01 - Tecnicas Bioquimica Clinica. PDF

ANÁLISIS BIOQUÍMICO LABORATORIO CLÍNICO CURSO 2018-2019
1.- Técnicas utilizadas en el laboratorio de bioquímica

clínica
Espectrofotometría
Fluorometría
Electroquímica
Fotometría de llama
Espectrofotometría de absorción atómica
Turbidimetría y nefelometría
Electroforesis
Cromatografía
Refractometría
Osmometría
Química seca
Equipos automáticos y manejo de la información
Espectrofotometría
Introducción
La radiación electromagnética
La radiación electromagnética es una forma de energía que se propaga en forma de
ondas.
En toda onda son fundamentales dos conceptos:
1. Longitud de onda (λ: lambda) que es la distancia entre dos picos de onda y se mide en
nanómetros (nm).
1nm= 1mµ (milimicra) = 10Å (angstroms) = 10-9m
2. Frecuencia (v) que es número de ondas por segundo y se mide en hercios (Hz).
1Hz= 1 onda o ciclo/sg
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Podemos relacionar la longitud de onda de la radiación y su frecuencia mediante la

siguiente fórmula:
v= c/λ
c= velocidad de la radiación que depende del medio. Por ejemplo en el vacío sería la velocidad
de la luz 3 x 108 m/sg.
Cuando aumenta la longitud de onda menor es la frecuencia y viceversa.
La radiación electromagnética está formada por paquetes de energía llamados fotones y

la energía del fotón va a depender de su frecuencia y longitud de onda:
E= h x v = h x c/λ
h= constante de Plank= 6,62.10-34 J x s.

Cuanto menor es la longitud de onda (λ) mayor es la energía (E) de la radiación.
La diferencia entre las radiaciones electromagnéticas es su λ.

Regiones del espectro electromagnético
RAYOS Gamma (γ) X Uv Luz visible Infrarrojos Microondas
λ (nm) 0,1 1 180 300 750 400.103
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En las técnicas espectrofotométricas utilizamos la luz Uv y la luz visible.

Los rayos γ y X son radiaciones ionizantes (pueden producir diferentes patologías). La luz solar
o la emitida por una bombilla es una mezcla de radiaciones de diferentes longitudes de onda que
el ojo percibe como blanca.
Si hacemos incidir luz blanca sobre una solución que absorbe la luz a una determinada
longitud de onda, ésta transmitirá el resto de longitudes de onda y a la vista aparece el color
complementario a la longitu de onda absorbida.
Por tanto, una solución de un color determinado debe ser iluminada en
espectrofotometría con la longitud de onda del color que absorbe. Por ejemplo 500 nm para la
solución de color rojo.
(nm) REGIÓN COLOR ABSORBIDO COLOR

COMPLEMENTARIO
340-430 visible violeta amarillo-verdoso

430-475 visible azul amarillo
475-495 visible verde-azul naranja
495-505 visible azul-verde rojo
505-555 visible verde púrpura
555-575 visible verde-amarillo violeta
575-600 visible amarillo azul
600-620 visible naranja verdoso-azul
620-700 visible rojo azul-verdoso
Interacción entre la luz y la materia

Cuando la luz incide en la materia se pueden producir dos fenómenos:
1. Proceso de Absorción.
Cuando una sustancia en estado fundamental o en reposo interacciona con la luz,
absorbe energía y pasa a un estado excitado, espontáneamente tiende a desprender esa
energía en forma de calor y vuelve al estado de reposo.
Ao + h x v = A*= Ao + calor
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Ao = sustancia absorbente en reposo

h x v = Energía de la luz
A* = sustancia absorbente excitada
Cada absorbente o cromógeno tiene un espectro de absorción característico.
La medida de la luz absorbida por una solución es el fundamento de la

espectrofotometría.
2. Proceso de Emisión.
Algunos absorbentes, tras ser excitados, vuelven al estado de reposo emitiendo luz. En
esto se basa la fluorometría y la fotometría de llama.
Ao + h x v = A* = A0 + h x v1
h x v = energía de excitación
h x v1 = energía de emisión.
Leyes de absorción
Cuando un haz de luz incide sobre una solución coloreada se produce un proceso de
absorción y el haz que sale tiene una intensidad menor.
I (luz incidente) → solución coloreada (luz absorbida) → I1 (luz transmitida)
I > I1
I1 = I – luz absorbida
Definimos la transmitancia como la relación entre la luz incidente y la luz transmitida.
T = I1/I
En la práctica lo que se emplea es el %T.
%T = I1/I x 100
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Pero en lugar de la transmitancia es más frecuente utilizar la absorbancia (A) o también

llamada densidad óptica (D.O.) porque la relación entre la concentración de la solución y la
transmitancia es inversa y logarítmica, mientras que la relación entre la concentración y la
absorbancia es directamente proporcional.
A = log 1/T la absorbancia es el logaritmo de la inversa de la transmitancia.
- %T de 0 a 100, A de ∞ a 0
- si %T = 100 → A = 0, si % T = 0 → A = ∞
El espectrofotómetro lee la transmitancia y seguidamente la convierte en absorbancia

mediante cálculos matemáticos.
La más importante de todas las leyes de absorción es la ley de Lambert-Beer que dice que
la absorbancia (A) de una solución es directamente proporcional a su concentración y a la
longitud del paso de luz (cubeta ≈ de 1 cm).
A=axbxc
A = absorbancia
a = coeficiente de absorción → absorción de la solución con una concentración de 1 gr/l
y 1cm de espesor.
b = longitud del paso de luz (cm)
c = concentración de la solución o absorbente (g/l)
También podemos utilizar esta fórmula:
A = є x b (cm) x c (moles/l)
є = coeficiente de extinción molar (mol/l)
En la práctica cuanto mayor sea este coeficiente (a ó є) mayor es la sensibilidad del

método.
Esta ley tiene una aplicación práctica y es que nos permite averiguar la concentración de
una sustancia en una solución; de dos formas diferentes:
1. Por comparación con una solución de concentración conocida (estándar)
As/Ap = Cs/Cp
As = A del estándar
Ap = A del problema
Cs = concentración del estándar
Cp = concentración del problema
Cp = Cs x Ap/As
El cociente Cs/As se denomina factor (F) y es constante, por lo que:

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Cp = F x Ap
2. Curva de calibración.
Es una representación gráfica en un eje de coordenadas (la A en ordenadas y la
concentración en abscisas).
Con soluciones de concentración conocida, determinamos sus absorbancias y construimos
una curva (que en realidad es una recta) y la concentración de la solución problema la
averiguamos interpolando su absorbancia en la gráfica.
Un concepto muy importante en esta curva es la linealidad que se define como el

intervalo de concentraciones en las cuales existe una relación lineal entre la concentración y
la A, es decir, se cumple la ley de Beer. Cuando la concentración sobrepasa unos límites esta
ley deja de cumplirse y la recta se convierte en curva, y las lecturas de concentraciones van a
ser falsamente bajas; en este caso hay que diluir la muestra.
Instrumentación
Tipos de aparatos
Tenemos dos tipos según el sistema selector de longitud de onda:
• fotómetros o colorímetros, que emplean filtros.
• Espectrofotómetros, que emplean monocromadores (prismas o redes de difracción).
Según la disposición de sus componentes tenemos espectrofotómetros de haz simple y

de doble haz.
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El de doble haz puede ser de dos tipos: Doble haz en el espacio o doble haz en el
tiempo.
Los espectrofotómetros de doble haz tienen la finalidad de compensar las variaciones de

intensidad de la fuente de luz y las variaciones en la sensibilidad del detector.
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Componentes
1. Fuente de luz. Las lámparas más comunes son las de filamento de tungsteno, suelen emitir
luz entre 360-750 nm (visible). Otras lámparas que se emplean también son las de hidrógeno
o deuterio, éstas emiten luz en la región de los ultravioletas, entre 220-360 nm. Hay que tener
en cuenta que las lámparas no emiten luz de intensidad constante por lo que las lecturas
pueden variar.
2. Rendijas de entrada y de salida (colimadores). Proporcionan un haz de luz lineal y evitan que
la luz dispersa penetre o salga en el sistema selector de longitud de onda.
3. Sistema selector de λ. Se divide en dos grandes grupos:
a. Filtros. Los encontramos en los fotómetros.
• Filtros Wratten: consisten en una capa de gelatina coloreada entre dos láminas de
vidrio transparente.
• Filtros de vidrio: una o varias capas de vidrio coloreadas.
• Filtros de interferencia: se basan en los rayos que son reflejados en las dos capas
de una película, si ambos rayos están en fase su intensidad aumenta y si no es así
su intensidad disminuye, con lo cual conseguimos distintas λ a partir de la luz
blanca.
b. Monocromadores. Se encuentran en los espectrofotómetros y consiguen longitudes

de onda más estrechas.
• Prismas: Pueden ser de vidrio o de cuarzo, los de vidrio se utilizan para conseguir
luz visible, mientras que los de cuarzo son empleados para obtener luz ultravioleta.
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• Redes de difracción: son hendiduras paralelas situadas sobre un vidrio o una

superficie metálica y cuando la luz blanca incide sobre ellas se descompone en
varios colores.
Con los selectores de λ la luz obtenida no es verdaderamente monocromática sino

que comprende un intervalo de longitudes de onda.
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Ancho de banda: intervalo de longitudes de onda que pasan

por la rendija de salida.
Ancho de banda nominal: son las longitudes de onda que
pasan cuando la intensidad luminosa es del 75%.
Longitud de onda nominal: Cuando pasa el máximo de
intensidad luminosa.
4. Cubeta. Recipiente donde se coloca la muestra. Actualmente las
cubetas son de plástico. Si trabajamos con luz ultravioleta las
cubetas tienen que ser cuarzo. Tienen diferentes formas, pero
generalmente se utilizan las rectangulares y todas tienen aprox.
1cm de paso de luz. Son mejores las fundidas que las
cementadas.
5. Sistema de detección. Convierte la señal luminosa en eléctrica.
Existen dos sistemas diferentes:
a. Fotocélulas: Una fotocélula es una lámina de cobre
sobre la que hay un material semiconductor, como el selenio, y sobre este un metal
transparente. Cuando se ilumina emite electrones.
b. Tubo fotomultiplicador: Es un tubo que en su interior tiene un cátodo (-) que emite
electrones al recibir luz. Estos electrones van hacia el ánodo (+) y entre ambos polos
hay otros electrodos llamados dinodos que amplifican el número de electrones
emitidos.
6. Sistema de presentación de datos. Actualmente la lectura es digital. Además los

microprocesadores permiten cálculos de concentración, realizar curvas de calibración, etc.
Mantenimiento
Los aparatos deben mantenerse limpios, libres de polvo, suciedad, líquidos

derramados…
También hay que vigilar el estado de las lámparas ya que con el tiempo se desgastan y
pierden intensidad.
El espectrofotómetro hay que encenderlo un rato antes de su uso.
Las cubetas tienen que estar limpias, sin arañazos, por donde incide el rayo de luz no se
pueden tocar.
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Aspectos prácticos
Empleo de blancos
Antes de efectuar cualquier lectura hay que hacer un blanco, con esto se consigue eliminar
la absorción en ese espectro de longitud de onda por parte de la cubeta o el disolvente del
cromógeno.
Consiste en hacer una primera medida con todos los componentes de la disolución,
excepto el absorbente o cromógeno en la misma cubeta, haciendo un ajuste de transmitancia al
100% o de absorbancia a 0. Así la absorbancia del blanco se resta de la absorbancia de los
problemas.
Hay diferentes tipos de blancos:
• Blanco aire: Cubeta vacía.
• Blanco de agua destilada: Cubeta con agua destilada.
• Blanco de suero: la lectura inicial se hace con la muestra (generalmente suero)
diluida, en la misma proporción en la que se va a mezclar posteriormente con el
reactivo, con un disolvente inerte con el que no reacciona. Con ésto lo que
hacemos es eliminar las interferencias de la propia muestra debidas por ejemplo a
una hemólisis, lipemia, bilirrubinemia, etc.
• Blanco de reactivo: la lectura inicial se hace con el reactivo antes de añadirle la
muestra, con lo cual elimina las interferencias que pueda producir el reactivo.
Desviaciones de la ley de Beer

Cuando se desvía la recta y se convierte en curva estamos ante el límite de linealidad, lo
primero que hay que descartar es que haya una concentración muy elevada del cromógeno y
entonces hay que diluir la muestra (por ejemplo ½, 1/3, ¼…).
Curvas de calibración
Debemos estudiar concentraciones que cubran el rango que se va a encontrar en la
práctica.
Para realizar una curva necesitamos como mínimo tres puntos y siempre que haya un
cambio de reactivos o ajustes en el aparato hay que volver a realizar otra curva.
Factores de calibración
F = Cs/As por lo que Cp = F x Ap
Si hay que ajustar el aparato o cambiar los reactivos hay que calcular de nuevo el factor.
Ejercicios
1. Construir una curva de calibración para una técnica de determinación de glucosa en suero
con los siguientes datos:
Absorbancias Concentración (mg/dl)

0,050 50
0,100 100
0,150 150
0,250 250
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0,500 500
0,600 800
A partir de ella:
a. Calcular la concentración de glucosa en un suero que da una lectura de 0,125.
b. ¿Qué harías con un suero que diera una lectura de 0,700? ¿por qué?
c. Si decidieras diluirlo, ¿qué factor de dilución emplearías?
d. ¿Cuál se consideraría el límite de linealidad para esta curva?
2. Vamos a hacer una determinación de glucosa en sangre, para ello recurrimos al empleo de
una solución estándar de glucosa de concentración 100 mg/dl. Obtenemos las siguientes
lecturas:
A estándar = 0,200
A p1 = 0,400
A p2 = 0,800
A p3 = 1,500
a. Con estos datos calcular las concentraciones que tendrían los tres sueros problema y el
valor del factor.
b. Sabiendo que el límite de linealidad de la técnica es de 600 mg/dl, ¿habría que diluir
alguna muestra y repetir la determinación?
c. Diluimos el problema 3 a 1/5 y repetimos la lectura, ahora es de 0,320 ¿Cuál será la
concentración real de la glucosa en ese suero?
Respuestas
Respuestas ejercicio 1 espectrofotometría:

a. 125 mg/dl.
b. Diluir, porque el resultado obtenido cae fuera del límite de linealidad.
c. Aproximadamente 1/3, para situar el resultado en la zona de linealidad. El resultado
después habría que multiplicarlo por 3.
d. 500 mg/dl. Aquí la recta se hace curva.
Respuestas ejercicio 2 espectrofotometría:

a. Muestra 1 = 200 mg/dl
Muestra 2 = 400 mg/dl.
Muestra 3 = 750 mg/dl
Factor: F = Cs/As = 100/0,200 = 500
b. Diluir la muestra 3 para que su lectura se encuentre en la zona de linealidad.
c. 0,320 x 500 = 160
160 x 5 = 800 mg/dl
Fluorometría
Principios
En la fluorometría se mide la luz emitida por un fluorocromo, como la fluoresceína,

rodamina, cumarina...
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Fº + h x v → F* → Fº + h x v1
Siempre la energía de la luz emitida es menor que la de la luz incidente.

El fenómeno de fluorescencia es más lento que el de absorbancia y cumple la ley de Beer,
la luz emitida es directamente proporcional a la concentración; siempre y cuando trabajemos en
condiciones adecuadas de temperatura, pH y longitud de onda; y que la absorbancia de la
disolución sea menor o igual al 2%. Para disminuir esta absorbancia se trabaja siempre con
muestras muy diluídas.
Los fluorocromos presentan un espectro de excitación (intervalos de longitudes de onda
en los que se excitan) y un espectro de emisión (intervalos de longitudes de onda que emiten) por
ejemplo la cumarina se excita a 340 nm y emite a 440 nm.
Instrumentación
Hay dos tipos de aparatos, los fluorómetros y los espectrofluorómetros. La diferencia es

que los primeros utilizan filtros mientras que los espectrofluorómetros emplean
monocromadores.
• Fuente de luz: se necesitan lámparas de gran intensidad luminosa como las de xenón o
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mercurio.
• Sistema selector de λ de excitación y de emisión: dependiendo del fluorocromo utilizado se
selecciona una determinada λ.
• Cubetas: tienen que ser de sílice o cuarzo, porque el plástico y el vidrio presentan
fluorescencia adicional.
• Detector: puede ser una fotocélula o un tubo fotomultiplicador y tiene que estar a 90º del
haz de luz incidente para evitar que le llegue directamente la luz transmitida.
Aspectos prácticos
La ventaja más importante de este método con respecto a la espectrofotometría es su

sensibilidad, de 100 a 1000 veces más sensible. Por eso se utiliza para medir sustancias que están
presentes en líquidos biológicos en muy bajas concentraciones como enzimas, hormonas y
fármacos.
Sobre todo se utiliza en el laboratorio de inmunología en la técnica de
inmunofluorescencia en la que se marcan Acs con un fluorocromo.
Electroquímica
Concepto de Electroanalítica o Electroquímica
Los métodos electroanalíticos son aquellos en los que medimos potenciales eléctricos
mediante una célula electroquímica (electrodo).
La electroquímica es la parte de la química que estudia una serie de procesos basados en
las reacciones redox, las reacciones de reducción-oxidación son las reacciones de transferencia
de electrones. Esta transferencia se produce entre dos sustancias químicas, una oxidante y otra
reductora. El agente reductor es aquel elemento químico que suministra electrones al medio,
oxidándose. El agente oxidante es el elemento químico que tiende a captar esos electrones,
quedando reducido.
Sr + So → So + Sr
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Fe + OCu → OFe + Cu
En la reacción redox hay un flujo de electrones y por lo tanto se origina una corriente
eléctrica, podemos medir su intensidad con un amperímetro o también podemos medir la
diferencia de potencial mediante un potenciómetro (pH-metro y electrodos selectivos). La
corriente eléctrica es directamente proporcional al flujo de electrones y, por tanto, a la
concentración de la sustancia a medir. Esto va a ser el fundamento del pH-metro y de los
electrodos selectivos.
La célula electroquímica se compone de dos electrodos:
• Electrodo específico o indicador.
• Electrodo de referencia.
El electrodo específico es diferente dependiendo de la sustancia a analizar. Lo que
medimos es la variación de potencial del electrodo específico respecto al electrodo de referencia.
Podemos utilizar diferentes electrodos de referencia:
• Electrodo de hidrógeno a 25ºC: Se le asigna el valor de potencial 0 de forma
arbitraria, todos los demás electrodos de referencia se comparan respecto a éste.
• Electrodo de calomelano: Está compuesto de mercurio en equilibrio con calomel
(Hg2Cl2). La diferencia de potencial respecto al electrodo de hidrógeno es de
+0,241V.
• Electrodo de plata: Está compuesto de plata recubierta de cloruro de plata (AgCl) en
contacto con una solución de cloruro potásico o sódico. La diferencia de potencial
respecto al electrodo de H es de +0,197V.
Medida del pH
El electrodo de pH presenta como electrodo específico un electrodo de vidrio y como

electrodo de referencia el de plata.
Para medir el pH de las soluciones debemos calibrar previamente el aparato con
soluciones tampón de pH conocido. Se recomienda calibración diaria y si se realizan muchas
mediciones repetir calibración cada 2 o 3 horas. La calibración se hace como mínimo con dos
tampones de pH 7,02 y pH 4,00. Es importante seleccionar la temperatura previamente tanto del
tampón como de la muestra ya que influye en los resultados de la determinación.
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Medida de la pCO2
Para medir la presión parcial de anhídrido carbónico se utiliza habitualmente el electrodo

de Severinghaus. Está compuesto por un electrodo de vidrio sensible al pH y un electrodo de
referencia de plata-cloruro de plata. Ambos electrodos están separados de la muestra por una
membrana que puede ser atravesada únicamente por CO2. El CO2 de la sangre o del gas de
calibración atraviesa la membrana y modifica el valor del pH del electrolito siendo su
concentración proporcional a la presión de CO2.
CO2 + H20 → CO3H- + H+
Medida de la pO2
Habitualmente en la medida de la presión parcial de oxígeno se utiliza el electrodo de

Clark.
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Electrodos selectivos de iones
Permiten medir variaciones de potencial debidas a la concentración de un determinado

ión. Esta diferencia de potencial se compara con la diferencia de potencial existente en dos
soluciones de concentración conocida del ión. La composición del electrodo específico es
diferente dependiendo del ión que se pretenda medir.
Hidrógeno Vidrio
Sodio Vidrio de composición diferente
Potasio Polivinilcloruro / valinomicina
Cloro Sulfuro de plata / cloruro de plata
Mantenimiento de los electrodos
La parte más sensible de los electrodos es la membrana, por tanto es la zona que requiere
una mayor precaución. Hay que evitar golpes, arañazos, evitar que se seque (siempre húmeda).
Para calibrar, las soluciones deben ser frescas ya que con el tiempo, los cambios de
temperatura, la luz o la presencia de sustancias contaminantes, se alteran.
Hay que seleccionar la tª tanto del tampón como de la muestra ya que la temperatura
altera el pH.
Si se observan burbujas en la membrana hay que quitarlas, para ello se sacude cómo si
fuese un termómetro clínico.
Entre medida y medida, el electrodo se lava siempre con agua destilada y permanece
sumergido en ella.
Para la limpieza general del electrodo se utilizan detergentes comunes. Si se introduce
en soluciones inorgánicas se limpia con soluciones ácidas. Si se ha introducido en grasas o
aceite se limpia con alcohol o acetona. Si se ha introducido en soluciones proteicas se limpia
con pepsina al 5% en HCl 0,1M. Si se observan depósitos resistentes se lava con lejía o H2O2.
Siempre que se realice una limpieza del electrodo se enjuagará con agua destilada y
cuando realicemos una limpieza en profundidad es conveniente cambiar el electrolito de
referencia.
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Fotometría de llama
Fundamento
Átomo en estado fundamental + calor (llama) → Átomo en estado excitado (salto de

electrones nivel energético mayor) → Átomo en estado fundamental + luz (longitud de onda
característica de cada átomo).
Los metales alcalinos (Li, Na y K) son los más fáciles de excitar con la llama del mechero.
La intensidad luminosa que emiten va a ser directamente proporcional a la concentración del ión
en la muestra.
Instrumentación
El gas y la muestra son aspirados, pasando por un atomizador y una llama, se genera una
luz de la que se selecciona la longitud de onda adecuada a la sustancia a investigar.
Técnica
Los fotómetros de llama que se utilizan en clínica son del tipo “estándar interno”. El
estándar interno puede ser litio para determinar sodio o potasio, o cesio para determinar litio,
sodio o potasio.
Se hacen diluciones de estándares del elemento a medir trabajando con una solución de
concentración constante de estándar interno. Éste emite en una determinada longitud de onda,
siempre alejada de la longitud de onda que emite el elemento que estamos investigando, sirve de
referencia y permite su comparación con la emisión de los elementos investigados.
El estándar interno permite detectar variaciones en la aspiración, atomización, estabilidad
de la llama… Amortigua los efectos de excitación mutua entre átomos de sodio y potasio
permitiendo determinaciones más exactas y precisas.
Mantenimiento
Para que el aparato funcione en buenas condiciones hay que vigilar los componentes de
aspiración, el atomizador y el quemador.
Espectrofotometría de absorción atómica
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Es una técnica que se utiliza en la determinación de calcio, magnesio, cobre, cinc,

plomo y otros metales.
Fundamento
Átomo ionizado en solución + llama → Átomo en estado neutro ← absorción de luz a

determinada longitud de onda.
El átomo en estado neutro absorbe luz a una determinada longitud de onda emitida por
una lámpara de cátodo hueco construida con el metal a estudiar. La cantidad de luz absorbida es
proporcional a la concentración del metal en la muestra.
Instrumentación
Para la determinación de algunos metales como el plomo en vez de utilizar la llama se

utiliza un horno de grafito.
Turbidimetría y Nefelometría
Son técnicas muy empleadas en análisis clínicos.
Fundamento
Luz incidente → partícula en suspensión → luz dispersada.

Cuando el tamaño de la partícula en suspensión es igual al de la longitud de onda de la
luz incidente se favorece que la luz se disperse hacia adelante en distintos ángulos. La
disminución de la longitud de onda de la luz incidente aumenta la intensidad de la luz dispersada.
El aumento del peso molecular de las partículas y su mayor concentración aumenta la intensidad
de la luz dispersada. El aumento de la distancia cubeta-detector disminuye la intensidad de la luz
dispersada.
Diferencias entre ambos métodos:
• Turbidimetría: Mide la disminución de la intensidad del haz de luz incidente cuando pasa
a través de una suspensión de partículas. El detector tiene que estar a 0º del haz de luz
incidente y la medida se puede hacer en cualquier espectrofotómetro.
• Nefelometría: Mide la luz dispersada en ángulos distintos al de la luz incidente, en
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ángulos que van de 15º a 90º. El aparato utilizado es el nefelómetro.
Instrumentación
Si utilizamos una fuente de luz láser podemos prescindir del colimador y del sistema
selector de longitud de onda.
Técnica
Trabajamos en longitudes de onda a las que los componentes del suero no presenten
absorbancia para evitar las interferencias. Las longitudes de onda son 320-380 nm y 500-600 nm.
Podemos trabajar “a punto final” realizando una medida puntual o utilizar métodos
“cinéticos” con varias medidas de la dispersión a lo largo del tiempo.
Estas técnicas se emplean, sobre todo en inmunología, ya que permiten cuantificar
inmunocomplejos Ag-Ac.
Electroforesis
Generalidades
La electroforesis es una técnica de separación de partículas cargadas al hacerlas pasar

por un campo eléctrico.
La partícula cargada y el campo eléctrico

Las partículas en función de su carga emigran al polo + o -. Las partículas con carga +
llamadas cationes emigran hacia el polo – o cátodo y las partículas con carga – reciben el nombre
de aniones y emigran al polo + o ánodo.
La fuerza que ejerce el campo eléctrico sobre la partícula es proporcional a la carga y al
potencial o voltaje.
F=QxV
F: Fuerza del campo eléctrico.

Q: Carga de la partícula.
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V: Voltaje o potencial.
La fuerza que se opone al movimiento de la partícula es proporcional al tamaño y forma

de la partícula y a la viscosidad del medio donde se encuentre (soporte y tampón).
Fr = f x v
Fr: Fuerza de resistencia.

f: Coeficiente de fricción.
V: velocidad.
La velocidad de migración por unidad de campo eléctrico se denomina movilidad

electroforética, se representa por μ, sus unidades son cm2/V x sg (voltio por segundo).
Factores que afectan a la migración de partículas

• pH del tampón: El pH del tampón o solución en la que están inmersas las partículas es lo
que decide el grado de ionización de las partículas, es decir la carga neta de las mismas.
Las proteínas son compuestos anfóteros, es decir, pueden estar cargados positiva o
negativamente dependiendo del pH del medio en el que se encuentren. Cada proteína tiene
un pH en el que su carga neta es igual a 0 (mismo nº de cargas positivas que de negativas)
denominado punto isoeléctrico (pI). Para la mayoría de las proteínas es ácido, por ejemplo
en la albúmina es de 4,6, a un pH superior gana cargas negativas y se comportará como
anión y viceversa.
• Fuerza iónica del tampón: La corriente es transportada por las partículas cargadas y por
los iones del tampón. Cuanto más concentrado es el tampón más corriente transportan sus
iones y menos las partículas, que migrarán más despacio. Además, las partículas ionizadas
están rodeadas por la denominada nube iónica de los iones del tampón y se mueven todos
juntos, si la nube iónica es muy grande las partículas se moverán más lentamente. El
tampón tiene que tener la concentración suficiente para mantener un pH constante y
transportar la corriente, si aumentamos su concentración la migración de partículas será
más lenta.
• Tamaño y forma de la partícula: A veces es más importante incluso que la carga eléctrica.
Sobre todo cuando se utilizan soportes que permiten el paso selectivo de moléculas según
el tamaño.
• Potencial del campo eléctrico: La movilidad electroforética de la partícula aumenta con
el potencial del campo eléctrico.
V=RxI
Esta es la ley de Ohm. El voltaje es directamente proporcional a la resistencia e intensidad

del paso de corriente.
V: Voltaje o potencial en voltios (V).
R: Resistencia en ohmnios (Ω).
I: Intensidad en amperios (A).
Cuando trabajamos con la cubeta de electroforesis podemos mantener constante el voltaje o

amperaje. Aumentando el voltaje podríamos acelerar la separación, pero también aumentaría
la temperatura y esto daría lugar a:
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• Desnaturalización de las proteínas (+50ºC).

• Evaporación del tampón con aumento de su fuerza iónica.
Si queremos trabajar con un alto voltaje necesitamos algún sistema de refrigeración para
que mantenga baja la temperatura.
Pasos en la electroforesis
Obtención y preparación de la muestra

La electroforesis la podemos realizar con distintas muestras biológicas, como suero, orina,
LCR… Dependiendo del análisis a realizar necesitaremos un tratamiento previo de la muestra,
por ejemplo para el proteinograma empleamos suero únicamente, pero para la electroforeis de la
Hb necesitamos realizar previamente un hemolizado para romper los hematíes y que liberen la
Hb.
Selección y preparación del soporte

Todos los procedimientos de electroforesis se realizan sobre un soporte, la electroforesis
recibe el nombre de electroforesis de zona.
Tenemos dos tipos de soportes: No restrictivos y restrictivos.
Los no restrictivos reciben este nombre porque el único factor que afecta al movimiento
de la partícula es su carga eléctrica. Dentro de estos el primero que se utilizó fue el papel, pero
hoy en día ya no se utiliza. Los soportes no restrictivos utilizados actualmente son:
a) Acetato de celulosa: Es un tipo de plástico que se obtiene al reaccionar la celulosa y el
anhídrido acético. En las tiras de acetato de celulosa se forman fibras que dejan espacios
de aire entre ellas y antes de utilizar la tira hay que sumergirla en el tampón, que llenará
estos espacios y permitirá el paso de la corriente eléctrica. Generalmente se emplea el
acetato de celulosa gelatinizado (cellogel) por su facilidad de manejo, rápida ejecución y
fácil lectura.
b) Agarosa: El agar es un polisacárido derivado de algas marinas que está compuesto de
agarosa y agaropeptina. La agaropeptina no sirve como soporte porque presenta cargas
eléctricas, pero la agarosa si ya que carece de grupos cargados. Empleamos el gel de
agarosa a una concentración de 0,5 a 1 g/100 cm3. Su aspecto es claro y transparente y
permite la cuantificación por fotodensitometría. Su no restricción no es absoluta ya que
las moléculas de alto peso molecular pueden verse frenadas en su desplazamiento.
En los restrictivos la resistencia al desplazamiento de las partículas viene determinada por
el tamaño del poro del gel. Tienen el inconveniente de que la técnica de la electroforesis es más
complicada, pero la ventaja de que se consigue una mejor separación. Los primeros que se
utilizaron fueron los geles de almidón, pero como eran muy difíciles de preparar ya no se utilizan.
Actualmente se utilizan los geles de poliacrilamida, se consiguen polimerizando una amida, la
poliacrilamida, con un agente enlazante. Se pueden preparar geles con un tamaño de poro
variable, así además de separar las partículas por su carga las separamos por su tamaño. Como
además son geles transparentes también podemos efectuar la lectura por densitometría.
Los geles, de acuerdo con la forma del soporte donde se encuentren, pueden ser planos o
cilíndricos. En el gel plano el soporte es una lámina de vidrio y la separación electroforética se
aprecia en forma de bandas. En el gel cilíndrico el soporte es un tubo de vidrio y la separación se
aprecia en forma de discos.
Además de acuerdo con la composición del gel podemos encontrarnos geles homogéneos,
cuando la concentración del gel es la misma en todo el soporte y se preparan en placas; o geles
en gradiente, cuando su concentración varía a lo largo del soporte, pudiendo ser de gradiente
continuo (concentración aumenta o disminuye progresivamente) o discontinuo y se
22
preparan en placas o tubos.
Aplicación de la muestra
Existen diferentes técnicas:
• Aplicación directa sobre la superficie: Por ejemplo en el proteinograma en
acetato de celulosa se aplica directamente el suero sobre el soporte.
• Practicar orificios o ranuras en los geles: Por ejemplo en la electroforesis del
ADN se deposita en estas ranuras la muestra.
• Incluir la propia muestra en el gel durante el proceso de polimerización.
En la electroforesis bidimensional realizamos una segunda aplicación con la muestra
conseguida en la primera separación electroforética, por ejemplo recortando un trozo de gel y
pegándolo sobre otro gel.
Proceso electroforético
Para realizarlo vamos a necesitar una cubeta y una fuente de alimentación.
La cubeta es la cámara que contiene los electrodos situados en dos receptáculos
conectados por un puente salino.
Este puente es el soporte
impregnado de tampón. La cubeta
tiene que funcionar tapada para
evitar la evaporación del tampón,
incluso algunas se refrigeran para
evitar el calentamiento.
La fuente de alimentación
proporciona la energía eléctrica y
según el tipo de electroforesis
podemos trabajar a voltaje o
intensidad constante.
Revelado
Tiene como función localizar las distintas fracciones en las que ha sido separada la
muestra. Fundamentalmente se hace mediante tinción con diferentes colorantes, eliminando el
exceso de colorante mediante sucesivos lavados.
SUSTANCIAS COLORANTES
Proteínas Rojo Ponceau
Negro amido
Azul brillante de Coomassie
Lipoproteínas Negro Sudán B
Azul brillante de Coomassie
Glucoproteínas PAS (ácido peryódico-Schiff)
Enzimas Deshidrogenasas NADH (fluorescencia)
Esterasas Esteres de β-Naftol
23
Fosfatasas α-Naftilfosfato
Lectura y evaluación
La lectura se da como % de cada fracción respecto al total de sustancias analizadas. Se
puede hacer de formas diferentes:
• Elución: Consiste en recortar cada zona de la tira donde se encuentra la banda, se eluye
en un disolvente adecuado al colorante y obtenemos una solución coloreada que se
cuantifica espectrofotométricamente.
• Densitometría: Es la lectura directa de las fracciones de la tira mediante un aparato
llamado fotodensitómetro que hace medidas fotométricas. En el aparato se selecciona la
longitud de onda del color de las fracciones y se hace pasar un haz de luz a través de la
tira y a lo largo de toda ella. Las fracciones sucesivas absorberán la luz en función de la
densidad del color, el detector registra la intensidad de la luz transmitida, menor cuanto
más densa sea la banda. Esto permite realizar una gráfica en la que cada banda aparece
como un pico, cuya altura depende de la densidad del color y la anchura de la base del
ancho de banda leída. También el aparato nos da el porcentaje de cada banda respecto al
total. En esta técnica de lectura es importante que el soporte sea transparente para que no
interfiera el paso de luz, por eso los soportes más empleados son el acetato de celulosa
gelatinizado (cellogel) y los geles de agarosa.
• Utilizando un escáner y un programa informático adecuado. Suele ser el procedimiento
actual de lectura.
Técnicas electroforéticas
Electroforesis en acetato de celulosa

Es un método económico, de fácil manejo, rápida separación y susceptible de
transparentación previa a la lectura fotodensitométrica.
El soporte más utilizado es el de acetato de celulosa gelatinizado (cellogel),
Electroforesis en gel de agarosa

También es de amplio uso. Las láminas se pueden comprar preparadas o se prepara un
solución que funde a 50ºC y al dejar enfriar solidifica.
Al tener esta baja temperatura de fusión permite la incorporación de proteínas, por
ejemplo Ac, y es este el motivo de que se emplee habitualmente como soporte en las técnicas
inmunoquímicas.
La muestra se aplica en pocillos escavados en el gel.
Electroforesis en gel de poliacrilamida

Además de separar las partículas en función de la carga también se separan por su
tamaño, ya que influye el tamaño del poro del gel.
Los geles se pueden preparar en placas o tubos, con el mismo tamaño de poro en todo el
gel, homogéneos, o bien con distinto tamaño, heterogéneos, en este último caso pueden ser en
gradiente contínuo cuando el tamaño varia de forma gradual o discontínuo cuando varía en zonas
bien diferenciadas.
Una técnica muy extendida es el SDS-PAGE, es el acrónimo en inglés de sodium dodecyl
sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (electroforesis en gel de poliacrilamida con
dodecilsulfato sódico).
24
Isoelectroenfoque
Se puede realizar sobre cualquier tipo de soporte, como celulosa, agarosa o
poliacrilamida. Sirve para separar sustancias anfóteras, como las proteínas, en función de su
punto isoeléctrico, pH al que las cargas + y – se igualan, es decir carga neta igual a 0.
Sobre el soporte se establece un gradiente de pH mediante una mezcla de anfolitos, este
gradiente aumenta poco a poco desde el ánodo (+) hacia el cátodo (-). Los anfolitos son mezclas
de ácidos alifáticos poliaminopolicarboxílicos, que cuando son sometidos a una corriente
eléctrica migran de acuerdo con sus cargas, creando un gradiente de pH.
Cuando una proteína se introduce en este gradiente migrará de acuerdo con su carga, hacia
su punto isoeléctrico y cuando llegue a él se parará.
Esta técnica precisa de un voltaje muy elevado, de hasta 2000 V, por lo que se necesitan
cubetas refrigeradas. Su ventaja es su gran poder de resolución pudiendo separarse moléculas con
pI muy cercanos.
Aplicaciones clínicas
La técnica de rutina en todos los laboratorios es el proteinograma o separación de

proteínas séricas, suele hacerse en acetato de celulosa.
También se utiliza el gel de agarosa para las técnicas inmunoquímicas como la
inmunoelectroforesis, para la separación de lipoproteínas e isoenzimas, y para la investigación
de ADN (técnicas de biología molecular).
El gel de poliacrilamida se utiliza para determinar pesos moleculares de proteínas, para
determinar isoenzimas y en la técnica del isoelectroenfoque.
Aspectos prácticos
• Tampón. Vigilar que el pH y su fuerza iónica sean constantes. Cuando se almacena el

tampón puede sufrir una contaminación bacteriana o micótica y el pH se altera, por este
25
motivo debe guardarse en el frigorífico. Durante la electroforesis se produce un proceso

de electrolísis del agua del tampón que puede alterar el pH. Si el volumen que empleamos
de tampón es pequeño lo mejor es desecharlo, si el volumen es grande en la siguiente
electroforesis habría que cambiar la polaridad de los electrodos, o mejor mezclar el
tampón de las dos cámaras. La fuerza iónica va a depender se su concentración, el
calentamiento durante la electroforesis provoca evaporación del tampón y por tanto
aumento de su concentración y fuerza iónica.
• Fuente de alimentación y cubetas. Comprobar que la fuente está encendida, que la
polaridad es la correcta y que trabajamos con el voltaje y amperaje adecuados. Las cubetas
tienen que estar limpias, siempre se trabaja con ellas tapadas y en posición horizontal.
• Soportes. Comprobar que están situados en posición correcta (en el caso de las tiras de
acetato de celulosa la muesca tiene que quedar abajo y a la derecha) y que los dos
extremos del puente salino estén en contacto con el tampón. Los soportes no tienen que
tener en su superficie grupos ionizables ya que provocarían una nube iónica alrededor que
retrasaría el movimiento de las partículas, este fenómeno recibe el nombre de
electroendosmosis.
• Aplicación. Debemos usar un aplicador bien limpio, además hay que respetar las
cantidades para después poder cuantificar las bandas. En las técnicas macro se aplican de
3-5 μl o 16 mm, en las semimicro 1,5 μl o 9 mm y en las micro 0,5 μl o 5 mm.
• Voltaje. Si lo incrementamos la electroforesis es más rápida pero aumenta la temperatura
y esto tiene dos consecuencias:
• Evaporación del tampón con lo que aumenta su fuerza iónica.
• Por encima de 50ºC se desnaturalizan las proteínas.
• Cuando nos pasamos de temperatura las bandas de la electroforesis aparecen arqueadas
ya que la temperatura es mayor en los bordes y las proteínas del centro migran más lejos.
• Tinción y lectura. Hay que respetar los tiempos de coloración, trasparentación… y vigilar
la conservación de los reactivos.
Cromatografía
Introducción
La cromatografía también es una técnica de separación de moléculas. La separación

cromatográfica se produce entre dos fases: la fase móvil, que es un flujo líquido o gaseoso en el
cual se encuentran las sustancias que se van a separar, y la fase estacionaria es el lecho a través
del cual fluye la fase móvil. La sustancia que tenga más afinidad por la fase estacionaria se
retrasará en su avance.
Clasificación
26
Las técnicas cromatográficas se pueden clasificar en:

a) De acuerdo con las características físicas de la fase móvil y estacionaría.
• Fase móvil líquida o gaseosa.
• Fase estacionaría sólida o líquida.
Las posibilidades serían: cromatografía L/S, L/L, G/S o G/L.
b) Según el mecanismo físico que lleva a la separación de las sustancias:
• Adsorción.
• Partición.
• Intercambio iónico.
• Exclusión molecular.
• Afinidad.
c) De acuerdo con el tipo de soporte:
• Plano: el papel o en placa fina.
• En columna.
La cromatografía gaseosa siempre es en columna, mientras que la líquida puede ser
en plano o en columna.
Formas de cromatografía según los soportes utilizados
En papel
El soporte es plano y es una hoja de papel de celulosa de elevada pureza que está
recubierta de una capa de agua que es la fase estacionaría y, por tanto, líquida.
La fase móvil en la que va disuelta la muestra es líquida también y está formada por
disolventes de distinta naturaleza en función de los componentes a separar, o sea, es una
cromatografía L/L por el mecanismo de partición.
La técnica consiste en:
• Aplicar la muestra sobre el papel en un extremo y esperar a que se seque.
• Introducir el soporte en la cámara, en la base estará el disolvente.
• El disolvente asciende en el papel por capilaridad y arrastra los componentes de la
mezcla.
27
• Los más retenidos por la fase estacionaría quedará más cerca del punto de aplicación y
los menos retenidos más cerca del frente del solvente (lugar hasta donde asciende el
líquido).
• Se quita el papel de la cámara y se deja secar.
• Por procedimientos físicos o químicos se obtiene un cromatograma que consiste,
simplemente, en unas manchas en el papel.
En algunos casos se hace lo que se llama una cromatografía bidimensional, que consiste
en girar el papel 90° y realizar una segunda cromatografía.
En capa fina
En este tipo de cromatografía también el soporte es plano. Consiste en una suspensión de
partículas sobre una placa de vidrio que posteriormente se seca con calor, esta es la fase
estacionaría y es sólida. La fase móvil está constituida por disolventes y es líquida. Por tanto es
una cromatografía L/S por el mecanismo de adsorción.
La técnica es similar al anterior, pero en vez de papel es una lámina de vidrio. Las
manchas se pueden detectar por medios físicos como los rayos UV o químicos. Podemos
identificar los componentes mediante el empleo de patrones que son sustancias de naturaleza
conocida. También se puede hacer una cuantificación mediante densitometría.
En columna L/S, L/L, G/S o G/L

Son los tipos de cromatografía más utilizados. Las columnas están formadas por un tubo
que lleva empaquetado en su interior un soporte que es la fase estacionaría. La fase móvil es el
disolvente que se hace pasar a través de la columna en la cromatografía líquida o un gas en la
cromatografía gaseosa.
La muestra se introduce en la columna junto con la
fase móvil, los componentes de la muestra son eluidos fuera
de la columna y de esta forma se obtienen las distintas
fracciones. Es el llamado cromatograma en el que las
sustancias se detectan en forma de picos.
Existen dos tipos fundamentales de cromatografía en
columna dependiendo de la fase móvil:
1) HPLC (cromatografía líquida de alta resolución):
Consigue separaciones de sustancias en cuestión de
minutos.
28
2) GC (cromatografía de gases): El gas procede de un tanque a presión y en este gas se inyecta

la muestra, la muestra pasa por la columna que tiene un sistema calefactor cuya función es
volatilizar la muestra.
Fundamentos de la separación cromatográfíca

29
Coeficiente de distribución (Kd)

Es la relación entre la concentración molar del soluto en la fase estacionaría y en la fase
móvil.
Kd = CE / CM
Cada sustancia tiene su coeficiente de distribución característico. Cuanto mayor sea el

coeficiente de distribución más se fija a la fase estacionaría.
Relación al frente del solvente (Rf)

Se utiliza en la cromatografía en soporte plano. Es la relación entre la distancia del
punto de aplicación a la mancha y del punto de aplicación al frente del solvente.
Rf = dm/ds
Sirve para identificar sustancias utilizando patrones y manteniendo constantes las

condiciones de trabajo. La relación al frente del solvente es característica de cada sustancia.
Volumen de retención o elución (Vr)

Cuando las sustancias son arrastradas fuera de la columna conseguimos su elución, el
volumen de retención es el volumen de elución en el cual sale un compuesto de interés.
Vr = V0 (1+Kd)
Vr: Volumen de retención.

V0: Volumen de exclusión. Es el volumen de la fase móvil requerido para eluir un compuesto
sin afinidad por la fase estacionaría, es decir, cuando Kd es igual a cero para este compuesto.
Vr = V0 (1+Kd) = V0 + V0 x Kd, luego Kd = Vr-V0 / V0
Cuanto mayor sea el coeficiente de distribución de un soluto mayor será su volumen de

retención.
Tiempo de retención (tr)

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Es el tiempo en el que el soluto sale eluido. Tiempo de retención y volumen de retención

están relacionados.
Vr = tr x F
F: Es la velocidad del flujo de la elución en ml por minuto.
El volumen de retención y el tiempo de retención, utilizando patrones de referencia y

trabajando en condiciones constantes, nos sirven para la identificación de sustancias.
Selectividad (α)
La selectividad describe la capacidad para separar dos solutos, es decir, la relación entre
sus coeficientes de distribución.
α = Kd sustancia B / Kd sustancia A
Se persigue que la selectividad sea lo mayor posible (>1).
Resolución (R)
Con la cromatografía pretendemos que las sustancias se separen lo mejor posible, a esta
capacidad del sistema para separar sustancias es lo que llamamos resolución.
En un registro de cromatografía en columna o cromatograma, nos aparecen picos sucesivos, cada
pico corresponde a una sustancia. Se miden las distancias a las que aparecen los picos desde el
momento de inyección de la muestra, también medimos el ancho de la base de cada pico. Las
distancias puede ser medidas como tiempo en el que aparece el máximo del pico, como
volúmenes de retención de la sustancia, o bien, como distancia en medidas de longitud. El ancho
de la base se tiene que medir en las mismas unidades que las distancias.
R = d2-d1 / ½ (a2+a1)
31
Se requiere un valor de R mayor de 1,25 para considerar una separación cromatografía

como buena, si es menor de 0,4 no se separan claramente los componentes.
En el caso de la cromatografía en papel también se puede calcular la resolución midiendo
su distancia desde el punto de aplicación y el diámetro de las manchas.
En el proceso cromatografíco hay que procurar que el ancho de los picos o el diámetro de
las manchas sean lo más pequeños posibles porque esto favorece la resolución.
Cálculos en el cromatograma en columna
Mecanismos de separación
Cromatografía de intercambio iónico (L/S)

En esta cromatografía la fase móvil es líquida y la estacionaría sólida. La fase sólida viene
empaquetada en columnas y la separación va a depender del signo y la magnitud de las cargas
eléctricas.
El intercambio iónico es un proceso en el cual un ión que está unido a un sólido poroso
insoluble se intercambia con otro ión presente en una solución que fluye a través del sólido. El
sólido poroso, fase estacionaría, es una resina. La resina es un polímero orgánico que contienen
grupos funcionales con carácter iónico. El tipo de grupo funcional dicta el tipo de intercambio
iónico que ocurre. Las resinas con grupos funcionales ácidos atraen cationes por lo que se las
conoce como resinas de intercambio catiónico. Por el contrario, resinas con grupos funcionales
básicos atraen a aniones por lo que se conocen como resinas de intercambio aniónico.
Cuando se produce el paso de la fase móvil y la muestra, sus iones compiten por los sitios
de unión de la fase estacionaría, aquellos con mayor fuerza de unión saldrán más tarde de la
columna. Podemos modificar la fuerza de unión de los iones a la fase estacionaría cambiando el
pH o la fuerza iónica de la fase móvil.
Este tipo de cromatografía se utiliza para separar iones inorgánicos, por ejemplo en la
purificación del agua, o para separar iones orgánicos, como aminoácidos con proteínas.
32
Cromatografía de exclusión molecular (L/S)

También se llama cromatografía de gel-filtración. Es una cromatografía con fase móvil
líquida y fase estacionaría sólida, en columna.
La separación depende de la diferencia del tamaño molecular de las sustancias a separar.
La fase estacionaría es un gel que presenta poros de un determinado tamaño. La fase móvil junto
con la muestra atraviesa la columna, las sustancias con mayor tamaño que el poro pasan sin ser
retenidas y las que tienen un tamaño menor son retenidas.
Se emplean muchos tipos de gel y se seleccionan dependiendo de la sustancia a separar,
uno de los más utilizados es el Sephadex.
Con esta técnica podemos averiguar pesos moleculares de sustancias o podemos separar
también inmunoglobulinas.
Cromatografía de adsorción
Es la variedad más antigua de cromatografía, puede ser el L/S o G/S.
La cromatografía G/S en columnas y la L/S tanto en capa fina como en columnas.
33
Está basada en las fuerzas de atracción electroestáticas, puentes de hidrógeno o fuerzas

dispersivas de Van der Waals. El fenómeno de adsorción es el resultado de la fuerza de
atracción de las moléculas de la muestra, del disolvente y de la fase estacionaría del adsorbente.
Al pasar la fase móvil a través del adsorbente las sustancias son retenidas según su grado
de atracción. Cuando toda la muestra ha pasado a través de adsorbente podemos, cambiando la
polaridad de la fase móvil, eluir las sustancias más retenidas. Una molécula polar es cuando en
ella predomina la carga positiva (protones) en una zona de la molécula y la carga negativa
(electrones) en la otra, por ejemplo el agua.
Cromatografía de partición
Los solutos se separan por la diferente solubilidad entre la fase móvil y la estacionaría,
puede ser una cromatografía el L/L o G/L.
La cromatografía L/L puede ser:
1) De partición en fase normal: el soporte es una sustancia polar y la fase móvil apolar. Las
moléculas de la muestra más polares son retenidas, mientras que las apolares salen eluidas en
primer lugar.
2) De partición en fase invertida: el soporte es una sustancia apolar y la fase móvil polar, por lo
que las moléculas polares no serán retenidas y las polares sí. La mayoría de la cromatografía
líquida de alta resolución (HPLC) es de este tipo.
La cromatografía G/L de partición es idéntica, la única diferencia es que la fase móvil
gaseosa es totalmente inerte, no participa.
Cromatografía de afinidad
Se basa en la afinidad entre dos elementos, cualquiera que sean, por ejemplo enzima -
sustrato, hormonas –receptor o antígeno –anticuerpo.
En la fase estacionaría se encuentra el llamado ligando (permite la unión), cuando pase la
fase móvil con la muestra las sustancias que presenten afinidad por el ligando quedarán retenidas.
Posteriormente, las podemos eluir adicionando otras sustancias con mayor afinidad por el ligando
o cambiando las condiciones físico-químicas de la fase móvil (pH…).
Refractometría.
Se denomina refractometría a la técnica que permite calcular el índice de refracción de
una muestra para conocer su composición o pureza. Los refractómetros son los instrumentos
empleados para determinar este índice de refracción. Los refractómetros se utilizan
fundamentalmente para medir líquidos.
¿Qué es la refracción?
Cuando se pone un lápiz en el agua, la punta del lápiz aparece

inclinada. Luego, si se hace lo mismo pero colocando el lápiz en una
solución de agua azucarada, la punta del mismo aparecerá más
inclinada. Este es el fenómeno de la refracción de la luz.
Los refractómetros
Los refractómetros son instrumentos de medición, en los que éste fenómeno de la

34
refracción de la luz se pone en práctica. Ellos se basan en el principio por el cual, cuando aumenta
la densidad de una sustancia (por ejemplo cuando se disuelve el azúcar en el agua) el indice de
refracción aumenta proporcionalmente.
Los refractómetros fueron inventados por Dr. Ernst Abbe a principios del siglo XX.
Existen dos tipos de refractómetros en función de los sistemas de detección del índice de
refracción: sistemas transparentes y sistemas de reflexión. Los refractometros portátiles y los
refractómetros Abbe usan los sistemas transparentes, mientras que los refractómetros digitales
usan los sistemas de reflexión.
a) Sistemas transparentes. Si la muestra es de baja concentración, el ángulo de refracción es
grande (vea "a") debido a la gran diferencia en el índice de refracción entre el prisma y la muestra.
Si la muestra es concentrada, el ángulo de refracción es pequeño (vea "b") debido a la pequeña
diferencia en el índice de refracción entre el prisma y la muestra.
b) Sistemas de reflexión. El haz de luz C incide en un ángulo demasiado grande para pasar a
través de la muestra y es totalmente reflejado hacia el lado bajo y derecho del prisma. Como
resultado se produce una línea límite que divide la luz y la sombra (línea punteada B’ en la figura).
El ángulo de reflexión de esta línea es proporcional al índice de refracción, la posición de la línea
límite entre la luz y la sombra es captada por un sensor y convertida en índices refractivos.
35
Osmometría.
Osmolaridad y osmolalidad
La osmolaridad es la medida que utilizamos para expresar la concentración de una

sustancia en una disolución. La unidad de medida es el osmol/litro y el osmol es una unidad de
presión osmótica.
La osmolaridad tiene un papel regulador en la distribución del agua entre los diferentes
compartimentos del organismo. El agua tiende a igualar osmolaridades, difunde de una zona de
concentración osmolar menor a otra de concentración mayor.
La osmolaridad del suero oscila entre 285 y 310 miliosmoles/L (mOsm/L) y se puede
calcular de forma aproximada con la siguiente fórmula:
mOsm/L del suero = 2(Na+ + K+) + Glucemia (mg/dl)/18 + Urea (mg/dl)/6
La única diferencia que hay entre la osmolaridad y la osmolalidad es que la concentración

se expresa en osmoles/Kg de agua en la osmolalidad y en osmoles/L en la osmolaridad.
La osmolalidad en orina entre 50-1400 mOsm/Kg. Podemos calcular la osmolalidad

teórica de la orina, que tiene un valor similar al de la osmolalidad real, mediante una fórmula:
Osmolalidad teórica de la orina = (Sodio urinario + Potasio urinario) + (Glucosa
urinaria/18) + (NUU/2,8)
36
Osmolalidad teórica de la orina: mOsm/kg

Sodio urinario: mEq/l
Potasio urinario: mEq/l
Glucosa urinaria: mg/100 ml
NUU (nitrógeno ureico urinario): mg/100 ml
Las podemos determinar mediante un aparato llamado osmómetro que mide el descenso
del punto de congelación de una solución. La sal modifica la osmolaridad de la solución porque
disminuye el punto de congelación.
Química seca.
Espectrofotómetro de reflectancia
Cuando un haz de luz incide sobre una superficie, la luz es reflejada por esta superficie,
produciéndose a la vez dos tipos de reflexión:
• Una reflexión especular, en donde la luz es reflejada como lo haría en un espejo.
• Una reflexión difusa (reflectancia), que consiste en la reflexión producida al penetrar la
luz en las capas internas de la superficie iluminada. Dentro de la fase solida, la luz sufre
una serie de fenómenos de absorción y dispersión. Este tipo de reflexión es de interés para
las mediciones que se realizan con las técnicas de química seca.
37
La fotometría de reflectancia implica la medida de la intensidad de la luz que es reflejada

por una fase sólida, tras iluminar ésta con un haz de luz de una longitud de onda que es absorbida
por los productos de interés. Los espectrofotómetros de reflexión miden la reflectancia y la
relacionan con la concentración del analito de interés.
Los componentes de un espectrofotómetro de reflectancia son:
a) Fuente de luz: se emplean dos tipos de lámparas, que pueden ser de haluro de tungsteno
o de xenón.
b) Sistemas ópticos: consisten en combinaciones de lentes, espejos y filtros.
c) Reactivos de fase sólida: aquí radica una de las diferencias fundamentales con la
fotometría de absorción. La muestra se sitúa en los reactivos de fase solida (tiras reactivas,
reactivos multicapa). Todos los componentes necesarios para que se produzca la reacción
se encuentran impregnados en estas unidades, en las que tiene lugar la reacción y la
lectura.
d) Detector y procesador de datos
e) Lectura: se puede hacer de dos formas
1. Lectura sobre la superficie: La muestra se aplica sobre la superficie del reactivo,
difunde y se produce la reacción. El color resultante se determina midiendo la
reflectancia sobre la superficie. Este método se emplea en los sistemas que utilizan
tiras reactivas.
2. Lectura por el reverso de la superficie: La muestra se aplica sobre la superficie del
reactivo, difunde y se produce la reacción. La lectura se hace por el reverso de la
superficie de la muestra. Este método se emplea en los sistemas que utilizan
reactivos multicapas o slides.
38
Reactivos en química seca
Los reactivos de química seca poseen en forma deshidratada, todos los componentes que
se necesitan para la identificación de un analito determinado. La muestra que contiene el analito
a determinar (suero, plasma, sangre total, orina) se aplica sobre la superficie del reactivo en fase
sólida, y a partir de esta difunde a la matriz, disolviendo los componentes de reacción que
contiene; cuando los reactivos se disuelven se produce la reacción, que se cuantificara por
fotometría de reflectancia.
Todos los sistemas constan de tres partes:
1. Soporte. Constituido por una lamina de plástico.
2. Parte reflectante. Su función es reflejar la luz; está hecha de materiales reflectantes
como metales, o materiales fibrosos como el papel.
3. Parte reactiva. Contiene, en forma deshidratada todos los reactivos y sustancias auxiliares
necesarias para que se produzca una reacción. Los reactivos son reconstituidos mediante
rehidratación por el agua de la muestra.
A veces se añaden otras capas con funciones complementarias como una capa difusora
(con lo cual la muestra difunde rápidamente hacia los laterales y se distribuye uniformemente) o
una capa separadora de plasma (la utilizan los sistemas preparados para trabajar con sangre total,
su función es retener las células y permitir el paso del plasma hacia la matriz del reactivo).
Los reactivos de fase sólida empleados en la química seca se engloban en dos tipos: las
tiras reactivas y las películas multicapa.
Tiras reactivas
Se utilizan para:
• Análisis de orina.
• Autocontrol de la glucemia.
• En sistemas de diagnóstico rápido en la consulta médica y a la cabecera del enfermo.
Consisten, básicamente en un plástico que sirve de soporte a una matriz de celulosa que
contiene los reactivos secos necesarios para que se produzca una reacción con el componente a
estudiar.
Tira reactiva del sistema Seralyzer (Ames): Consiste en una matriz de celulosa
impregnada de reactivos secos que se unen a una lamina soporte de plástico; sobre ella lleva una
franja código, que tiene como finalidad ser leída cuando se la inserta en el instrumento.
39
Tira reactiva del sistema Reflotron (Boheringer Mannheim): Consta de una lámina
soporte al cual se le adhiere el sistema reactivo separado en dos zonas:
• Una está unida a la lamina. Incluye una serie de capas destinadas a la preparación de la
muestra.
• La otra se encuentra inicialmente separada de la lámina soporte, y se pone en contacto
con ella por simple presión cuando se desea que el plasma entre en contacto con los
reactivos para desencadenar la reacción; esta zona lleva en su superficie una laminilla
transparente a través de la cual se realizará la lectura.
La disposición en dos bloques hace posible que la parte destinada a la preparación de la
muestra se puedan llevar a cabo etapas de preincubación o eliminación de interferentes.
Esta tira incorpora también una capa separadora de fibra de vidrio para la obtención de plasma,
con lo cual evitamos la centrifugación previa al análisis.
Las ventajas de las tiras son que al mantener los reactivos deshidratados aportan una
40
prolongada estabilidad al sistema, que puede ser de meses e incluso de uno o dos años.
Películas multicapa o slides

Están constituidas por diferentes capas
muy finas, a través de las cuales se van
produciendo todas las etapas necesarias para la
determinación cuantitativa del analito. Tiene la
apariencia de una diapositiva y está constituido
por cuatro capas (que incluyen todos los
componentes del sistema). El sistema de más
amplia implantación es el Ektachem (Kodak).
Las capas serían:
• Capa difusora: Sobre ella se deposita la
muestra. Lleva sustancias capaces de
reflejar la luz, es la superficie
reflectante. Homogeneíza la muestra
antes de que llegue a la capa reactiva,
distribuyéndola por toda la superficie.
Retiene células, cristales, pequeñas y
grandes moléculas, así la muestra se
convierte en un filtrado libre de proteínas, eliminándose las interferencias.
• Capa reactiva: Pueden ser una o varias, son las que contienen los reactivos.
• Capa soporte: está hecha de plástico transparente y sobre ella se depositan todas las demás
capas una tras otra. Tiene doble función: servir de soporte y dejar pasar la luz, ya que la
lectura se hace por la parte inferior (la opuesta a la de la aplicación de la muestra).
Instrumentos de medida en química seca para bioquímica sanguínea
Son tres los sistemas que se emplean actualmente. Dos de ellos trabajan con tiras
reactivas: Seralyzer y Reflotron; el tercero trabaja con slides o reactivos multicapa.
Seralyzer (Ames)
Emplea tiras reactivas. Tras aplicarle la muestra de suero se coloca la tira en una
plataforma termostatizada a 37º que se introduce en el aparato. Allí es irradiado por un haz de luz
que incide sobre la zona reactiva de la tira; allí se produce la reflexión. Los valores de reflectancia
son convertidos en valores de concentración.
41
Reflotron
Emplea tiras reactivas. Se puede trabajar con sangre total, suero o plasma; ya que
incorpora una capa separadora, que consigue la separación de los eritrocitos del plasma.
Después de aplicar la muestra, la tira reactiva se introduce en el aparato. El plasma pasa
al reservorio situado en la parte inferior de la tira; la reacción comienza cuando (por acción del
aparato) se presiona la capa reactiva sobre la capa reservorio del plasma.
La luz reflejada por la zona de reacción se recoge en un detector de medida, que convierte
los valores de reflectancia en valores de concentración.
Ektachem
Emplea los slides. Ofrecen medianos y grandes analizadores, cuya finalidad es ser
utilizados en el laboratorio clínico.
La muestra de suero se aplica en la superficie del slide por el autoanalizador, luego es
transferida a una cámara de incubación. La muestra se difunde a través de las capas,
produciéndose la reacción. La lectura se produce por irradiación que incide en la cara inferior del
slide. La luz reflejada es recogida por un detector.
42
Sistemas de análisis de orina

Los dos sistemas más difundidos para análisis de orina son: Sistema Clinitek y Sistema
Urotron. Ambos incluyen las tiras reactivas y los lectores de tira de orina.
Estructura de las tiras reactivas

Están formadas por:
• Un soporte (lamina de plástico blanca).
• Zonas de papel impregnando con los reactivos, que van fijados al soporte. Cada
zona reactiva tiene impregnados reactivos distintos, de manera que cada uno
tomara una coloración diferente cuya intensidad dependerá de la concentración
del componente en la orina.
Modo de empleo
1. Sumergir la tira reactiva en la orina
2. Eliminar el exceso de orina
3. Leer el resultado. Se puede hacer visualmente sobre una carta de colores o empleando un
espectrofotómetro de reflexión.
Sistema Clinitek
Se emplea la tira reactiva Multistix-10-SG.
Está preparada para la determinación de diez parámetros:
43
• Glucosa
• Bilirrubina
• Cuerpos cetónicos
• Densidad
• Sangre
• pH
• Proteínas
• Urobilinógeno
• Nitritos
• Leucocitos.
Esta tira aporta la ventaja de poder hacer la determinación de densidad de la orina sobre
una de las zonas reactivas.
Sistema Urotron
Se emplea la tira reactiva COMBUR-9-TEST.
Está preparada para la determinación de nueve parámetros:
• Glucosa
• Bilirrubina
• Cuerpos cetónicos
• Sangre
• pH
• Proteínas
• Urobilinógeno
• Nitritos
• Leucocitos.
Ventajas y desventajas de la química seca

Ventajas
• El usuario solo necesita aplicar la muestra al reactivo en fase sólida para iniciar el
análisis, que tiene lugar en unos minutos
• No se precisa preparación previa de los reactivos. Son únicos para cada parámetro y
desechables.
• Tienen larga estabilidad
• Son fáciles de almacenar.
Desventajas
• Su costo es más elevado que el de la química convencional
• No es práctico para laboratorios con gran carga de trabajo.
Equipos automáticos y manejo de la información

Introducción
La automatización en el laboratorio implica fundamentalmente un gran ahorro de

tiempo, una disminución en gastos de reactivos y evita muchos de los errores humanos que
44
pueden cometerse en el procesado de las muestras.

Los sistemas automatizados permiten, con una mínima manipulación, realizar el
procesado y análisis de la muestra, así como la emisión y valoración del resultado.
El procesado y análisis de una muestra pueden incluir numerosas etapas:
• Identificación de la muestra.
• Preparación de la muestra.
• Carga de la muestra en el sistema.
• Separación de componentes «indeseables».
• Dispensación de reactivos.
• Mezcla de reactivos y muestras.
• Incubación.
• Reacción.
• Detección del producto.
• Procesado de datos.
• Interpretación de resultados.
Dependiendo del tipo de análisis que se vaya a realizar se dispone de sistemas

automatizados que cubren total o parcialmente el proceso. En la automatización se procura que
la mecanización de cada una de estas etapas, y de ellas en conjunto, sea lo más completa posible,
siendo mínimas las operaciones que deben hacerse de modo manual.
Automatización en la identificación de las muestras
La identificación entre paciente-muestra se realiza en el momento de la

recepción/obtención de la misma, y debe mantenerse asegurada durante todo el proceso, hasta la
asignación de resultados. Los errores en este sentido, invalidan todo el resto del trabajo de
laboratorio.
En los sistemas automatizados se emplean dos sistemas de marcado: directo e indirecto.
1. Marcado directo: Une la muestra a un código o marcador que permite asociarla con el
paciente en cualquier momento. El sistema de marcado directo mas común, es el código
de barras, que permite el marcado electrónico de la muestra; Las etiquetas con el código
se suelen adherir al tubo de extracción o a los recipientes donde se colocan las muestras
para su análisis. El problema más común en este tipo de marcado es el de separación y
división de la muestra (generalmente suero) en alícuotas. Ello requiere la introducción de
marcas secundarias que pueden conducir a errores en la identificación. Actualmente se
soluciona con el empleo del tubo primario para todo el análisis; es decir, la realización del
proceso analítico sobre la muestra en el mismo tubo donde se depositó tras la
recepción/obtención, ya que se diseñan tanto los tubos cómo los aparatos para que ello
sea posible
2. Marcado indirecto: La muestra se relaciona con la posición que ocupa en una secuencia
analítica, y se relaciona con el paciente mediante una «lista de trabajo». En este caso
también se puede emplear el sistema de tubo primario, pero sin marcado directo,
asociando su identificación a la posición que ocupa en la lista de trabajo.
El grado de sofisticación del laboratorio (número de muestras/día) es normalmente, el que

lleva a adoptar un sistema determinado de trabajo.
Autoanalizadores para química clínica (bioquímica)

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Son sistemas que permiten detectar y cuantificar un gran número de biomoléculas en una
muestra clínica. Dependiendo del número de pruebas, el repertorio de las mismas, y el sistema
de análisis que empleen, existen en el mercado numerosos modelos de autoanalizadores
bioquímicos.
Tipos de Autoanalizadores.
Desde el comienzo de su empleo en química clínica, se han ido introduciendo muchos
conceptos y términos para definir y clasificar los autoanalizadores. De hecho resulta a veces
difícil porque se analizan desde distintos puntos de vista.
Algunos de los aspectos más importantes que se tienen en cuenta son:

1. El repertorio de pruebas. El término se refiere a las pruebas que puede llevar a cabo un
autoanalizador. Al estudiar este repertorio hay que diferenciar entre: El número de
pruebas totales que el analizador puede realizar (para las cuales está programado, y puede
llevar a cabo) y el número de pruebas que puede realizar de forma inmediata
(programarlas en una misma serie de análisis, sin necesidad de cambiar reactivos ni otras
condiciones del analizador). Ante la puesta en marcha de un autoanalizador, se persigue
que éste cargue con la mayor cantidad posible de trabajo del laboratorio; de manera que
los sistemas más altamente automatizados se dirigen a la ejecución de los análisis
realizados con más frecuencia, y aquellos sistemas menos automatizados se reservan a las
determinaciones menos frecuentes y solicitadas en menor cantidad.
2. El tiempo de retardo. Es el tiempo mínimo requerido para obtener un resultado después
del procesamiento inicial de la muestra (una vez que se ha pipeteado ésta). Algunos
instrumentos pueden dar resultados en muy poco tiempo, por ejemplo, para pruebas
simples como glucosa. En los aparatos en que se realizan varias determinaciones para una
muestra, el tiempo de retardo es mayor. El tiempo de retardo depende tanto de la
determinación solicitada (sustratos, enzimas...) como del número de determinaciones.
3. La capacidad. Es el número de muestras que pueden ser procesadas en una hora. La
capacidad se calcula de diferente manera según el tipo de autoanalizador. Este cálculo ha
de tener en cuenta el tiempo de retardo, es decir, el hecho de que no aparezcan resultados
hasta que no transcurra dicho tiempo.
Existen diversos tipos de autoanalizadores de química clínica que mostrarán distintas

capacidades, tiempo de retardo y repertorios de pruebas, según el sistema de funcionamiento y
las posibilidades de programación.
Dependiendo de su capacidad analítica tendremos:

1. Analizadores monocanal. Son instrumentos que realizan cada vez una sola determinación
sobre todas las muestras que se le presentan (de una en una). Para hacer otra
determinación, hay que cambiar reactivos y volver a colocar las muestras sobre las que
hay que realizar esta segunda determinación.
2. Analizadores multicanal. Son instrumentos que poseen varios canales de determinación,
de manera que cada muestra es sometida a un proceso de análisis múltiple. Se llama
también análisis multitest. Estos analizadores, pueden además ser selectivos, es decir, que
permiten seleccionar para cada paciente las pruebas que se deseen del repertorio total, sin
necesidad de ejecutar sobre una muestra todas las determinaciones de que es capaz el
analizador (también llamados analizadores de acceso al azar) (random access analysis)
por su capacidad de procesar diferentes combinaciones de pruebas para cada
46
muestra individual. Si el autoanalizador es capaz de llevar a cabo las distintas pruebas de

forma simultánea, se denomina analizador simultáneo. El tipo de prueba puede variar
ampliamente, pero por lo común se procesa sólo un número limitado de muestras por
análisis.
Por otra parte, dependiendo del sistema de mezcla de muestras y reactivos, los
analizadores pueden clasificarse en:
1. Analizadores
discretos. Son
instrumentos que
disponen de un
compartimento por
cada reacción de la
muestra. La mezcla
de reactivo y muestra
se produce en una
cubeta individual,
físicamente separada
de otras cubetas. La
lectura se puede
efectuar en la misma
cubeta de reacción, o
en otra cubeta
diferente a la cual se trasvasa la muestra. El reactivo y la muestra se depositan en la cubeta
de reacción por medio de agujas, que aspiran, impulsadas por jeringas las cantidades de
ambos que determina la programación de la técnica.
2. Analizadores de flujo continuo. Son instrumentos que bombean continuamente reactivos
a través de tuberías y serpentines para formar una corriente de flujo, bombeando después
la muestra a esta corriente de flujo de reactivo. El bombeo de reactivos y muestras se hace
mediante bombas peristálticas. La proporción entre muestra y reactivo viene determinada
por el control de las velocidades de bombeo de ambos.
3. Analizadores centrífugos. Son instrumentos que emplean la fuerza centrífuga para
mezclar la muestra y reactivos. Estos son cargados en compartimentos separados de un
rotor centrifugo. Cuando el rotor comienza a girar, la muestra y el reactivo son arrojados
contra la periferia del rotor, y se mezclan. Las muestras se mantienen separadas mediante
divisiones radiales. Un haz de luz atraviesa cada muestra a medida que esta rota sobre una
fuente luminosa, midiéndose su absorbancia.
Además, los analizadores de bioquímica pueden utilizar

diversos sistemas: para detectar y cuantificar el producto a analizar,
la mayor parte de ellos utiliza la fotometría de absorción para hacer
sus medidas. En los últimos años se han introducido autoanalizadores
que emplean otros procedimientos fotométricos: nefelometía,
turbidimetía, fluorimetría, fotometría de reflectancia, y técnicas
electroquímicas, sobre todo electrodos selectivos.
En conclusión, cuando se intenta definir un autoanalizador, se

emplean varios de los conceptos expuestos anteriormente, ya que
están basados en propiedades diferentes que a menudo se
47
superponen. Por ejemplo, el SMA es un autoanalizador de flujo continuo y multicanal, porque

posee varios canales para el análisis de muestra. El HITACHI 705 es un analizador discreto y
selectivo, porque puede seleccionar las determinaciones que se desean realizar sobre cada
muestra.
Contadores celulares
Son sistemas automatizados que permiten el recuento de elementos formes en un volumen

determinado de muestra. La aplicación fundamental es el recuento de células sanguíneas
(hematíes, leucocitos y plaquetas). En la mayoría de los casos trabajan con tubo primario,
absorbiendo la muestra de sangre total con anticoagulante y separando la población celular que
interesa por lisis del resto.
Existen fundamentalmente dos métodos:
• Luz dispersa: Un rayo de luz atraviesa una corriente de sangre diluida, los elementos
formes reflejan la luz que va a ser recogida por un tubo fotomultiplicador, que la convierte
en impulso eléctrico.
• Impedancia o resistencia eléctrica. Es el más utilizado. Las células atraviesan un orificio
por el que pasa una corriente eléctrica, provocando cambios en la resistencia eléctrica, los
impulsos eléctricos serán proporcionales al volumen celular.
Los sistemas de recuento celular automatizado pueden tener distintos niveles de

sofisticación, dependiendo sobre todo del grado de automatización de los distintos pasos del
proceso de análisis.
Coagulómetros
Son sistemas automatizados que permiten determinar parámetros relacionados con la

hemostasia. Estudian el sistema de coagulación y los diversos factores que en él influyen. Los
hay de dos tipos dependiendo del sistema de análisis del coagulo:
• Mecánicos: Detectan el momento de formación del coagulo por las interrupción del
movimiento de una pieza metálica.
• Turbidimétricos/colorimétricos: Detectan la formación del coagulo por turbidimetría
o espectrofotometría.
Sistemas automatizados en microbiología e inmunología
Fundamentalmente se trata de sistemas que mediante lecturas de turbidez y/o

espectrofotometría, extraen resultados relativos a crecimiento celular microbiano,
metabolización de compuestos o presencia/ausencia de aglutinación por formación de
inmunocomplejos. Las aplicaciones son diversas pero el fundamento es el mismo.
Generalmente se trabaja en placas multipocillo, donde tiene lugar, bien la reacción
inmunológica, bien el desarrollo microbiano. Los sistemas automatizados pueden disponer de
incubador donde tiene lugar la reacción o el desarrollo del microorganismo y, tras el tiempo
establecido, realizan las lecturas para cada pocillo con muestra, extrapolando los resultados con
cuantificación de los fenómenos estudiados (inhibición del crecimiento, metabolización de
compuestos, formación/inhibición de la aglutinación).
Sistemas automatizados para gasometrías
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Son sistemas automatizados que realizan determinaciones de gases en fluidos biológicos.

Fundamentalmente miden presión parcial de O2 y de CO2. También miden pH, y calculan el
exceso de base. La muestra más habitualmente procesada es sangre arterial total, aunque admiten
otras. El sistema de análisis es mediante electrodos selectivos.
Funcionamiento de los equipos
Procesamiento de datos
El autoanalizador de cualquiera de los tipos comentados, genera una señal analógica
(señal continua, por ejemplo amperaje) que es convertida en señal digital (señal discontinua,
combinación de 0 y 1, dígitos) por convertidores analógico-digitales. De esta forma, las señales
pueden ser procesadas por un computador digital, y mediante algoritmos varios convertirlas en
información útil, como los resultados, que son presentados en formatos que dependen de la
complejidad del programa del ordenador (impresora interna, impresora externa en papel
continuo, informes computerizados).
Los microprocesadores internos de los autoanalizadores cumplen funciones variadas:
ordenan el trabajo del analizador, monitorizan la salida de datos indicando alarmas de diverso
orden, llevan programas de control de calidad y estadísticos, etc.
En algunos sistemas, el analizador puede enviar los datos procesados al ordenador del
laboratorio, desde donde podrá emitirse el informe correspondiente de cada paciente.
Puesta en marcha de los sistemas automatizados

Para muchos de los equipos (automáticos o no) que se emplean en el laboratorio, la puesta
en marcha debe realizarse con cierto margen de tiempo antes de su utilización. En muchos casos,
para un correcto funcionamiento los sistemas deben alcanzar una determinada temperatura, pero
para la mayoría de los sistemas automáticos, existe además un programa de autoverificación o
chequeo, que el propio aparato realiza sobre sus mecanismos de funcionamiento. Tras el
encendido, el sistema analiza su estado y ofrece o no la opción de ser programado para trabajar.
En la mayoría de los casos, los autoanalizadores disponen de alarmas que, tras el encendido,
avisan de posibles disfunciones. Una vez que el analizador ha verificado sus sistemas, se procede
a programar el mismo para el trabajo que ha de realizar.
Programación
La programación es la introducción de información en el autoanalizador para el correcto
desarrollo del análisis. Cada aparato tiene su propio sistema de programación y será más
complejo cuantos más parámetros sea capaz de determinar. Dependiendo de la forma de trabajo
en un laboratorio, la programación de los sistemas automatizados se realizará de distinta forma.
En general podemos decir que será necesario introducir datos sobre:
• Muestras a analizar.
• Parámetros a determinar.
En analizadores multicanal selectivos, deberemos introducir las determinaciones a

realizar sobre cada una de las muestras que van a ser procesadas. En otros sistemas, será necesario
programar la lista de trabajo para cada una de las determinaciones a realizar.
Tras la programación e introducción de las muestras, el sistema iniciará el trabajo como
el usuario haya indicado.
Calibración
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Nada más instalar un instrumento analítico, de cualquier técnica, deberemos realizar sobre
él, de forma programada, por lo menos las siguientes actividades:
• Calibración: Operación que garantiza la exactitud de las determinaciones.
• Verificación: Observar que todo funcione correctamente.
• Mantenimiento: Operaciones para alargar la vida útil del aparato.
Se entiende por calibración el conjunto de operaciones que se realizan, de forma concreta,

a un instrumento analítico, o a cualquier equipo de medida, para que nos garantice la exactitud
de sus determinaciones. La calibración de los sistemas automatizados de laboratorio es
imprescindible para obtener resultados fiables. Consiste en comprobar la respuesta de un
instrumento analítico con un material de referencia o patrón de calibración, de propiedades
conocidas y si fuera necesario, aplicar un factor de corrección necesario para alcanzar el valor
correspondiente.
El resultado de una calibración permite detectar los errores de indicación del instrumento
de medida, del sistema de medida o de la medida materializada. Las medidas que se realizan en
los instrumentos analíticos presentan, en algunos casos, ciertos errores que pueden aumentar la
incertidumbre en los resultados analíticos que producen. Para evitar este problema, los
instrumentos analíticos precisan de un Plan de calibración.
Plan de calibración: El laboratorio definirá de entre los equipos de medida y ensayo que
maneja, aquellos que por su influencia en los resultados deban estar sujetos a calibración. Para
ello se implanta y mantiene un Plan de Calibración que definirá las actividades a realizar y su
periodicidad.
Procedimiento: La calibración de los equipos se realizará de acuerdo con instrucciones
escritas. En ocasiones vienen publicadas por organismos nacionales e internacionales, y con más
frecuencia, son suministradas por el fabricante. Periódicamente se realizará a los equipos las
medidas oportunas, con los materiales de referencia adecuados. El laboratorio recogerá los
resultados de las calibraciones que realice en un documento que contenga información suficiente
de la actividad realizada, por ejemplo, identificación del equipo calibrado, procedimiento de
calibración, identificación de patrones de calibración, condiciones ambientales, resultados,
incertidumbres, persona que realizó la calibración, etc.
Mantenimiento preventivo y correctivo

1.- Mantenimiento preventivo.
Es la función más importante del departamento de electromedicina, y en la cual tiene una
participación fundamental el técnico superior de Laboratorio.
La norma: “Es mejor prevenir que corregir”.
Se define como la actividad encaminada a reducir el desgaste y conservar los equipos en
buenas condiciones de funcionamiento par evitar los paros imprevistos por avería.
La eficacia del mantenimiento preventivo está a corto plazo en la reducción de averías
(coste económico y coste por parada); a largo plazo hace que se inviertan menos horas de servicio
técnico y ahorra materiales.
El mantenimiento preventivo se realiza a través de las revisiones preventivas; las cuales
se definen como un control periódico, sistemático y programado.
La labor del Técnico Especialista de Laboratorio en este área es fundamental y estaría
encaminada básicamente a:
• Mantenimiento preventivo primario: Mantenimiento preventivo de primera mano,
reflejando este trabajo en los libros de revisiones periódicas que se confeccionan
a partir de las hojas de revisión. Se aprovecha la revisión para
50
reparar pequeños daños. No es práctico mandar revisar un equipo a quien luego

tiene que repararlo. Es decir, si encargamos el mantenimiento preventivo a quien
luego debe reparar el aparato, podemos generar una manipulación inadecuada, por
exceso o por defecto, del sistema.
• Entretenimiento: Son atenciones periódicas, sistemáticas y programadas:
Limpiezas, reposición de los elementos que falten, sustitución de elementos que
pierden características (electrodo) y aquellos con fuerte desgaste.
2.- Mantenimiento correctivo.
Es aquel que se realiza cuando existe parada o daños importantes en el equipo.
Una buena prevención haría que apenas se tuvieran que emplear otros medios de
mantenimiento, pero en realidad todavía estamos muy lejos de este punto; por ello tenemos que
recurrir a las inspecciones correctivas. Esta inspección informa sobre:
• Alcance de la avería.
• Repercusiones de la avería.
• Urgencia de la reparación.
• Duración de la reparación.
• Interferencia con el servicio.
• La conveniencia de parar o no el equipo.
El mantenimiento correctivo requiere, y esto es fundamental, la orden de reparación (parte

de avería).
El registro del equipo en el laboratorio debe incluir:

Nombre del fabricante, modelo y número de serie
Ubicación del equipo dentro del laboratorio
Fecha de adquisición y puesta en servicio
Instrucciones de uso y mantenimiento (incluido el manual suministrado por
el fabricante) para el uso del personal del laboratorio
Informes de todas las calibraciones, fecha prevista de la próxima calibración y los criterios
de aceptación
Plan de mantenimiento y mantenimiento llevado a cabo hasta la fecha
Todo daño, mal funcionamiento, modificación o reparación del equipo
Actuaciones con el equipo del laboratorio

Instalación: Puesta en servicio
Calibración: Antes de su uso. Registrado en el “plan de calibración”
Mantenimiento: Registrado en el “plan de Preventivo: Periódicamente para prevenir
mantenimiento” fallos
Correctivo: Ante un mal funcionamiento
Control de calidad Interno: Dentro del laboratorio

Externo: Comparación de ensayos entre
laboratorios
La información que facilitamos en las siguientes tablas sobre mantenimiento y

verificación de equipos es meramente orientativa. La frecuencia dependerá sobre todo del uso
51
del equipo.
Mantenimiento de equipos
Tipo de aparato Requisitos Frecuencia sugerida
Incubadoras, refrigeradores, Limpiar las superficies Semestralmente
congeladores y estufas internas y desinfectar si es
necesario
Baños maría Vaciar, limpiar, desinfectar y Cada mes
rellenar
Centrífugas Limpiar y desinfectar Trimestralmente
Autoclaves Verificar visualmente la junta, Mensualmente
limpiar/drenar la cámara
Cabinas de seguridad y de flujo Revisión/cambio de filtros Anualmente

laminar
Microscopios Limpieza de objetivos Anualmente
pH-metro a) Limpiar el electrodo a) Con cada uso
b) Revisar/rellenar electrolito b) Cuando sea necesario
Destilador Limpiar y desincrustar Según sea necesario

Desionizador, unidad de Sustituir cartucho y membrana Según las recomendaciones
ósmosis inversa del fabricante
Jarra de anaerobiosis Limpiar/desinfectar Después de cada uso

Distribuidores de medios, Limpiar y desinfectar Con cada uso
equipos volumétricos, pipetas,
etc.
Balanzas a) Limpiar a) Con cada uso
b) Revisar b) Anualmente
Sembradores en espiral a) Revisar a) Anualmente
b) Descontaminar, limpiar y b) Con cada uso
esterilizar
Verificación de equipos
Tipo de aparato Requisitos Frecuencia sugerida
Equipos con temperatura a) Verificar la estabilidad y a) Inicialmente y
controlada (incubadoras, baños, uniformidad de la temperatura después de la reparación
estufas, refrigeradores y b) Verificar la temperatura b)Diariamente/con cada
congeladores) uso
Autoclaves a)Verificar la estabilidad/ a) Inicialmente y después

uniformidad de la temperatura de la reparación
b)Verificar la temperatura b) Con cada uso
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Cabinas de flujo laminar a) Verificar las características a) Inicialmente y después

técnicas de la reparación
b) Verificar la esterilidad b) Mensualmente
pH metros Ajuste de la respuesta utilizando Diariamente con cada uso
como mínimo 2 tampones
Balanzas Ajuste al cero y verificación con Diariamente con cada uso

la pesa de control
Destilador, desionizador y a) Conductividad a) Semanalmente

unidad de ósmosis inversa b) Contaminación microbiana b) Mensualmente
Diluidores a) Peso y volumen distribuido a) Diariamente
b) Verificar factor de dilución b) Mensualmente
Pipetas automáticas Verificar la precisión y exactitud Inicialmente y

del volumen distribuido periódicamente
dependiendo de la
frecuencia de uso
Contadores automáticos de Verificar frente al recuento Anualmente
colonias manual
Jarra de anaerobiosis Indicador anaeróbico Con cada uso
Manejo de la información en el laboratorio
Al principio los sistemas informáticos se utilizaban básicamente para la adquisición de

datos generados por los autoanalizadores, pero pronto se hizo evidente la extraordinaria
capacidad para gestionar, emitir y almacenar no sólo los datos generados por los
autoanalizadores, sino todos los datos del laboratorio.
Hoy en día existen sistemas informáticos conectados con los autoanalizadores capaces de
actuar como sistemas de información del laboratorio (S.I.L.), también llamados sistemas de
gestión de datos del laboratorio, con las siguientes funciones:
• Registro de peticiones.
• Preparación de listas de trabajo.
• Análisis y adquisición de datos.
• Validación.
• Emisión de informes.
• Archivo.
• Citación de pacientes.
• Control de calidad.
• Estadística.
Registro de peticiones
Es el proceso de introducción de los datos del volante en el ordenador. Se realiza:
1. A través del teclado.
2. Mediante lector de código de barras: todos o parte de los datos se incorporan al volante
mediante una etiqueta con código de barras. Su lectura mediante un lápiz óptico permite
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una introducción rápida y sin errores.

3. Conexión con ordenador central: Basta con introducir el número de historia clínica, y el
ordenador busca los datos que coinciden con dicho número y los incorpora a nuestra base
de datos.
Dentro de cada petición podemos distinguir tres partes:
1. Número de identificación: Es único para cada paciente. Es asignado por el personal de
laboratorio. En ocasiones, el propio sistema le añade una serie de dígitos, fecha del día,
número de historia central, para así diferenciar el mismo número en días sucesivos. La
numeración puede ser correlativa o no correlativa (cada grupo de números representa una
planta, una consulta…)
2. Datos demográficos: Incluye todos los datos administrativos del paciente y peticionario.
3. Peticiones: Serían los análisis solicitados. En los sistemas informáticos de laboratorio se
distinguen habitualmente cuatro conceptos distintos:
◦ Parámetro: cada dato o cálculo que requiere un resultado.
◦ Petición: cada analítica que se solicita.
◦ Perfil: permiten al médico solicitar y al laboratorio introducir en el sistema una serie
de peticiones con una sola pulsación. Normalmente se trata de un conjunto de
parámetros que se suelen pedir juntos (ej.: análisis de rutina para un preoperatorio;
analítica de control de embarazo, etc.).
◦ Área de trabajo: las peticiones se agrupan según áreas de trabajo o secciones del
laboratorio; esta agrupación condiciona la emisión de los resultados.
Listas de trabajo
Una vez que se han introducido el número de identificación, los datos demográficos y las
peticiones, el sistema procede a la distribución del trabajo; habitualmente hay que suministrarle
una instrucción para que los datos de entrada se distribuyan.
La distribución del trabajo tiene una pieza clave: las listas de trabajo. Son la expresión en
papel de la serie de pacientes que tienen solicitada una prueba. Toda prueba debe de tener una
lista de trabajo a la que pertenece.
Los datos que aparecen en una lista de trabajo son, como mínimo, el número de
identificación de los pacientes para las pruebas solicitadas. Algunos sistemas permiten que
diseñemos una lista con más datos, como nombre del paciente, etc. incluso en algunos puede
hacerse constar en la hoja el último resultado registrado de la prueba para ese paciente.
Los aparatos que con más frecuencia se conectan al sistema informático del laboratorio
son aquellos que generan un gran número de resultados: autoanalizadores de bioquímica,
contadores de hematología, analizadores de orina, etc.
Pruebas rutinarias y diferidas

Según el tiempo que se tarda en disponer del resultado de una prueba podemos distinguir:
7. Rutinarias: el resultado está disponible el mismo día.
8. Diferidas: son pruebas que no se realizan todos los días o que tardan varios días en
completarse. Estas son frecuentes en Microbiología. Las pruebas diferidas tienen un
tratamiento informático distinto: hay que definir si el sistema debe retener el resto de los
resultados hasta que esté disponible el de la prueba diferida o, por el contrario, se emite un
informe parcial de las pruebas diarias y el sistema sólo guarda como pendiente la prueba
diferida. En lo que concierne a las listas de trabajo, la que contiene dicha prueba no suele
estar incluida entre las listas que salen de forma automática, sino que sale cuando la
solicitamos, obteniendo entonces un listado que contiene la prueba diferida con todos los
54
pacientes a los que se le ha pedido desde el último día en que se solicitó la lista.
Validación
La validación es el acto de dar por buenos los resultados del sistema. Los sistemas
informáticos exigen la validación antes de permitir la emisión de los resultados.
Puede validarse:
d. Por técnicas o grupos de técnicas: El sistema nos muestra todos los datos disponibles para
la técnica o técnicas que nosotros indiquemos. Suele utilizarse cuando, por ejemplo, se
han detectado valores límite en el control de calidad. La visión global de los resultados
nos puede ayudar a dar por buenos o no los mismos.
e. Por pacientes. El sistema nos muestra todos los resultados del paciente, permitiéndonos
relacionar toda la información de que disponemos sobre dicho paciente.
Emisión
Una vez introducidos los resultados, y efectuada la validación de éstos, el sistema está
capacitado para emitir el informe.
La emisión consiste en la impresión en papel de los resultados parciales o totales de uno
o más pacientes.
La emisión puede agruparse por servicios, origen de la petición, etc., o bien realizarse en
orden correlativo respecto del número de identificación.
La emisión de los datos disponibles en un momento dado, antes de tener terminadas todas
las pruebas solicitadas a un paciente, se denomina preinforme. Esta es una posibilidad que
presentan la mayoría de los sistemas, y es muy útil en determinadas circunstancias.
Cierre del día y fichero histórico

El sistema distingue dos tipos de pacientes: los pendientes y los de archivo.
Todos los procesos de búsqueda, impresión de listas de trabajo, validación,
modificaciones y emisión en grupos se hacen con los pacientes pendientes. Una vez terminado el
análisis, el sistema mantiene los datos incluyéndolos con otros anteriores del paciente. Es lo que
se llama fichero histórico.
El proceso de pasar de fichero del día a fichero histórico puede realizarse de dos formas:
3. Algunos sistemas realizan el paso automáticamente, bien en el momento de la emisión del
resultado o bien con algún proceso asociado a él. Se entiende que el resultado emitido está
acabado y el expediente puede ser cerrado.
4. Otros sistemas realizan el paso en bloque mediante una instrucción concreta en el menú que
suele denominarse cierre del día.
El fichero histórico es consultado para:
• Comprobar datos anteriores del paciente.
• Elaborar informes acumulados.
• Realizar copias de resultados emitidos.
Ficheros auxiliares
Son una serie de ficheros que el sistema precisa para trabajar. Pueden ser de diferentes
tipos:
3. Fichero de determinaciones. Contiene todos los tipos de análisis que realiza el laboratorio.
4. Fichero de perfiles. Contiene todos los posibles.
5. Fichero de médicos.
6. Fichero de servicios.
7. Fichero de listas de trabajo.
55
8. Etc.
Estos ficheros normalmente se preparan al instalar el sistema informático por vez primera,
y sólo requieren alguna modificación de vez en cuando.
Estadística
Se refiere a la informatización de todos los datos con que trabaja el laboratorio. Permite
realizar estadísticas con diversas posibilidades; un buen sistema debería ser capaz de recoger las
siguientes:
• Número de muestras por origen, facultativo, tipo de paciente y diagnóstico.
• Número de determinaciones dentro de los límites normales.
• Número de unidades de trabajo de laboratorio utilizando algún sistema estandarizado de
medición que pondere la cantidad de trabajo por determinación.
• Estadística descriptiva de resultados por test.
• Número de peticiones de rutina y urgencia.
Permite tener datos periódicos sobre el funcionamiento del laboratorio, usuarios,
utilización por distintos servicios etc.
56

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ANÁLISIS BIOQUÍMICO LABORATORIO CLÍNICO CURSO 2018-2019

1.- Técnicas utilizadas en el laboratorio de bioquímica

1nm= 1mµ (milimicra) = 10Å (angstroms) = 10-9m

1Hz= 1 onda o ciclo/sg

Podemos relacionar la longitud de onda de la radiación y su frecuencia mediante la

La radiación electromagnética está formada por paquetes de energía llamados fotones y

h= constante de Plank= 6,62.10-34 J x s.

La diferencia entre las radiaciones electromagnéticas es su λ.

En las técnicas espectrofotométricas utilizamos la luz Uv y la luz visible.

(nm) REGIÓN COLOR ABSORBIDO COLOR

340-430 visible violeta amarillo-verdoso

Interacción entre la luz y la materia

Ao = sustancia absorbente en reposo

La medida de la luz absorbida por una solución es el fundamento de la

I (luz incidente) → solución coloreada (luz absorbida) → I1 (luz transmitida)

Definimos la transmitancia como la relación entre la luz incidente y la luz transmitida.

En la práctica lo que se emplea es el %T.

Pero en lugar de la transmitancia es más frecuente utilizar la absorbancia (A) o también

A = log 1/T la absorbancia es el logaritmo de la inversa de la transmitancia.

El espectrofotómetro lee la transmitancia y seguidamente la convierte en absorbancia

También podemos utilizar esta fórmula:

є = coeficiente de extinción molar (mol/l)

En la práctica cuanto mayor sea este coeficiente (a ó є) mayor es la sensibilidad del

El cociente Cs/As se denomina factor (F) y es constante, por lo que:

Un concepto muy importante en esta curva es la linealidad que se define como el

Según la disposición de sus componentes tenemos espectrofotómetros de haz simple y

Los espectrofotómetros de doble haz tienen la finalidad de compensar las variaciones de

b. Monocromadores. Se encuentran en los espectrofotómetros y consiguen longitudes

• Redes de difracción: son hendiduras paralelas situadas sobre un vidrio o una

Con los selectores de λ la luz obtenida no es verdaderamente monocromática sino

Ancho de banda: intervalo de longitudes de onda que pasan

6. Sistema de presentación de datos. Actualmente la lectura es digital. Además los

Los aparatos deben mantenerse limpios, libres de polvo, suciedad, líquidos

Desviaciones de la ley de Beer

Absorbancias Concentración (mg/dl)

Respuestas ejercicio 1 espectrofotometría:

Respuestas ejercicio 2 espectrofotometría:

En la fluorometría se mide la luz emitida por un fluorocromo, como la fluoresceína,

Siempre la energía de la luz emitida es menor que la de la luz incidente.

Hay dos tipos de aparatos, los fluorómetros y los espectrofluorómetros. La diferencia es

La ventaja más importante de este método con respecto a la espectrofotometría es su

El electrodo de pH presenta como electrodo específico un electrodo de vidrio y como

Para medir la presión parcial de anhídrido carbónico se utiliza habitualmente el electrodo

CO2 + H20 → CO3H- + H+

Habitualmente en la medida de la presión parcial de oxígeno se utiliza el electrodo de

Electrodos selectivos de iones

Permiten medir variaciones de potencial debidas a la concentración de un determinado

Mantenimiento de los electrodos

Átomo en estado fundamental + calor (llama) → Átomo en estado excitado (salto de

Es una técnica que se utiliza en la determinación de calcio, magnesio, cobre, cinc,

Átomo ionizado en solución + llama → Átomo en estado neutro ← absorción de luz a

Para la determinación de algunos metales como el plomo en vez de utilizar la llama se

Luz incidente → partícula en suspensión → luz dispersada.

ángulos que van de 15º a 90º. El aparato utilizado es el nefelómetro.

La electroforesis es una técnica de separación de partículas cargadas al hacerlas pasar

La partícula cargada y el campo eléctrico

F: Fuerza del campo eléctrico.

La fuerza que se opone al movimiento de la partícula es proporcional al tamaño y forma

Fr: Fuerza de resistencia.

La velocidad de migración por unidad de campo eléctrico se denomina movilidad

Factores que afectan a la migración de partículas

Esta es la ley de Ohm. El voltaje es directamente proporcional a la resistencia e intensidad

Cuando trabajamos con la cubeta de electroforesis podemos mantener constante el voltaje o