ESPECTROFOTOMETRÍA UV-VISIBLE

Ley de Beer-Lambert

Daniela de oro y Jorge altahona

Facultad química y farmacia
Universidad del atlántico
03/septiembre/2020

RESUMEN

La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la concentración

de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas absorben las radiaciones
electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la
concentración. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro de longitud de
onda visible; en el que se seleccionó la longitud de onda de la luz de 544 nm que pasó por la
solución de permanganato de potasio 200, 400 y 600 µM midiéndose así; la cantidad de luz
absorbida por la misma. En conclusión, se comparó el coeficiente de extinción para tres
experimentos realizados, calculándose éste de acuerdo a la ecuación de Beer-Lambert y por curva
de calibración.

PALABRAS CLAVE: Absorbancia, ley de Beer-Lambert, linealidad, coeficiente de extinción.

INTRODUCCIÓN distintas longitudes de onda, esto es, su

El fundamento de la espectroscopia se debe
a la capacidad de las moléculas para
absorber radiaciones, entre ellas, las
radiaciones dentro del espectro UV-visible.
Las longitudes de onda de las radiaciones
que una molécula puede absorber y la
eficiencia con la que se absorben dependen
de la estructura atómica y de las condiciones
del medio (pH, temperatura, fuerza iónica,
constante dieléctrica), por lo que dicha
técnica constituye un valioso instrumento
para la determinación y caracterización de
biomoléculas. Las moléculas pueden
absorber energía luminosa y almacenarla en
forma de energía interna. Esto permite poner
en funcionamiento ciclos vitales como la
fotosíntesis en plantas y bacterias. Cuando la
luz (considerada como energía) es absorbida
por una molécula se origina un salto desde
un estado energético basal o fundamental,
E1, a un estado de mayor energía (estado
excitado), E2, y; sólo se absorberá la energía
que permita el salto al estado excitado. Cada
molécula tiene una serie de estados
excitados (o bandas) que la distingue del
resto de moléculas. Como consecuencia, la
absorción que presenta dicha molécula a
espectro de absorción constituye una señal
de identidad de la misma.
Por último, la molécula en forma excitada
libera la energía absorbida hasta el estado
energético fundamental.
La Mecánica Cuántica nos dice que la luz
está compuesta de fotones cada uno de los
cuáles tiene una energía:
E Fotón=h ∙ v =h ∙c / λ ,
donde c es la velocidad de la luz, v es su
frecuencia, λ su longitud de onda y h= 6.63
x10-34 Jxs es la constante de Planck. Cuando
decimos que una sustancia química absorbe
luz de longitud de onda λ, esto significa que
las moléculas de esa sustancia absorben
fotones de esa longitud de onda.
En esta práctica se estudiará la absorción de
luz en el espectro UV-visible (400-700 nm).
Cuando una molécula absorbe un fotón en
este intervalo espectral, se excita pasando un
electrón de un orbital del estado fundamental
a un orbital excitado de energía superior. De
esta manera la molécula almacena la energía
del fotón:
A+h ∙ v → A ¿
1
 E ( A¿ )=E ( A ) + E Fotón
I L
dI dI If
Como la energía se conserva, la diferencia =−k ∙ [ B ] ∙ dL ⟹∫ =−k ⋅ [ B ] ⋅ ∫ dL⟹ ln =−k ∙ [ B ] ∙
I I I 0 I0
de energía entre el estado fundamental de la 0

molécula (A) y su estado excitado (A*) debe

ser exactamente igual a la energía del fotón.
Es decir, una molécula sólo puede absorber
fotones cuya energía h ∙ v sea igual a la
energía de un estado molecular excitado.
Cada molécula tiene una serie de estados
excitados discretos (o bandas) que dependen
de su estructura electrónica y que la
distinguen del resto de moléculas. Como
consecuencia, el espectro de absorción, es
decir, la luz absorbida en función de la
longitud de onda, constituye una verdadera
señal de identidad de cada sustancia o
molécula.
Los espectros de absorción se miden
mediante un instrumento denominado
espectrómetro. Éste instrumento consta de
una fuente de luz “blanca” caracterizada por
un espectro de emisión continuo en un
intervalo amplio de longitudes de onda y de
un monocromador que actúa como filtro
óptico transmitiendo un haz de luz de
longitud de onda fija λ e intensidad I 0. Este
haz de luz penetra en la cubeta de análisis
donde se encuentra la muestra. Un detector
sensible a la luz mide la intensidad del haz a
la salida If.
La intensidad del haz de luz se va atenuando
a medida que atraviesa la cubeta debido a la
absorción de las moléculas de la muestra. El
ritmo de absorción depende de la intensidad
inicial de luz y de la concentración de
moléculas.
De esta manera, cuando un haz de luz de
intensidad I recorre una distancia dL en una
muestra con una concentración de moléculas
[B], se produce una atenuación de intensidad
dI dada por:
dI = - k × [B]× I × dL
lo cual da lugar a la ley de Beer-Lambert
para la absorción que relaciona la intensidad
a la salida de la muestra If, con la intensidad
inicial I0, la concentración de moléculas y la
distancia recorrida por la luz en la muestra, L:
I f =I 0 ∙ e−k ∙[B ]∙ L
El espectrofotómetro, en lugar de la
intensidad, mide la absorbancia A que se
define por:
I0
A ≡ ln =k ∙[B]∙ L
If
La utilización de la absorbancia al realizar los
espectros tiene la ventaja de ser
directamente proporcional a la concentración
de moléculas en la muestra.
OBJETIVOS
 Aprender a utilizar el
espectrofotómetro UV-Visible,
variando la longitud de onda en la
determinación de la absorbancia de
una muestra de permanganato de
potasio 200, 400 y 600 µM.
 Determinar el coeficiente de extinción
molar por medio de la ecuación de
Beer-Lambert y por curva de
calibración.
MATERIALES Y REACTIVOS
Equipo: Espectrofotómetro visible
Implementos:
Celda para el estudio espectrofotométrico
Regla
Reactivos:
Permanganato de potasio 200, 400 y 600 µM

De acuerdo al sitio web asignado para la

realización de este trabajo.

La constante k se denomina coeficiente de

absortividad molar. La expresión anterior se
puede integrar de la siguiente forma:

2
METODOLOGÍA
1. Se ingresó a la siguiente dirección Web:
https://phet.colorado.edu/es/simulations/filter
?subjects=chemistry&sort=alpha&view=grid
2. Se seleccionó “Lab de la ley de Beer”
5. Se seleccionó una disolución y su
concentración inicial, se escogió la opción
“absorbancia” y se introdujo el sensor dentro
de la celda, de tal manera que el haz de luz
pasara por todo el centro; por último, se
escogió la opción “fija” de longitud de onda.
Finalmente, se modificó la concentración con
la flecha de desplazamiento y se leyeron los
valores de absorbancia. Se repitió este
procedimiento para tres disoluciones
diferentes.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
3. Se descargó y se escogió “Ley de Beer”
Para todos los experimentos se utilizaron los
siguientes datos:

Longitud de onda: 544 nm

Longitud (diámetro) de la celda: 1 cm

Opción 1: Absorbancia

Opción 2: “fija” de longitud de onda

Experimento 1:

Disolución: Permanganato de potasio

4. En este pantallazo del simulador se
(KMnO4)
encontró, el haz de luz, la opción de trabajar
con una longitud de onda variable o fija, el Concentración de la disolución: 100 µM
lector de absorbancia/transmitancia, un panel
con diferentes tipos de soluciones y un cursor Valor de la absorbancia: 0,09
que permitió escoger la concentración de la
Experimento 2:
solución y, por último, una regla.
Disolución: Permanganato de potasio
(KMnO4)

Concentración de la disolución: 200 µM

Valor de la absorbancia: 0,19

Experimento 3:

3
Disolución: Permanganato de potasio A=ε∗c∗l
(KMnO4)
A
Concentración de la disolución: 300 µM =ε
c∗l
Valor de la absorbancia: 0,27
Dónde:
Experimento 4:
A = Absorbancia de la disolución de KMnO4
Disolución: Permanganato de potasio
(KMnO4) ε = Coeficiente de absortividad molar o de
extinción
Concentración de la disolución: 400 µM
c = concentración molar de la disolución de
Valor de la absorbancia: 0,38 KMnO4

Experimento 5: l = longitud (diámetro) de la celda

Disolución: Permanganato de potasio Para el experimento 1:

(KMnO4)
0,09 L
Concentración de la disolución: 500 µM ε= =900
mol mol∗cm
(1 ×10−4 )∗(1 cm)
Valor de la absorbancia: 0,45 L
Experimento 6: Para el experimento 2:

Disolución: Permanganato de potasio 0,19 L

(KMnO4)
ε= =950
mol mol∗cm
(2 ×10−4 )∗(1 cm)
Concentración de la disolución: 600 µM L
Valor de la absorbancia: 0,57 Para el experimento 3:

Experimento 7: 0,27 L
ε= =900
mol mol∗cm
Disolución: Permanganato de potasio (3 ×10−4 )∗(1 cm)
(KMnO4) L
Concentración de la disolución: 700 µM Para el experimento 4:

Valor de la absorbancia: 0,63 0,38 L

ε= =950
mol mol∗cm
Tabla 1. Valores de concentración de la ( 4 ×10−4 )∗(1 cm)
disolución de KMnO4 y de absorbancia en los L
experimentos del 1 al 7. Para el experimento 5:
Concentra Concentra
ción de la ción de la 0,45 L
Experime
disolución disolución
Absorba ε= =900
nto ncia mol mol∗cm
de KMnO4 de KMnO4 (5 ×10−4 )∗(1 cm)
(µM) (M) L
1 100 0,0001 0,09
2 200 0,0002 0,19 Para el experimento 6:
3 300 0,0003 0,27
4 400 0,0004 0,38
5 500 0,0005 0,45 0,57 L
6 600 0,0006 0,57
ε= =950
mol mol∗cm
7 700 0,0007 0,63 (6 ×10−4 )∗(1 cm)
L
Ecuación de Beer-Lambert: Para el experimento 7:

4
 0,63 L extinción, el valor de la pendiente en la curva
ε= =900 de calibración.
mol mol∗cm
(7 ×10−4 )∗(1 cm)
L Asimismo, se comprende de mejor manera el
Ahora, se procede a comparar el coeficiente estudio de esta Ley, de acuerdo a que al
de absortividad molar o de extinción aumentar la concentración de la disolución
calculado por medio de la ecuación de Beer- aumenta el valor de la absorbancia, sin que
Lambert y de la pendiente suministrada por la se modifique o altere su coeficiente de
curva de calibración, de acuerdo con los extinción.
datos de la tabla 1.

0.7
0.6 f(x) = 914.29 x + 0 BIBLIOGRAFÍA
0.5 R² = 1
Absorbancia

0.4
1. Harris, D. C. Análisis Químico
0.3
Cuantitativo. 3ª ed. Capítulo 18. Ed.
0.2
Reverté, 2007.
0.1
2. Nieves Abril Díaz.
0
Espectrofotometría. Espectros de
0 0 0 0 0 0 0
absorción y cuantificación
Concentración de KMnO4 (M) colorimétrica de biomoléculas.
3. Basolo, F. Johnson, R. Química de
Figura 1. Curva de calibración de los datos los compuestos de coordinación. Ed.
suministrados en los experimentos del 1 al 7. Reverté, 1980. Página 86.

Como se puede observar en la figura 1, el

valor de la pendiente refleja el valor del
coeficiente de extinción para la disolución de
permanganato de potasio. Ahora, realizando
una curva de calibración para los datos
suministrados en los experimentos del 1 al 7,
el valor del coeficiente de extinción es
aproximadamente el promedio de los valores
de los experimentos del 1 al 7, calculado por
medio de la ecuación de Beer-Lambert en
cada uno de los experimentos. El coeficiente
de extinción o de absortividad molar
calculado por medio de la curva de
L
calibración es de 914,29 y el
mol∗cm
coeficiente de extinción promedio utilizando
la ecuación de la Ley de Beer-Lambert fue de
L
921,43 .
mol∗cm

CONCLUSIÓN

El coeficiente de extinción molar se puede

calcular mediante la Ley de Beer-Lambert y
por medio de una curva de calibración.
Reflejando el valor del coeficiente de

5
6