Espectrofotometría
 

ESPECTROFOTOMETRIA

La espectrofotometría es el método de análisis

óptico más usado en las investigaciones
biológicas. El espectrofotómetro es un
instrumento que permite comparar la
radiación absorbida o transmitida por una
solución que contiene una cantidad
desconocida de soluto, y una que contiene una
cantidad conocida de la misma sustancia.

Todas las sustancias pueden absorber energía

radiante, aun el vidrio que parece ser
completamente transparente absorbe longitud
de ondas que pertenecen al espectro visible; el
agua absorbe fuertemente en la región del
infrarrojo.

La absorción de las radiaciones ultravioleta,

visibles e infrarrojas depende de la estructura
de las moléculas, y es característica para cada
sustancia química.

Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de

la energía es absorbida; la energía radiante no
puede producir ningún efecto sin ser
absorbida.
El color de las sustancias se debe a que éstas
absorben ciertas longitudes de onda de la luz
blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar
a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no
absorbida.

 
   MÉTODOS
FOTOMÉTRICOS DE
ANÁLISIS

 
1.     NATURALEZA DE LA
RADIACIÓN
ELECTROMAGNÉTICA

La Radiación Electromagnética es una

forma de Energía radiante que se propaga
en forma de ondas. En este fenómeno
ondulatorio se define:

a)                  Longitud de onda (): es la distancia

entre dos máximos de un ciclo completo
del movimiento ondulatorio. Se expresa,
según el S.I. en nanómetros (nm) y sus
equivalencias son: 1nm = 1m =10 A0 =
10-9 m.
b)                  Frecuencia (): es el número de
ciclos por segundo. Es inversa a la
longitud de onda. Su fórmula es:  = c/,
y se mide en ciclos por segundo o
hertzios.
                 Fotones: la luz está formada por

fotones, y estos son paquetes

discontinuos de E. La E de un fotón
depende de la frecuencia y de la longitud
de onda, según la siguiente expresión:  E
= h x  = h x c/   (h = Cte. de Planck =
6,62.10-27erg/seg.). La Energía
Electromagnética se mide el Ergios. La
 relación entre la longitud de onda y la
Energía es inversa, por lo tanto a menor
longitud de onda mayor Energía y
viceversa.
d)                  Espectro Electromagnético: cubre
un amplio intervalo de E radiante, desde
los rayos  de longitud de onda corta
hasta las ondas de radio, de longitud de
onda larga. Se divide en varias regiones,
las más interesantes para nosotros son:
                                        Región Ultravioleta:  =
10-380 nm
                                        Región Visible:  = 380-
780 nm
                                        Región Infrarroja:  = 780-
30.000 nm

 En la Región Visible, la luz se

descompone en colores. La luz blanca
contiene todo el espectro de longitudes
de onda. Si interacciona con una
molécula puede ser dispersada o
absorbida.

2.     FENÓMENOS DE
INTERACCIÓN ENTRE LUZ Y
MATERIA
 
A.                           FENÓMENO DE
ABSORCIÓN

Cuando una partícula que se encuentra en

estado de reposo o estado fundamental
interacciona con un haz de luz, absorbe E
y se transforma en una partícula en
estado excitado. La molécula absorbe la
E de la onda y aumenta su energía, y ese
aumento de energía es igual a la E de la
Radiación Electromagnética absorbida (E
= h.). La partícula en estado excitado
tiende a volver de forma espontánea a su
estado de reposo desprendiendo la
 E absorbida en forma de calor.

“Espectro de Absorción”. Cada especie

absorbente, que recibe el nombre de
cromógeno, tiene un determinado
espectro de absorción. El espectro de
absorción es un gráfico donde se
representa en ordenadas la Absorbancia y
en abcisas la longitud de onda. La
medida de la cantidad de luz absorbida
por una solución es el fundamento de la
espectrofotometría de absorción.

Por eso es importante trabajar a la

longitud de onda a la que la sustancia
estudiada absorbe la mayor cantidad de
luz (a mayor cantidad de luz, mayor
cantidad de sustancia).

B.                           FENÓMENO DE EMISIÓN

Algunos compuestos, tras ser excitados

por la luz, vuelven al estado fundamental
produciendo la emisión de energía
radiante. En este caso, lo que se mide es
la energía emitida y, en este fenómeno se
basa la “fotometría de llama” o la
“fluorescencia”.

3.     LEYES DE ABSORCIÓN

Cuando un haz de luz pasa a través de un

medio, se registra una cierta pérdida de
intensidad, debido a la absorción por
parte de la sustancia.

Se llama “TRANSMITANCIA (T)” a la

relación entre la luz incidente y la luz
 transmitida:

T = Is / I0  ;    %T = (Is / I0 ) x 100.

Se puede perder intensidad por la

interacción con la cubeta o el solvente.
Para evitar este error se hace una primera
medida con una solución de referencia o
BLANCO, que contiene todos los
posibles compuestos que intervienen en
la lectura menos el que vamos a medir.
Todas las medidas que se hagan con
posterioridad serán referidas a esta
medida inicial y se harán en la misma
cubeta que se utilizó en la medida del
blanco.

   La Transmitancia se usa poco, se

emplea más la Absorbancia (A) porque la
relación entre A y la concentración de
una solución es directamente
proporcional y la de la T es inversamente
proporcional.

La relación entre la absorbancia y la

transmitancia es la siguiente:

                            Si el %T = 100                A = 2-
log T = 2-log 100 = 0
                            Si el %T = 0                    A = 2-

log 0 = 

En los aparatos que se usan actualmente

se presentan absorbancias, pero el
aparato lo que mide realmente es %T que
luego transforma a absorbancia.

3.1. LEY DE BEER

“La absorbancia de una solución es

directamente proporcional ala
concentración y a la longitud del paso de
la luz”.

                                                        A
 =  . b. c

Siendo:

A: absorbancia. No tiene unidades.

: el coeficiente de extinción molar,

también llamado coeficiente de
absorción. Es constante para un
compuesto dado siempre que se fijen
condiciones de longitud de onda, de pH,
de temperatura, de solventes, etc. Sus
unidades son 1/ (mol/cm).

b: es la longitud de paso de la luz, en cm.

c: es la concentración del absorbente. Se

mide en mol/L.

La aplicación práctica de la Ley de Beer

es, que conociendo la absorbancia de una
sustancia podemos averiguar su
concentración y esto lo podemos hacer
de dos formas:

                            Por comparación con una

solución conocida: si tenemos 2
soluciones, una problema (P) y una
estándar (S), podemos establecer la
siguiente relación matemática entre
ellas: 
                            A través de una curva de
calibración: la curva de calibración es la
representación gráfica en un eje de
coordenadas de la Absorbancia (eje de
ordenadas) frente a la Concentración (eje
de abcisas). Se ensayan varias soluciones
de concentración conocida y se
determinan sus A, construyéndose la
curva de calibrado, que es una recta. Una
vez ensayadas las soluciones problemas,
su concentración se averigua por
interpolación de las A de las soluciones
 problema en la curva de calibración.

     Hay que tener en cuenta la

LINEALIDAD, que es el intervalo de
concentraciones del cromógeno entre las
cuales existe una relación lineal entre
Absorbancia y Concentración.

     Cuando la concentración del

cromógeno sobrepasa los límites de
linealidad se deja de cumplir la Ley de
Beer, convirtiéndose la recta en una
curva. La lectura de la Absorbanciafuera
de los límites de linealidad se traduce en
una concentración falsamente baja de
cromógeno. En esta situación, hay que
diluir la muestra para que su
concentración entre en los límites de la
linealidad.

Empleo de los
                                                               
Factores de Calibración: Para reactivos
estables y sistemas fotométricos estables,
este factor se puede mantener constante,
siendo sólo necesario ensayar las
muestras problema multiplicando la
A resultante por el factor F.

4.  ESPECTROFOTÓMETRO

Se distinguen dos tipos de aparatos:

  Fotómetro o Colorímetro: se caracterizan
porque utilizan filtros que solo permiten
el paso de una determinada longitud de
onda.
  Espectrofotómetros: utilizan cromadores.
Con ellos se obtiene un haz de luz
monocromático cuya longitud de onda se
varía a voluntad. Los monocromadores
pueden ser de dos tipos: prismas y redes
de difracción.

Monocromador de Prisma

 
2.2.                    COMPONENTES DEL
ESPECTROFOTÓMETRO

1. Fuente de luz: proporciona energía

radiante en forma de luz visible o no
visible.

    Tipos de lámparas:
-                                      Lámparas de filamento de
tungsteno: se utilizan para longitudes de
onda del espectro visible y el ultravioleta
próximo. Son fuentes de un espectro
continuo de energía radiante entre 360-
950 nm.
-                                      Lámparas de filamentos de
haluros de tungsteno: son de mayor
duración y emiten energía radiante de
mayor intensidad.
-                                      Lámparas de Hidrógeno y
Deuterio: producen un espectro continuo
en la región ultravioleta entre 220-360
nm.
-                                      Lámparas de vapores de
Mercurio: Emiten un espectro
discontinuo o espectro de líneas que se
utilizan para calibración de longitudes de
onda, se emplean solo para
espectrofotómetros y cromatografía
HPLC.
  Precauciones:
-   Las subidas y bajadas bruscas de tensión
producen sufrimiento de la lámpara y
cambios en las lecturas de la
Absorbancia.
-   La lámpara tiene una vitalidad limitada y
se debe vigilar para que funcione bien el
aparato.

(03/10/01)

2. Rendija de entrada: tiene como

función reducir al máximo la luz difusa y
evitar que la luz dispersa entre en el
sistema de selección de longitud de onda.

3. Monocromadores. Pueden ser:

                                        Prismas: son fragmentos
con forma de cuña de un material que
permite el paso de la luz. Ej. De vidrio
para trabajar en el espectro visible o
cuarzo para trabajar en el ultravioleta
lejano.
                                        Redes de difracción: son un
gran número de líneas paralelas situadas
a distancias iguales entre sí y son
hendiduras sobre un vidrio o una
superficie metálica. Cada una de estas
hendiduras se comporta como un
pequeño prisma.

4. Rendija de salida: tiene como

función impedir que la luz difusa
atraviese la cubeta de la muestra, que
provocaría desviaciones a la Ley de
Beer.                                         
(04/10/01)

5. Cubeta: es el recipiente donde se

coloca la muestra para la medición.
Pueden ser de distintos tipos y tamaños
(cuadradas, rectangulares, redondas). Se
obtienen mejores resultados usando
cubetas de bordes paralelos. Si se utilizan
cubetas redondas se deben marcar e
introducir en el aparato siempre en la
misma posición. Suelen estar fabricadas
en vidrio o en plástico.
6. Detector. Puede ser de dos tipos:
  Fotocélulas o células fotovoltaicas:
 
 
 
Es una lámina de Cobre sobre la que se
extiende una capa de Selenio o de Óxido
de Cobre. A ésto se le conoce como
semiconductor. Sobre el semiconductor
hay una capa de metal transparente que
sirve de electrodo. La luz incide sobre el
Selenio y éste desprende electrones, que
pasan a la placa de Cobre originando una
 diferencia de potencial por existir carga
negativa sobre el Cobre y positiva sobre
el Selenio. El conjunto se conecta a un
amperímetro que señala el paso de
corriente.
Características: son resistentes;
económicas; sensibles desde el
ultravioleta hasta los 1.000 nm. de
longitud de onda; no se requiere batería
externa, ni vacío,...; la corriente
producida es directamente proporcional
a la Energía que llega y tienen “efecto
fatiga”, es decir, que presentan una
subida inicial de corriente, que luego
decrece progresivamente hasta el
equilibrio. Por eso hay que esperar entre
30-60 segundos entre una lectura y otra.
  Fototubos multiplicadores:

Un fototubo multiplicador es un tubo que

contiene un cátodo que emite electrones
de forma proporcional a la Energía que
incide sobre él. Tiene un ánodo que
recoge los electrones y la corriente se
multiplica varias veces al chocar los
electrones sobre sucesivos ánodos que
van teniendo un voltaje superior al
precedente. La señal se amplifica en
cientos o miles de veces.

Características: el tiempo de respuesta es

muy rápido, no tienen “efecto fatiga” tan
altos como la anterior y son muy
sensibles.
7. Medidor: son sistemas de lectura de la
Energía eléctrica que recoge el detector y
que puede ser lectura directa (se utiliza
una célula fotovoltaica) o puede ser
amplificadores de señal como en el caso
del fototubo multiplicador. Los actuales
aparatos incorporan lectura digital y
cálculos automáticos de concentraciones
con relación a las curvas de calibración.
 (

4.2 TIPOS DE APARATOS

ESPECTROFOTÓMETRO DE
                            
HAZ SIMPLE: es igual que la
descripción dada para el
espectrofotómetro en general. Consta de
los mismos elementos (Ej.
Bilirrubinómetro: para determinar
bilirrubina directa en capilar).
ESPECTROFOTÓMETRO DE
                            
DOBLE HAZ EN EL ESPACIO: todos
los componentes están duplicados,
menos la lámpara y el medidor. Dos
haces de luz pasan al mismo tiempo por
los distintos componentes separados en
el espacio. Esto compensa las variaciones
de intensidad de luz y de absorbancia.
 
 
ESPECTROFOTÓMETRO
                            
DE HAZ DOBLE EN EL
TIEMPO: utilizan los mismos
componentes que el espectrofotómetro de
haz simple. Dos haces de luz pasan por
los mismos componentes pero no al
mismo tiempo. Emplean un “Chopper”
consistente en un interruptor rotativo del
haz luminoso colocado a continuación de
la rendija de salida. Un sistema de
espejos dirige la porción de luz reflejada
por el “chopper” a través de una cubeta
de referencia y de ahí al detector común.
El detector lee alternativamente el haz
procedente de la muestra y el de la
cubeta de referencia. Esto compensa la
variación de energía radiante.

 
  MEDIDAS
 FOTOMÉTRICAS
 
 
1. FLUORIMETRÍA
1.1  CONCEPTOS GENERALES
A.                                                     Luminiscencia
B.                                                     Fluorescencia
1.2  INSTRUMENTACIÓN
FLUOROMÉTRICA
A.                                                     Fluorómetro
B.                                                     Espectrofluorómetro
1.3  CARACTERÍSTICAS DE LA
FLUORIMETRÍA
1.4  APLICACIONES
2. FOTOMETRÍA DE LLAMA
2.1                          CONCEPTOS GENERALES
A.     Generalidades
B.     Fundamento
C.     Interpretación
2.2                          INSTRUMENTAL
3. ESPECTROFOTOMETRÍA DE
ABSORCIÓN ATÓMICA
3.1 PRINCIPIOS
3.2 INSTRUMENTAL
A.                                                     Lámpara de cátodo
hueco
B.                                                     Quemador
C.                                                     Componentes
fotométricos
3.3 ABSORCIÓN ATÓMICA
4. NEFELOMETRÍA Y
TURBIDIMETRÍA
4.1 PRINCIPIOS. LEY DE RAYLEIGH
4.2 DETECCIÓN DE LA LUZ
DISPERSADA
A.                                                     Turbidimetría
                             Nefelometría
 

 
Espectrofotometría
 

ESPECTROFOTOMETRIA

La espectrofotometría es el método de análisis

óptico más usado en las investigaciones
biológicas. El espectrofotómetro es un
instrumento que permite comparar la
radiación absorbida o transmitida por una
solución que contiene una cantidad
desconocida de soluto, y una que contiene una
cantidad conocida de la misma sustancia.

Todas las sustancias pueden absorber energía

radiante, aun el vidrio que parece ser
completamente transparente absorbe longitud
de ondas que pertenecen al espectro visible; el
agua absorbe fuertemente en la región del
infrarrojo.

La absorción de las radiaciones ultravioleta,

visibles e infrarrojas depende de la estructura
de las moléculas, y es característica para cada
sustancia química.

Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de

la energía es absorbida; la energía radiante no
puede producir ningún efecto sin ser
absorbida.

El color de las sustancias se debe a que éstas

absorben ciertas longitudes de onda de la luz
blanca que incide sobre ellas y solo dejan pasar
a nuestros ojos aquellas longitudes de onda no
absorbida.

 
   MÉTODOS
FOTOMÉTRICOS DE
ANÁLISIS

 
1.     NATURALEZA DE LA
RADIACIÓN
ELECTROMAGNÉTICA

La Radiación Electromagnética es una

forma de Energía radiante que se propaga
en forma de ondas. En este fenómeno
ondulatorio se define:

a)                  Longitud de onda (): es la distancia

entre dos máximos de un ciclo completo
del movimiento ondulatorio. Se expresa,
según el S.I. en nanómetros (nm) y sus
equivalencias son: 1nm = 1m =10 A0 =
10-9 m.
b)                  Frecuencia (): es el número de
ciclos por segundo. Es inversa a la
longitud de onda. Su fórmula es:  = c/,
y se mide en ciclos por segundo o
hertzios.
                 Fotones: la luz está formada por

fotones, y estos son paquetes

discontinuos de E. La E de un fotón
depende de la frecuencia y de la longitud
 de onda, según la siguiente expresión:  E
= h x  = h x c/   (h = Cte. de Planck =
6,62.10-27erg/seg.). La Energía
Electromagnética se mide el Ergios. La
relación entre la longitud de onda y la
Energía es inversa, por lo tanto a menor
longitud de onda mayor Energía y
viceversa.
d)                  Espectro Electromagnético: cubre
un amplio intervalo de E radiante, desde
los rayos  de longitud de onda corta
hasta las ondas de radio, de longitud de
onda larga. Se divide en varias regiones,
las más interesantes para nosotros son:
                                        Región Ultravioleta:  =
10-380 nm
                                        Región Visible:  = 380-
780 nm
                                        Región Infrarroja:  = 780-
30.000 nm

 En la Región Visible, la luz se

descompone en colores. La luz blanca
contiene todo el espectro de longitudes
de onda. Si interacciona con una
molécula puede ser dispersada o
absorbida.

2.     FENÓMENOS DE
INTERACCIÓN ENTRE LUZ Y
MATERIA
 
A.                           FENÓMENO DE
ABSORCIÓN

Cuando una partícula que se encuentra en

estado de reposo o estado fundamental
interacciona con un haz de luz, absorbe E
y se transforma en una partícula en
estado excitado. La molécula absorbe la
E de la onda y aumenta su energía, y ese
aumento de energía es igual a la E de la
Radiación Electromagnética absorbida (E
 = h.). La partícula en estado excitado
tiende a volver de forma espontánea a su
estado de reposo desprendiendo la
E absorbida en forma de calor.

“Espectro de Absorción”. Cada especie

absorbente, que recibe el nombre de
cromógeno, tiene un determinado
espectro de absorción. El espectro de
absorción es un gráfico donde se
representa en ordenadas la Absorbancia y
en abcisas la longitud de onda. La
medida de la cantidad de luz absorbida
por una solución es el fundamento de la
espectrofotometría de absorción.

Por eso es importante trabajar a la

longitud de onda a la que la sustancia
estudiada absorbe la mayor cantidad de
luz (a mayor cantidad de luz, mayor
cantidad de sustancia).

B.                           FENÓMENO DE EMISIÓN

Algunos compuestos, tras ser excitados

por la luz, vuelven al estado fundamental
produciendo la emisión de energía
radiante. En este caso, lo que se mide es
la energía emitida y, en este fenómeno se
basa la “fotometría de llama” o la
“fluorescencia”.

3.     LEYES DE ABSORCIÓN

Cuando un haz de luz pasa a través de un

medio, se registra una cierta pérdida de
intensidad, debido a la absorción por
parte de la sustancia.
 Se llama “TRANSMITANCIA (T)” a la
relación entre la luz incidente y la luz
transmitida:

T = Is / I0  ;    %T = (Is / I0 ) x 100.

Se puede perder intensidad por la

interacción con la cubeta o el solvente.
Para evitar este error se hace una primera
medida con una solución de referencia o
BLANCO, que contiene todos los
posibles compuestos que intervienen en
la lectura menos el que vamos a medir.
Todas las medidas que se hagan con
posterioridad serán referidas a esta
medida inicial y se harán en la misma
cubeta que se utilizó en la medida del
blanco.

   La Transmitancia se usa poco, se

emplea más la Absorbancia (A) porque la
relación entre A y la concentración de
una solución es directamente
proporcional y la de la T es inversamente
proporcional.

La relación entre la absorbancia y la

transmitancia es la siguiente:

                            Si el %T = 100                A = 2-
log T = 2-log 100 = 0
                            Si el %T = 0                    A = 2-

log 0 = 

En los aparatos que se usan actualmente

se presentan absorbancias, pero el
aparato lo que mide realmente es %T que
luego transforma a absorbancia.

3.1. LEY DE BEER

“La absorbancia de una solución es

directamente proporcional ala
concentración y a la longitud del paso de
 la luz”.

                                                        A
=  . b. c

Siendo:

A: absorbancia. No tiene unidades.

: el coeficiente de extinción molar,

también llamado coeficiente de
absorción. Es constante para un
compuesto dado siempre que se fijen
condiciones de longitud de onda, de pH,
de temperatura, de solventes, etc. Sus
unidades son 1/ (mol/cm).

b: es la longitud de paso de la luz, en cm.

c: es la concentración del absorbente. Se

mide en mol/L.

La aplicación práctica de la Ley de Beer

es, que conociendo la absorbancia de una
sustancia podemos averiguar su
concentración y esto lo podemos hacer
de dos formas:

                            Por comparación con una

solución conocida: si tenemos 2
soluciones, una problema (P) y una
estándar (S), podemos establecer la
siguiente relación matemática entre
ellas: 
                            A través de una curva de
calibración: la curva de calibración es la
representación gráfica en un eje de
coordenadas de la Absorbancia (eje de
ordenadas) frente a la Concentración (eje
de abcisas). Se ensayan varias soluciones
de concentración conocida y se
determinan sus A, construyéndose la
curva de calibrado, que es una recta. Una
 vez ensayadas las soluciones problemas,
su concentración se averigua por
interpolación de las A de las soluciones
problema en la curva de calibración.

     Hay que tener en cuenta la

LINEALIDAD, que es el intervalo de
concentraciones del cromógeno entre las
cuales existe una relación lineal entre
Absorbancia y Concentración.

     Cuando la concentración del

cromógeno sobrepasa los límites de
linealidad se deja de cumplir la Ley de
Beer, convirtiéndose la recta en una
curva. La lectura de la Absorbanciafuera
de los límites de linealidad se traduce en
una concentración falsamente baja de
cromógeno. En esta situación, hay que
diluir la muestra para que su
concentración entre en los límites de la
linealidad.

Empleo de los
                                                               
Factores de Calibración: Para reactivos
estables y sistemas fotométricos estables,
este factor se puede mantener constante,
siendo sólo necesario ensayar las
muestras problema multiplicando la
A resultante por el factor F.

4.  ESPECTROFOTÓMETRO

Se distinguen dos tipos de aparatos:

  Fotómetro o Colorímetro: se caracterizan
porque utilizan filtros que solo permiten
el paso de una determinada longitud de
onda.
  Espectrofotómetros: utilizan cromadores.
Con ellos se obtiene un haz de luz
monocromático cuya longitud de onda se
varía a voluntad. Los monocromadores
pueden ser de dos tipos: prismas y redes
de difracción.
 Monocromador de Prisma

2.2.                    COMPONENTES DEL
ESPECTROFOTÓMETRO

1. Fuente de luz: proporciona energía

radiante en forma de luz visible o no
visible.

Tipos de lámparas:
    
-                                      Lámparas de filamento de
tungsteno: se utilizan para longitudes de
onda del espectro visible y el ultravioleta
próximo. Son fuentes de un espectro
continuo de energía radiante entre 360-
950 nm.
-                                      Lámparas de filamentos de
haluros de tungsteno: son de mayor
duración y emiten energía radiante de
mayor intensidad.
-                                      Lámparas de Hidrógeno y
Deuterio: producen un espectro continuo
en la región ultravioleta entre 220-360
nm.
-                                      Lámparas de vapores de
Mercurio: Emiten un espectro
discontinuo o espectro de líneas que se
utilizan para calibración de longitudes de
onda, se emplean solo para
espectrofotómetros y cromatografía
HPLC.
  Precauciones:
-   Las subidas y bajadas bruscas de tensión
producen sufrimiento de la lámpara y
cambios en las lecturas de la
Absorbancia.
-   La lámpara tiene una vitalidad limitada y
se debe vigilar para que funcione bien el
aparato.

(03/10/01)

2. Rendija de entrada: tiene como

 función reducir al máximo la luz difusa y
evitar que la luz dispersa entre en el
sistema de selección de longitud de onda.

3. Monocromadores. Pueden ser:

                                        Prismas: son fragmentos
con forma de cuña de un material que
permite el paso de la luz. Ej. De vidrio
para trabajar en el espectro visible o
cuarzo para trabajar en el ultravioleta
lejano.
                                        Redes de difracción: son un
gran número de líneas paralelas situadas
a distancias iguales entre sí y son
hendiduras sobre un vidrio o una
superficie metálica. Cada una de estas
hendiduras se comporta como un
pequeño prisma.

4. Rendija de salida: tiene como

función impedir que la luz difusa
atraviese la cubeta de la muestra, que
provocaría desviaciones a la Ley de
Beer.                                         
(04/10/01)

5. Cubeta: es el recipiente donde se

coloca la muestra para la medición.
Pueden ser de distintos tipos y tamaños
(cuadradas, rectangulares, redondas). Se
obtienen mejores resultados usando
cubetas de bordes paralelos. Si se utilizan
cubetas redondas se deben marcar e
introducir en el aparato siempre en la
misma posición. Suelen estar fabricadas
en vidrio o en plástico.
6. Detector. Puede ser de dos tipos:
  Fotocélulas o células fotovoltaicas:
 
 
 
Es una lámina de Cobre sobre la que se
extiende una capa de Selenio o de Óxido
 de Cobre. A ésto se le conoce como
semiconductor. Sobre el semiconductor
hay una capa de metal transparente que
sirve de electrodo. La luz incide sobre el
Selenio y éste desprende electrones, que
pasan a la placa de Cobre originando una
diferencia de potencial por existir carga
negativa sobre el Cobre y positiva sobre
el Selenio. El conjunto se conecta a un
amperímetro que señala el paso de
corriente.
Características: son resistentes;
económicas; sensibles desde el
ultravioleta hasta los 1.000 nm. de
longitud de onda; no se requiere batería
externa, ni vacío,...; la corriente
producida es directamente proporcional
a la Energía que llega y tienen “efecto
fatiga”, es decir, que presentan una
subida inicial de corriente, que luego
decrece progresivamente hasta el
equilibrio. Por eso hay que esperar entre
30-60 segundos entre una lectura y otra.
  Fototubos multiplicadores:

Un fototubo multiplicador es un tubo que

contiene un cátodo que emite electrones
de forma proporcional a la Energía que
incide sobre él. Tiene un ánodo que
recoge los electrones y la corriente se
multiplica varias veces al chocar los
electrones sobre sucesivos ánodos que
van teniendo un voltaje superior al
precedente. La señal se amplifica en
cientos o miles de veces.

Características: el tiempo de respuesta es

muy rápido, no tienen “efecto fatiga” tan
altos como la anterior y son muy
sensibles.
7. Medidor: son sistemas de lectura de la
Energía eléctrica que recoge el detector y
que puede ser lectura directa (se utiliza
una célula fotovoltaica) o puede ser
amplificadores de señal como en el caso
 del fototubo multiplicador. Los actuales
aparatos incorporan lectura digital y
cálculos automáticos de concentraciones
con relación a las curvas de calibración.

4.2 TIPOS DE APARATOS

ESPECTROFOTÓMETRO DE
                            
HAZ SIMPLE: es igual que la
descripción dada para el
espectrofotómetro en general. Consta de
los mismos elementos (Ej.
Bilirrubinómetro: para determinar
bilirrubina directa en capilar).
ESPECTROFOTÓMETRO DE
                            
DOBLE HAZ EN EL ESPACIO: todos
los componentes están duplicados,
menos la lámpara y el medidor. Dos
haces de luz pasan al mismo tiempo por
los distintos componentes separados en
el espacio. Esto compensa las variaciones
de intensidad de luz y de absorbancia.
 
 
ESPECTROFOTÓMETRO
                            
DE HAZ DOBLE EN EL
TIEMPO: utilizan los mismos
componentes que el espectrofotómetro de
haz simple. Dos haces de luz pasan por
los mismos componentes pero no al
mismo tiempo. Emplean un “Chopper”
consistente en un interruptor rotativo del
haz luminoso colocado a continuación de
la rendija de salida. Un sistema de
espejos dirige la porción de luz reflejada
por el “chopper” a través de una cubeta
de referencia y de ahí al detector común.
El detector lee alternativamente el haz
procedente de la muestra y el de la
cubeta de referencia. Esto compensa la
variación de energía radiante.
  

 
  MEDIDAS
FOTOMÉTRICAS
 
 
1. FLUORIMETRÍA
1.1  CONCEPTOS GENERALES
A.                                                     Luminiscencia
B.                                                     Fluorescencia
1.2  INSTRUMENTACIÓN
FLUOROMÉTRICA
A.                                                     Fluorómetro
B.                                                     Espectrofluorómetro
1.3  CARACTERÍSTICAS DE LA
FLUORIMETRÍA
1.4  APLICACIONES
2. FOTOMETRÍA DE LLAMA
2.1                          CONCEPTOS GENERALES
A.     Generalidades
B.     Fundamento
C.     Interpretación
2.2                          INSTRUMENTAL
3. ESPECTROFOTOMETRÍA DE
ABSORCIÓN ATÓMICA
3.1 PRINCIPIOS
3.2 INSTRUMENTAL
A.                                                     Lámpara de cátodo
hueco
B.                                                     Quemador
C.                                                     Componentes
fotométricos
3.3 ABSORCIÓN ATÓMICA
4. NEFELOMETRÍA Y
TURBIDIMETRÍA
 4.1 PRINCIPIOS. LEY DE RAYLEIGH
4.2 DETECCIÓN DE LA LUZ
DISPERSADA
A.                                                     Turbidimetría
                            Nefelometría
 

Diferencia entre espectrofotómetro y

espectrómetro

Espectrómetro
Un espectrómetro es un instrumento que usan los científicos para
reunir información sobre una sustancia sobre la base del visible, luz
ultravioleta o infrarroja que sobresalen, y se puede utilizar en diferentes
campos de la ciencia. Por ejemplo, los astrónomos utilizan
espectrómetros para encontrar la temperatura de un objeto en el espacio,
la medición de la velocidad que está viajando, y también determinan el
peso del objeto. Los científicos también utilizan los espectrómetros para
determinar la composición de los elementos en la Tierra o en el espacio.
Incluye los componentes básicos de elementos. Los científicos en el
campo de la medicina a menudo utilizan los espectrómetros para
identificar contaminantes, toxinas en la sangre o incluso enfermedades.
Espectrofotómetro 
Un espectrofotómetro es un dispositivo que se utiliza para medir la
intensidad de la radiación electromagnética a diferentes longitudes de
onda. Los espectrofotómetros se utilizan para medir la absorción de una
cierta longitud de onda de una solución, soluciones de reflectancia,
transmitancia o la transparencia de los sólidos. Por otra parte, también
miden la difusividad de los rangos de luz en el espectro de la radiación
electromagnética que abarca aproximadamente 200 nm a 2500 nm con
diferentes calibraciones y controles. Hay dos clasificaciones básicas de
espectrofotómetro. El primer tipo es un espectrofotómetro de doble haz,
que compara la intensidad de la luz entre un camino óptico de la
referencia, y la sustancia que se mide. El segundo tipo de medida de la
intensidad de la luz en la viga antes y después de la muestra de ensayo
se introduce.
Diferencias
 Un espectrómetro es una parte de un espectrofotómetro que es más
responsable para la medición de diversos artículos. Un espectrofotómetro
es un sistema completo que comprende una fuente de luz, un medio para
recoger la luz que ha interactuado con los elementos probados y un
espectrómetro para las mediciones. También hay una diferencia en la
forma en que se utilizan los espectrómetros y espectrofotómetros. Para
utilizar un espectrómetro, enciéndalo y espere unos cinco minutos para
que se caliente. Una sustancia de referencia es entonces cargado y
calibrado y un espectro se determina por la muestra. Las longitudes de
onda son entonces medidos y analizados. El artículo en cuestión se
carga. La luz pasa a través de la máquina y las lecturas se hace con
base en los colores y la información que se refleja.
Otras diferencias
Para utilizar un espectrofotómetro, limpiar la cubeta en la máquina
para comprobar todas las huellas digitales o se elimina la suciedad.
A continuación, agrega el soluto (no agua). El espectrofotómetro se
establece en la longitud de onda deseada y la cubeta vacía se
inserta confirmando la flecha está alineado. Para calibrar el
espectrofotómetro, pulse la tecla "set cero" o el indicador de la
longitud de onda. Introducir la solución para el cálculo de capacidad
de absorción.

Espectrofotometría

Espectrofotómetro UV-VIS.

La espectrofotometría es la medición de la cantidad de energía radiante que absorbe o

transmite un sistema químico en función de la longitud de onda; es el método de análisis
óptico más usado en las investigaciones químicas ybioquímicas. El espectrofotómetro es un
instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida por una solución que
 contiene una cantidad desconocida de soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la
misma sustancia.

Índice
  [ocultar] 

 1Principio de la Espectrofotometría
o 1.1Ley de Beer
o 1.2Ley de Lambert
o 1.3Ley de Bouguer-Beer-Lambert
o 1.4Transmitancia y absorción de las radiaciones
 2Aplicaciones
 3Tipos de espectrofotometría
 4Véase también
 5Referencias

Principio de la Espectrofotometría[editar]
En la espectrofotometría se aprovecha la absorción de radiación electromagnética en la zona
del ultravioleta y visible del espectro. La muestra absorbe parte de la radiación incidente en
este espectro y promueve la transición del analito hacia un estado excitado, transmitiendo un
haz de menor energía radiante. En esta técnica se mide la cantidad de luz absorbida como
función de la longitud de onda utilizada. La absorción de las radiaciones ultravioletas, visibles
e infrarrojas depende de la estructura de las moléculas, y es característica de cada sustancia
química.
La espectrofotometría ultravioleta-visible utiliza haces de radiación del espectro
electromagnético, en el rango UV de 180 a 380 nm, y en el de la luz visible de 380 a 780 nm,
por lo que es de gran utilidad para caracterizar los materiales en la región ultravioleta y visible
del espectro.

Ley de Beer[editar]
La Ley de Beer afirma que la cantidad de luz absorbida por un cuerpo depende de la
concentración en la solución.
Por ejemplo, en un vaso de vidrio tenemos agua con azúcar disuelta y en otro vaso tenemos
la misma cantidad de agua pero con mayor cantidad de azúcar en solución. El detector es una
celda fotoeléctrica, y lo que se mide es la concentración de la solución de azúcar.
Según la ley de Beer, si hiciéramos que un rayo de luz atravesara el primer vaso, la cantidad
de luz que saldría del otro lado sería mayor que si repitiéramos esto en el segundo, ya que en
este último las ondas electromagnéticas chocan contra un mayor número
de átomos o/y moléculas y son absorbidos por estos.1
Ley de Lambert[editar]
La Ley de Lambert dice que la cantidad de luz absorbida por un objeto depende de la
distancia recorrida por la luz.
Por ejemplo, retomando el ejemplo de los vasos, pensemos que ambos tienen la misma
cantidad de agua y la misma concentración de azúcar; pero el segundo tiene un diámetro
mayor que el otro.
Según la ley de Lambert, si hiciéramos que un rayo de luz atravesara el primer vaso, la
cantidad de luz que saldría del otro lado seria mayor que si repitiéramos esto en el segundo,
ya que en este último las ondas electromagnéticas chocan contra un mayor número
de átomos o/y moléculas y son absorbidos por estos, tal como se explicó en la ley de Beer.
Ley de Bouguer-Beer-Lambert[editar]
Una ley muy importante es la de Bouguer-Beer-Lambert (también conocida como ley de
Lambert Bouguer y Beer), la cual es solo una combinación de las citadas anteriormente.
Transmitancia y absorción de las radiaciones[editar]
Por las leyes mencionadas anteriormente, al hacer pasar una cantidad de fotones o de
radiaciones hay una pérdida que se expresa con la ecuación:
It/Io=T-kdc''
donde It es la intensidad de luz que sale de la cubeta y que va a llegar a la celda fotoeléctrica
(llamada radiación o intensidad transmitida); Io es la intensidad con la que sale al atravesar
la celda (radiación intensidad incidente), y la relación entre ambas (T) es la transmitancia.
En el exponente, el signo negativo se debe a que la energía radiante decrece a medida que el
recorrido aumenta. El superíndice k es la capacidad de la muestra para la captación del haz
del campo electromagnético, d es la longitud de la cubeta de espectrofotometría que recorre la
radiación, y c es la concentración del soluto en la muestra ya ubicada en la cubeta.
La ecuación simplificada de la ley de Beer-Lambert
A = ε.d.c
comprende la mínima ecuación que relaciona la concentración (c), la absorbencia de la
muestra (A), el espesor recorrido por la radiación (d) y el factor de calibración (ε). El factor de
calibración relaciona la concentración y la absorbancia de los estándares.
La absorción (o absorbancia) es igual a A, que es el logaritmo recíproco de la transmitancia:2
A= log 1/T
lo que es igual a:
A= -log T
Las ecuaciones mencionadas de las leyes son válidas solo y solo si:2

 la radiación incidente es monocromática;

 las especies actúan independientemente unas de otras durante la absorción;
 la absorción ocurre en un volumen de sección trasversal uniforme.

Aplicaciones[editar]
Las aplicaciones principales son:

 determinar la cantidad de concentración en una solución de algún compuesto

utilizando las fórmulas ya mencionadas;
 ayudar en la determinación de estructuras moleculares;
 la identificación de unidades estructurales específicas, ya que estas tienen distintos
tipos de absorbancia (grupos funcionales o isomerías);
 determinar constantes de disociación de indicadores ácido-base.
 Tipos de espectrofotometría[editar]
 Espectrofotometría de absorción molecular VIS-UV. 13,
 Espectrofotometría de absorción molecular IR.15.
 Espectrofotometría de absorción y emisión atómica.
 Espectrofotometría con atomizadores electrotérmicos.
 Espectrofotometría de emisión con plasma.
 Espectrofotometría de fluorescencia molecular.

Véase también[editar]
 Colorimetría
 Colorímetro
 Espectrofotómetro
 Espectrofluorimetría
 Química
 Análisis químico
 Espectro electromagnético

Cómo encontrar el coeficiente de absorción molar

Escrito por Eric Moll | Traducido por Enrique Pereira Vivas

Cómo encontrar el coeficiente de absorción molar.

Photos.com/PhotoObjects.net/Getty Images
El coeficiente de absorción molar, es una medida de la relación entre la concentración de una
solución y la cantidad de radiación electromagnética que absorbe. Los métodos
espectroscópicos de análisis de la muestra utilizan radiación electromagnética para detectar
la composición y la concentración de una muestra. Los científicos generalmente prueban
varias muestras de concentración conocida para determinar el coeficiente de absortividad
molar de una sustancia. Una vez que establecen el coeficiente, pueden estimar la
concentración de muestras desconocidas, sobre la base de la cantidad de radiación
electromagnética que absorben.

1. Enciende el espectrómetro y colócalo en cero, pon agua destilada en una cubeta

y ejecútala como una muestra. Los espectrómetros diferentes tendrán leves
diferencias de software o medios de operación, pero cada uno debe venir con
instrucciones claras sobre cómo calibrarlo con una muestra de agua destilada.

2. 2
Llena una cubeta con la primera muestra de concentración conocida. Ejecuta la
muestra para determinar el valor de la absorbancia. Registra el número de muestra, la
concentración ya conocida y la lectura de la absorbancia. Por ejemplo, la muestra 1
podría tener una concentración de 0,05 moles por litro, y una absorbancia de 400.
3. 3
Llena una cubeta fresca con la siguiente muestra y pásala por el espectrómetro.
Registra el número de muestra, la concentración y la absorbancia. Por ejemplo, la
muestra 2 podría tener una concentración de 0,5 moles por litro y una absorbancia de
4.000. Haz lo mismo para la tercera muestra. Para este ejemplo, supón que la muestra
3 tiene una concentración de 5 moles por litro, y una absorbancia de 40.000.

4. 4
Utiliza la ley de Beer-Lambert para calcular el coeficiente de absortividad molar para
cada muestra. Esta ecuación, establece que la absorbancia es igual a la concentración
de la solución, multiplicada por la longitud de la trayectoria (la anchura de la cubeta)
multiplicada por el coeficiente de absortividad molar: A = EBC, donde E es el
coeficiente de absortividad molar, B es la longitud del camino, C es la concentración, y
A es la absorbancia. Multiplica la longitud del camino en centímetros por la
concentración, luego divide la absorbancia por ese número. Para este ejemplo, supón
que la cubeta es 1 centímetro de ancho. Para la muestra 1, multiplica 1 por 0,05, lo que
equivale a 0,05. Divide 400 por 0,05 para un coeficiente de absortividad molar de
8.000.

5. 5
Realiza el mismo cálculo para las otras muestras. Para la muestra 2, multiplica 1 por
0,5 para obtener un resultado de 0,5. Divide 4.000 por 0,5 para proporcionar una
capacidad de absorción molar constante de 8.000. El mismo cálculo para la muestra 3
también produce un resultado de 8.000. En condiciones reales de laboratorio, cada
muestra producirá una constante ligeramente diferente. Registra cada una.

6. 6
Haz un promedio de la constante de absortividad molar sumándolas todas juntas y
dividiendo el total por el número de muestras conocidas que ejecutaste. Ahora puedes
utilizar el coeficiente de absortividad molar resultante para estimar la concentración de
las muestras desconocidas.

JULIAN Y JEISON POR 100PRE

En química analítica, la espectrometría de absorción atómica es una técnica para

determinar la concentración de un elemento metálico determinado en una muestra.
Puede utilizarse para analizar la concentración de más de 62 metales diferentes en una
solución.
La técnica hace uso de la espectrometría de absorción para evaluar la concentración de
un analito en una muestra. Se basa en gran medida en la ley de Beer-Lambert.
En resumen, los electrones de los átomos en el atomizador pueden ser promovidos a
orbitales más altos por un instante mediante la absorción de una cantidad de energía (es
decir, luz de una determinada longitud de onda). Esta cantidad de energía (o longitud de
onda) se refiere específicamente a una transición de electrones en un elemento
particular, y en general, cada longitud de onda corresponde a un solo elemento.

Como la cantidad de energía que se pone en la llama es conocida, y la cantidad restante

en el otro lado (el detector) se puede medir, es posible, a partir de la ley de Beer-
Lambert, calcular cuántas de estas transiciones tienen lugar, y así obtener una señal que
es proporcional a la concentración del elemento que se mide.

INSTRUMENTOS
Para analizar los constituyentes atómicos de una muestra es necesario atomizarla. La
muestra debe ser iluminada por la luz. Finalmente, la luz es transmitida y medida por un
detector. Con el fin de reducir el efecto de emisión del atomizador (por ejemplo, la
radiación de cuerpo negro) o del ambiente, normalmente se usa un espectrómetro entre
el atomizador y el detector.
Análisis de los líquidos

Una muestra de líquido normalmente se convierte en gas atómico en tres pasos:

1. Desolvación. El líquido disolvente se evapora, y la muestra permanece seca.

2. Vaporización. La muestra sólida se evapora a gas.
3. Atomización. Los compuestos que componen la muestra se dividen en átomos libres. 
uentes de luz

La fuente de luz elegida tiene una anchura espectral más estrecha que la de las
transiciones atómicas.

* Lámparas de cátodo hueco. En su modo de funcionamiento convencional, la luz es

producida por una lámpara de cátodo hueco. En el interior de la lámpara hay un cátodo
cilíndrico de metal que contiene el metal de excitación, y un ánodo. Cuando un alto
voltaje se aplica a través del ánodo y el cátodo, los átomos de metal en el cátodo se
excitan y producen luz con una determinada longitud de onda. El tipo de tubo catódico
hueco depende del metal que se analiza. Para analizar la concentración de cobre en un
mineral, se utiliza un tubo catódico de cobre, y así para cualquier otro metal que se
analice.

* Lásers de diodo. La espectrometría de absorción atómica también puede ser llevada a

cabo mediante láser, principalmente un láser de diodo, ya que sus propiedades son
apropiadas para la espectrometría de absorción láser. La técnica se denomina
espectrometría de absorción atómica por láser de diodo (DLAAS o DLAS), o bien,
espectrometría de absorción por modulación de longitud de onda.