absorción por parte de las cubetas, si no están hechas del material adecuado (por
ejemplo, en UV se trabaja con cubetas de cuarzo pues el vidrio absorbe significativamente).
Este control se debe realizar mensualmente.

7. Control de la precisión fotométrica

Este control tiene como finalidad evaluar la repetitibilidad de una serie de medidas de Absorbancia
obtenidas al realizar varias medidas de una misma solución. A mayor repetitibilidad en la serie de datos,
habrá mayor precisión o bien menor dispersión.
El resultado del control se expresa a través de una medida de la dispersión mediante el cálculo del
coeficiente de variación porcentual (CV%), que relaciona la desviación estándar (S) con la media de la serie
de medidas (Abs exp) expresada en forma porcentual según indica la ecuación:

S . 100
CV% = Ecuación 18
Absexp

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Para realizar el control se puede utilizar una solución coloreada cuyo requisito básico es que su valor de
absorbancia sea estable a través del tiempo. Se utilizan por ejemplo, soluciones de sulfato cúprico o cloruro
de cobalto en medio ácido. No es necesario emplear una solución de referencia certificada.

Algunas consideraciones generales para tener en cuenta en el trabajo espectrofotométrico:

Rango óptimo de lectura en las medidas de transmitancia y absorbancia:

Cuando realizamos medidas de absorbancia o de transmitancia existe un rango de medidas recomendable.
Éste es el comprendido entre 0.100 y 1.000 para Abs y su equivalente en T, que es entre el 80% y 10%
respectivamente. Esto es así ya que en esta región es donde el error espectrofotométrico debido a la
Ir
medida de T es menor (Ver el apartado Errores analíticos en la medida de Transmitancia y Absorbancia en
Anexo de Espectrofotometría).

Elección de longitud de onda óptima de trabajo:

Si disponemos de una sustancia de la cual ya conocemos su espectro y queremos trabajar con ella a una
determinada longitud de onda para ver si cumple con la ley de Lambert-Beer o realizar una cuantificación, la
pregunta que surge es ¿cuál será la longitud de onda adecuada para trabajar? La respuesta tendrá que ver
Ir
con el análisis del espectro obtenido. (Ver el apartado desviaciones de la ley en Anexo de
Espectrofotometría). Este podrá presentar distintos picos de máxima absorción que podremos identificar,
además de individualizar las correspondientes longitudes de onda máxima para cada uno de ellos. También
podremos encontrar zonas de absorbancias estables dentro de un rango de longitudes de onda más ó menos
amplio. Para elegir “la longitud de onda óptima de trabajo” se utilizarán los siguientes criterios:

Se prefiere un máximo de absorbancia, dado que así se obtiene mayor sensibilidad en las lecturas,
siempre que éste se encuentre dentro del rango de absorbancias recomendadas en el apartado anterior.

Hay que evitar en lo posible, trabajar en regiones del espectro donde hay cambios bruscos de
absorbancia, ya que un pequeño desplazamiento en la longitud de onda puede causar un error grande
en la correspondiente lectura.

Muestra, Testigo y Blanco:

En el trabajo práctico se realizará una reacción colorimétrica para determinar la concentración de proteínas
totales presentes en una muestra (o solución incógnita), midiendo su absorbancia y la de soluciones

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Testigos, siendo el testigo una solución que contiene el mismo analito a dosar en la muestra y cuya
concentración es conocida.
Para determinar la concentración de un analito en una muestra, el valor de absorbancia de la misma debe
ser la correspondiente exclusivamente a dicho analito. En la práctica cuando el analito no es coloreado se
usa una reacción química, donde el color generado se debe a la reacción del analito (contenido en la
muestra) con el reactivo (tal es el caso para proteínas con la reacción del Biuret). Si en un tubo, al que
llamaremos el tubo de muestra, colocamos la muestra y el reactivo (estando éste último en exceso) al
reaccionar generarán color dando como resultado un valor de absorbancia. La absorbancia medida se
deberá a la contribución de todos los componentes presentes. Es decir a la muestra y al exceso de reactivo,
en el caso de que este último absorba. En el caso del Biuret el reactivo presenta color a simple vista y
absorberá a la longitud de onda elegida para medir la absorbancia debida a la reacción colorimétrica. En
otros casos la presencia de un solvente o sustancias presentes en la muestra que no sean específicamente el
analito pueden absorber a la longitud de onda de trabajo y por lo tanto contribuir a la absorbancia leída de
dicho tubo. Por ello se deben preparar otros tubos que contengan a éstos para descontar dicha/s
absorbancia/s ya que no corresponde/n al analito que se quiere medir. Estos tubos adicionales pueden ser:
Tubo de referencia o blanco de solvente: este tubo puede contener agua o el solvente que se utilice en la
reacción y que estará presente en todos los tubos. Contra este tubo se leerán todos los demás tubos, es
decir con él se llevará a cero de absorbancia y será la referencia.
Tubo de blanco de reactivo: este tubo se denomina así pues contiene todos los reactivos necesarios para
que se realice la reacción, pero no contiene a la muestra o al testigo. Por lo tanto la medida de absorbancia
de éste será descontada a la del tubo de muestra y a la del tubo de testigo para obtener por diferencia el
valor de la absorbancia debida solamente a la muestra o al testigo, según corresponda.
Tubo de blanco de muestra: este tubo contiene a la muestra pero no al reactivo. Se utiliza para medir la
contribución de otros analitos o sustancias interferentes que estén presentes en la muestra y que no son el
“analito a procesar” y que pueden absorber a la longitud de onda de trabajo y por lo tanto contribuir a la
absorbancia final del tubo de medida. La medida de absorbancia de este tubo también será descontada del
tubo de muestra.
Tubo de blanco de testigo: contiene al testigo pero no al reactivo y tiene la misma finalidad y tratamiento
que el blanco de muestra pero se utiliza el testigo en vez de la muestra y su absorbancia será descontado al
tubo testigo.
En todos los casos se reemplaza el volumen de reactivo, muestra o testigo, por un volumen igual de solvente
en el tubo según corresponda.

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B- DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS POR UN MÉTODO ESPECTROFOTOMÉTRICO

Una de las tantas aplicaciones que tiene la espectrofotometría es la detección y cuantificación de sustancias
detectables mediante una reacción colorimétrica. Como comentamos, en el trabajo práctico determinarán la
concentración de proteínas totales presentes en una solución utilizando la técnica del Biuret.
El reactivo de Biuret contiene sulfato de cobre en medio alcalino y permite la cuantificación de proteínas por
la formación de un complejo coloreado. Esto se debe a que los enlaces peptídicos de las proteínas
reaccionan con el ión cúprico, en medio alcalino y dan un complejo coloreado con un máximo de absorción a
540 nm. La absorbancia de esta solución coloreada es proporcional a la concentración de proteínas totales
presentes en la muestra, en un rango comprendido entre 0,1 y 100,0 g de proteína por L de solución.
Para determinar el valor de las proteínas en una muestra desconocida mediante esta técnica, además de
procesarla según indica el protocolo (ver guía de TP), se debe realizar una curva de calibración. Para esto una
serie de testigos de distintas concentraciones, se procesarán de la misma forma que la muestra. Luego de
registrar sus absorbancias se graficarán dichos valores en función de sus correspondientes concentraciones,
obteniendo así el gráfico de calibración. Esta relación deberá ser lineal, pues las concentraciones de los
testigos utilizados, están comprendidos dentro del rango de validez de la ley. Si luego el valor de absorbancia
correspondiente a la muestra se encuentra dentro de dicho rango se podrá obtener desde la ecuación de
calibración, el valor de la concentración la muestra.
Importante: recordar que las absorbancias de las soluciones incógnita y testigo serán las calculadas luego de
descontar las contribuciones de los blancos correspondientes y deberán estar comprendidas dentro del
rango de linealidad de la reacción.
La curva de calibración se puede realizar con testigos certificados (de origen comercial) que se denominan
calibradores y que presentan un bajo rango de incertidumbre.
Otras veces, cuando por ejemplo se deben procesar muchas muestras en un mismo día y se dispone de la
curva de calibración realizada con anterioridad pueden surgir las siguientes preguntas ¿se debe volver a
calibrar de para determinar la concentración de proteínas de cada muestra? o ¿se puede seguir utilizando la
ecuación provista por la calibración? Para responderlas, además de procesar las muestras se debe procesar
siempre uno o más testigos que funcionen “testeando” el proceso de medida en ese momento. Estos
testigos se conocen como controles de calidad y son también certificados como los calibradores aunque más
económicos, lo que permite utilizarlos en cada medición (si bien presentan un rango un poco mayor de
incertidumbre que los calibradores, esto no va en detrimento de su función). Entonces, si luego de procesar
este control, utilizando la ecuación de calibración, se obtiene un valor de concentración dentro de un rango

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aceptable (según los valores indicados por el proveedor), entonces será válido mantener la calibración y
obtener los resultados de las muestras a partir de ella. En caso contrario, se deberá volver a calibrar
nuevamente para obtener el resultado de cada muestra.

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