FMVZ- UNA Hojas de prácticas de Bioquímica

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PRÁCTICA N° 05
ESPECTROFOTOMETRÍA
La espectrofotometría o fotometría, es uno de los métodos ópticos más utilizados en
los análisis bioquímicos. Permite medir la concentración e identificar ciertas sustancias
aprovechando su capacidad de absorber luz. Muchos compuestos, sean o no coloreados,
tienen la capacidad de absorber luz de una determinada longitud de onda. En otros caos es
necesario transformar la sustancia a un derivado coloreado usando un reactivo adecuado.
Entonces, la fotometría se refiere a la medición de la cantidad de energía radiante que
absorbe unos sistemas químicos a una determinada longitud de onda.

Se denomina colorimetría al conjunto de métodos de análisis cuantitativo que se

fundamentan en la medición de la intensidad de luz absorbida (o transmitida) por una solución
coloreada, ya sea que se trate de soluciones naturalmente coloreadas o que se han coloreado
mediante reacciones químicas adecuadas.

Casi todas las sustancias en solución tienen l capacidad de absorber en forma

selectiva determinadas radiaciones luminosas. La longitud de onda en la que las moléculas
de dichas sustancias absorben con mayor intensidad de luz se denomina longitud de onda
de máxima absorción.

Cuando un haz de luz (luz incidente=Io) atraviesa una solución, una parte de la
radiación queda absorbidas por las moléculas del soluto coloreado, sufriendo una disminución
de su intensidad (luz transmitida=I) proporciaonal a la capacidad de absorción de dichas
moléculas (fig.1).

Figura 1: Ilustración de la Io e I a través de una celda o cubeta

Si consideramos que cada molécula absorbe una determinada cantidad de luz, la

intensidad de la luz transmitida por una solución disminuirá en relación con el aumento del
número de moléculas que se interpongan entre a fuente luminosa y el observador. Este
número varía de acuerdo con la concentración del soluto y el espesor del recipiente que
contiene la solución, estos factores están considerados en las leyes de Lambert y Beer, que
rige los principios de colorimetría.

Dr. Pedro Coila Añasco Mg. Sc. Diannett Benito López

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La mayoría de biomoléculas de interés biológico (proteínas, ácidos nucleótidos,

lípidos, etc.) absorben la luz en la longitud de onda comprendida entre 200 a 800 nm.

ENERGÍA RADIANTE
Las radiaciones electromagnéticas conocidas como luz, están compuestas por
paquetes de energía con movimiento llamados fotones o cuantos. Estas radiaciones no sólo
constan del espectro de colores percibidos por el ojo humano (espectro visible) sino por otras
no percibidas. La corriente de fotones tiene el carácter de una onda, en el cual la distancia de
cualquier punto sobre la onda a un punto equivalente sobre la onda contigua es la longitud
de onda (λ).
La longitud de onda es la distancia entre dos crestas adyacentes (fig. 2). El frente de
la onda se mueve a cierta velocidad. La cantidad de ciclos completos de ondas que pasan
por un punto fijo en una unidad de tiempo es la frecuencia.

Figura 2: Características de una onda.

En el espectro electromagnético, en un extremo están las ondas largas, como las de

radio y televisión, que tienen longitudes de onda superiores a 1000 m. En el extremo opuesto
del espectro están los rayos X y los rayos gamma, que tienen longitudes de onda de 0.1 x 10 -
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a 0.1 x 10-12 m (tabla 1 y fig 3). En el aire, cada fotón viaja a la misma velocidad, es decir, a
3 x 108 m/seg.

Tabla 1: Longitud de onda de las radiaciones del espectro electromagnético

Tipo de radiación Longitud de onda (nm)
Rayos gamma 0.0001- 0.0005
Rayos X 0.0005 -20
Región ultravioleta (UV) 20 – 390
Región visible 390 - 780
Región infrarrojo (IR) 780 - 4 x 105
Ondas radio 106- 1012
Ondas radar 106- 109
Ondas de televisión 109 - 1011

La longitud onda de la luz se relaciona con la velocidad de la luz en el vacío y con la

frecuencia:
λ= c/v
Donde λ es la longitud de onda, c es la velocidad de la luz (3 x 10 10 cm/seg) y v es la
frecuencia (ciclos por segundo). La longitud de onda se puede medir en cm, mm, µm, nmo X.

Dr. Pedro Coila Añasco Mg. Sc. Diannett Benito López

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Figura 3: El espectro electromagnético y la región visible

Leyes de absorción
La absorción de la luz a una longitud de onda dada, está relacionada con la
concentración de especies absorbente por medio de las siguientes leyes:

1. Ley de Lambert
Lambert estudió la cantidad de luz monocromática absorbida por un cuerpo y
enunció la Ley que dice “la fracción de luz absorbida es proporcional al espesor del
absorbente (x) e independiente de la intensidad de la luz”. En otros términos, estableció
la proporcionalidad que existe entre la absorbancia de una solución coloreada y la
distancia que ocurre el haz de luz monocromática en ella (sin variación de la
concentración).
Por ejemplo, si la luz incidente es 100% y cada capa unidad de espesor (x) absorbe
el 20% de la luz, la luz transmitida es de 80%. Para otras capas unidad de espesor x,
la luz disminuirá como sigue: 64 %, 51.2%, etc. que es la secuencia (0.8)0, (0.8)1, (0.8)2,
(0.8)3, etc., lo que conduce a la expresión matemática:
I=I0 x e-ax
Donde: I0 es la intensidad de luz incidentes, I es la intensidad de luz transmitida, x,
el grosor de la capa en cm, y a el coeficiente de absorción del medio.

2. Ley de Beer
Beer estudió la influencia de la concentración de la solución coloreada sobre
la transmisión de la luz monocromática y halló la misma relación entre la transmisión
y el espesor de la capa atravesada. Teniendo en cuenta que la luz se absorbe
solamente cuando un fotón choca con una molécula, la Ley de Beer puede
anunciarse como sigue “cuando un rayo de luz monocromática pasa a través de un
medio absorbente, la cantidad de luz absorbida o la probabilidad de absorción es
proporcional al número de moléculas c, contenidas en el haz de luz”. En otras
palabras, Beer estableció la proporcionalidad que existe entre la absorbancia de
una solución coloreada y la concentración de esta en un haz de luz monocromática
en ella (sin variación de la longitud que recorre el haz).
I=I0 x e-Kc
Donde: I0 es la intensidad de luz incidentes, I es la intensidad de luz transmitida, c
es la concentración en mol/L

Dr. Pedro Coila Añasco Mg. Sc. Diannett Benito López

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La ley de Beer es exacta sólo para la luz monocromática y en muchos casos no se

cumple sobre todo a concentraciones altas.

3. Ley de Lambert-Beer
Es evidente que pueden combinarse las leyes de Lambert y Beer, ya que c como K
incluyen un factor de concentración

EC=K
Donde E es el coeficiente de extinción molar y c es la concentración mol/L. De ahí
se deduce
I = I0 e Ecx
Log I0/I=E c x
log I0 = A
I
Por consiguiente:
A=Ecx
La Ley combinada de Lambert-Beer nos dice: “la fracción de la luz incidente
por una disolución, a una determinada longitud de onda, está relacionada con el
espesor de la capa absorbente x, y con la concentración c, de la especie que se
absorbe”. La Ley de Lambert-Beer supone que la luz incidente es paralela y
monocromática, y que las moléculas del disolvente y del soluto están orientadas al
azar.

Transmitancia
Es la capacidad de una solución para transmitir la luz. Se define como la
relación entre la intensidad de la luz que sale de la solución y la intensidad de la luz
que entre en ella:
T = I0
I
Si la solución es absolutamente transparente I=1, y su transmitancia será 1;
este valor es tanto menor de 1 cuando mayor sea la luz absorbida por la solución.
Se acostumbra también expresar la transmitancia como porcentaje, es decir,
porcentaje de luz transmitida:
%T = I0 x 100
I
Por tanto, los valores de %T van de 0 a 100%, de modo que la expresión de
Lambert-Beer será:
A = log I0 = log 100 = E c x
I %T
Absorbancia
La absorbancia (A) o densidad óptica (D.O) o extinción (E), es la cantidad de
luz absorbida por una solución, equivalente al logaritmo negativo de la transmitancia:

A = -log T = -log I = 2 – log % T

I0
La medida de la absorbancia de la absorbancia de las soluciones se lee en una
escala expresada en unidades logarítmicas que van desde el 0 al 2. El cero corresponde

Dr. Pedro Coila Añasco Mg. Sc. Diannett Benito López

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al 100% de transmitancia; es decir, a una absorción igual a cero; y el 2 corresponde a

una absorción 100% y no se transmite la luz.

El espectrofotómetro
Un espectrofotómetro es un instrumento que sirve para medir la transmitancia o
la absorbancia de una sustancia en función de una longitud de onda determinada.
También puede realizar las mediciones de una serie de muestras por una sola longitud
de onda. Estos instrumentos se pueden clasificar en instrumentos manuales o de
registro, de simple o doble haz. En la práctica, los instrumentos de un solo haz, por lo
general se operan en forma manual y los de doble haz poseen un registro automático
de los espectros de absorción.

Los componentes de un espectrofotómetro son los siguientes (Fig. 4)

a) Una fuente de energía radiante continua, que cubre la región del espectro en el
cual opera el instrumento. La fuente de radiación más común para la región visible,
UV cercano e infrarrojo son las lámparas de filamento de tungsteno.
b) Un monocromador, que es la parte del instrumento que aísla una banda angosta
de longitud de onda de todo el espectro emitido por la fuente. Los componentes
esenciales de un monocromador son las rendijas o ranuras y un elemento dispersor
(prisma).
c) Un recipiente para la muestra (celda)
d) Un detector, que un transductor que convierte la energía en una señal eléctrica a
la lectura apropiada.
e) Un sistema de lectura de la medición pone de manifiesto la longitud de la señal
eléctrica.

Figura 4: Componentes básicos de un espectrofotómetro

Cálculo de la concentración de una muestra problema

Para calcular la concentración que tiene una muestra problema se puede utilizar los
siguientes métodos:

Dr. Pedro Coila Añasco Mg. Sc. Diannett Benito López

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1. Método de la curva de calibración

En este caso se utilizan varios estándares de concentraciones progresivas y un
blanco, luego se realiza la lectura utilizando la longitud de onda para la cual la sustancia
tiene la máxima absorción. Luego se construye una gráfica en un sistema de coordenadas
en la que se colocan las lecturas en el eje de las ordenadas (eje Y) y las concentraciones
en el eje de las abscisas (eje X), con la cual se obtiene una recta que pasa por el origen, si
es que la sustancia obedece a la Ley Lambert-Beer, tal como ilustra la figura 4.

Figura 4: Ejemplo de una curva de calibración (o curva estándar o patrón)

La muestra problema dará una absorbancia, que se busca en el eje Y de la gráfica,

luego por este punto se traza la perpendicular a dicho eje hasta encontrar la curva. En
seguida, por este punto de intersección se traza una paralela al eje Y hasta tocar el eje X.
La concentración de la muestra problema está dado directamente por este punto.

2. Método del factor de calibración

Se conoce como factor de calibración (Fc) a la cantidad de una sustancia (en peso)
de concentración conocida que corresponde a una lectura del fotocolorímetro. Se obtiene
dividiendo la concentración del estándar [St] entre su lectura (Ast):

Fc = [St]
Am
Y para hallar la concentración en la muestra problema [M]:
[M]=Fc x Am

PARTE EXPERIMENTAL:
1.- Determinación del espectro de la absorción de una sustancia (curva de absorción)

Fundamento: Si se mantiene constante el espesor (x) y la concentración (c), la absorbancia

(A) dependerá de la longitud de onda (λ), esto permite hallar la curva de
absorción, así como la longitud de onda de máxima absorción del colorante.

Dr. Pedro Coila Añasco Mg. Sc. Diannett Benito López

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➢ Registre los resultados de transmitancia y calcule las absorbancias en la siguiente tabla.

Longitud de onda Transmitancia (%) Absorbancia

Desarrolle los cálculos:

➢ Grafique estos resultados en papel milimetrado colocando las absorbancias

en el eje Y, y las longitudes de onda en el eje X. luego obtenga la curva de absorción
uniendo los puntos. Determine la longitud de onda de máxima absorbancia.

Dr. Pedro Coila Añasco Mg. Sc. Diannett Benito López

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2.- Elaboración de la curva de calibración y del factor de calibración de una

sustancia (Ley Beer)

Fundamento: Si se mantiene constante la longitud de onda (λ) de máxima absorción de una

sustancia, la absorbancia (A) dependerá de la concentración.

➢ Registre los resultados de transmitancia de las distintas soluciones coloreadas y calcule

la absorbancia y el factor de calibración (FC) para cada uno de los tubos y el FC general
en la siguiente tabla:
Tubo Concentración Transmitancia (%) Absorbancia Factor de
(mL/dL) calibración
1
2
3
Fc general=
Desarrolle los cálculos:

➢ Graficar la curva de calibración en papel milimetrado, colocando las absorbancias en el

eje Y, y las concentraciones del colorante en el eje X.

Dr. Pedro Coila Añasco Mg. Sc. Diannett Benito López

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3.- Determinación de la concentración de una sustancia problema

Fundamento: La Ley de Beer señala que la absorbancia (o transmitancia) de una

sustancia es directamente proporcional a su concentración. Entonces conociendo la
absorbancia de cualquier sustancia (a la longitud de onda de absorbancia máxima para
esa sustancia) se puede determinar la concentración de esa sustancia.

➢ Registre las transmitancias y determine las absorbancias (A) y concentraciones de las

muestras desconocidas utilizando los dos métodos. Complete la siguiente tabla:
Tubo T (%) A Concentración por Concentración
curva de calibración por Fc
1
2

Desarrolle los cálculos:

Cuestionario
1. ¿A qué longitud de onda se obtuvo la máxima absorbancia?
2. Si analizamos una muestra desconocida y nos da una absorbancia de 0.33 ¿cuál será
la concentración del colorante de la muestra?
3. Convertir las siguientes transmitancias (T) a absorbancias (A): 12 %, 46% y 75%.

Dr. Pedro Coila Añasco Mg. Sc. Diannett Benito López