ANALISIS MICROBIOLOGICO COMPARATIVO ENTRE VERDURAS FRESCAS LAVADAS (BLANCO)

Y VERDURAS FRESCAS LAVADAS Y DESINFECTADAS (PRUEBA)

I. OBJETIVOS

 Determinar el efecto desinfectante del cloro (lejía) en las verduras frescas.

 Cuantificar el número de microorganismos aerobios mesófilos viables y coliformes totales en
las verduras frescas.
 Conocer los métodos para determinar mediante la técnica de inclusión en placa y número más
probable el número de microorganismos entre verduras lavadas y verduras lavadas y
desinfectadas.
 Interpretar adecuadamente los resultados de la cuenta en placa y sus implicaciones en la
calidad del alimento tanto para las verduras lavadas y verduras lavadas y desinfectadas.

II. FUNDAMENTO

El análisis de los alimentos está catalogado para determinar el efecto desinfectante del cloro (lejía) en
las verduras frescas por diversas técnicas y métodos ; entre estos métodos tenemos la numeración de
microorganismos aerobios mesófilos viables, el número de coliformes totales, la cual nos permite
determinar cuántos microorganismos contaminantes presenta un alimento sobre su superficie o en su
interior.

III. MARCO TEORICO

EFECTO DE LOS AGENTES QUIMICOS SOBRE EL DESARROLLO BACTERIANO

Tanto en los laboratorios como en industrias alimentarias es necesario a menudo tratar superficies
inertes (mesas, suelos, paredes, maquinaria) con desinfectantes, a ser posible con efecto microbicida.
Los materiales termosensibles que no se pueden esterilizar por calor se pueden esterilizar en frío
mediante ciertos agentes:

o Pequeños objetos se pueden esterilizar en peróxido de hidrógeno (agente oxidante).

o Las cámaras de cría de animales libres de gérmenes se esterilizan con ácido peracético, un
fuerte agente oxidante.

Los halógenos son agentes oxidantes muy potentes, y que tienen usos muy importantes:

o El yodo es un magnífico antiséptico de la piel (el mejor que se conoce)

o El cloro se presenta como cloro gaseoso (Cl2), hipocloritos y cloraminas. El efecto desinfectante
se debe a la liberación de cloro libre (Cl2); a su vez, el Cl2 reacciona con el agua para dar ácido
hipocloroso (ClOH), que a pH ácido o neutro es un oxidante fuerte.

1. Cloro gaseoso: a 1-3 ppm se usa en la cloración de aguas para bebida y de aguas de piscinas. Su 1
actividad se ve muy influida (mermada) por la presencia de materia orgánica; por ello, se suele
determinar la demanda de cloro del agua a tratar. Descontada dicha demanda, el cloro gaseoso

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 mata rápidamente (15-30 segundos) a sólo 1 ppm.

2. Soluciones de hipocloritos: hipocloritos de sodio, de calcio o de litio. A 200 ppm de cloro se

usan ampliamente, ya como líquidos (lejías), o en polvo, en industrias alimentarias y lácteas
(para desinfectar el equipamiento y maquinaria que ha de entrar en contacto con los alimentos
a procesar), en restaurantes, hoteles, hospitales, etc.

Microorganismos Aerobios Mesófilos Viables

El recuento total de bacterias en placa es un método útil para obtener una idea del grado de frescura o
pronta alteración de los alimentos, dependiendo dela cantidad de bacterias presentes. La mayoría de los
alimentos deben ser considerados como inadecuados para el consumo cuando contienen un gran
número de microorganismos, aun cuando estos microorganismos no sean conocidos como patógenos y
no hayan alterado de forma apreciable los caracteres organolépticos del alimento.

La presencia de microorganismos aerobios mesófilos en los alimentos puede ser relacionada

directamente con la manipulación, el estado de frescura o de descomposición del producto y
la temperatura de conservación del producto. Un número relativamente bajo de estas bacterias no es
sinónimo de buena calidad bacteriológica del alimento, ya que puede contener microorganismos
que producen enterotoxinas o son patógenos.

Existen dos requisitos principales que deben tener los alimentos para ser considerados de buena
calidad:

1. Que estén libres de microorganismos patógenos, o sea que posean buena calidad sanitaria; y

2. Que posean un bajo número de microorganismos alternantes, o sea que sean frescos.

La función del laboratorio de microbiología es investigar si se cumplen estos dos requisitos y los
métodos que se aplican generalmente son cuantitativos. Por esta razón, en esta primera práctica se
aprenderá a determinar el número total de microorganismos presentes en los alimentos frescos.

Preparación de diluciones decimales a partir de homogeneizados de alimentos:

Los microorganismos en los alimentos generalmente están distribuidos irregularmente y en el caso de

los alimentos sólidos se encuentran adheridos o aprisionados en el interior de los tejidos que hace difícil
su determinación. Para uniformizar los trabajos de laboratorio, primero es necesario preparar un
homogeneizado de alimento liberando a los microorganismos a un medio fluido y, luego,
desconcentrado en diluciones sucesivas hasta tener un numero tal que haga factible la determinación
por métodos de cultivo.

La forma más fácil de conseguir los homogeneizados de alimentos es haciendo uso de aparatos de
trituración, como licuadoras de gran velocidad, que con la ayuda de solución salina peptonada permiten
preparar diluciones decimales y mantener la relación cuantitativa de la concentración microbiana
presente en los alimentos.

Esta demás señalar que para realizar todos los trabajos de laboratorio concernientes al cultivo de
microorganismos se debe hacer uso de la “Técnica Estéril” o “Técnica Aséptica” consistente en prevenir 2
la contaminación. Por eso, se deben tener materiales y medios de cultivo estériles y personal adiestrado
para evitar errores de trabajo.

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Determinación del número total de microorganismos aerobios mesófilos viables

El número total de microorganismos aerobios mesófilos viables o también llamado “Recuento total” o
“Recuento en placa” es uno de los indicadores del grado de frescura de los alimentos que tiene mayor
utilidad para juzgar su calidad. Existen dos métodos comunes muy usados en la mayoría de laboratorios:

a. Método estándar de recuento en placa o siembra en profundidad; y

b. Método de extensión en superficie.

Ambos métodos dan resultados semejantes y su relación solo depende de las preferencias personales
del analista.

Coliformes totales

Son organismos coliformes aquellos capaces de crecimiento aeróbico ya sea 35 ó 37 ± 1°C en un medio
de cultivo líquido lactosado con producción de ácido y gas dentro de un periodo de 48 h.
El método de la NPM es un método robusto por lo que puede aplicarse en cualquier tipo de agua, aún
aquellos que contienen gran cantidad de materia orgánica.
Para la determinación del NMP de Coliformes Totales y Fecales en este tipo de aguas, es necesario
proceder a preparar diluciones decimales de la muestra, debido a que se espera que la concentración de
coliformes sea superior en éstas que en un agua potable.
Las bacterias coliformes comprenden a: E.coli y enterobacter aerógenes, ambos organismos son bacilos
cortos, gram negativos, fermentan la lactosa con producción de gas. La presencia de Echerichia coli, se
encuentra normalmente en el tracto gastrointestinal de los animales.
Los organismos coniformes son buenos indicadores de contaminación fecal del agua. Su empleo como
indicador de calidad higiénica de los alimentos se basa en la experiencia positiva adquirida en el agua lo
cual indica en este la polución o contaminación fecal. La presencia de materia fecal en los alimentos o en
el agua NO es ADMISIBLE, tanto si se aíslan o no los patógenos intestinales.

Para examinar la calidad higiénica de los alimentos a través de su contenido en determinados

microorganismos se utiliza indicadores como en este caso la numeración de coliformes adicionalmente
se realiza el recuento de microorganismos aerobios viables.

IV. PARTE EXPERIMENTAL

MATERIALES Y REACTIVOS

- Placas Petri, 9 tubos con caldo brila, pipetas.

- Pinzas, tijeras, vasos de licuadora, cuchillas.

- Balanza mecánica

- Incubadora a 37 °C.

- Solución salina peptonada 3

Muestra: cebolla china fresca

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PROCEDIMIENTO

BLANCO

1. Lavar la verdura fresca (cebolla china) que se va a estudiar.

2. Pesar 50g de cebolla china en un vaso de licuadora estéril y vacío.

3. Añadir 450mL de solución salina peptonada (SSP), para obtener la dilución 10-1

4. Homogenizar el alimento triturándolo por 2 minutos, comenzando con un bajo número de

revoluciones y aumentando gradualmente la velocidad hasta alcanzar el máximo número de
revoluciones.

5. Dejar reposar por 5 minutos hasta que se separe la espuma y se formen tres fases definidas.

6. Medir 1mL del líquido sobrenadante y llevarlo a un tubo con 9ml de SSP, para obtener la
dilución 10-2. Homogenizarlo bien absorbiendo y dejando caer repetidas veces con la misma
pipeta o agitando enérgicamente el tubo para mezclar la dilución.

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 7. Medir nuevamente 1ml de la dilución anterior y, llevarlo a un tubo con 9ml de SSP, para
obtener la dilución 10-3. Se mide nuevamente 1ml de la dilución anterior y, llevarlo a un tubo
con 9ml de SSP, para obtener la dilución 10-4.

8. Proceder a su homogenización.

SIEMBRAS

Método de inclusión en placa

1. Inocular 1 mL de la dilución correspondiente en cada placa Petri, mediante pipeta estéril, de

acuerdo a cada tubo de disolución correspondiente.
2. Adicionar a cada una de la placas Petri en un ángulo de 45°, 15mL del medio P.A.C (agar para
recuento en placa).
3. Para distribuir de manera homogénea, extender el inóculo haciendo movimientos giratorios de
manera circular o en “S” al medio de cultivo, hasta lograr la completa incorporación del inóculo
en el medio. Dejar enfriar.
4. Incubar las cajas en posición invertida durante el tiempo de 24h a 48h y a la temperatura de 37
°C.
Método del NMP/9 tubos
1. Pipetear 1ml de cada una de las diluciones del homogeneizado del alimento en tres tubos por
cada dilución en el medio de cultivo caldo brila, conteniendo en su interior tubos de
fermentación en forma invertida.

2. Incubar los tubos a 37 °C por 24 horas a 48 horas.

3. Pasadas las 48 horas, anotar los tubos que presenten producción de gas en las campanas
Durham (Prueba Presuntiva) de cada dilución.

4. Para obtener el NMP, proceder de la forma siguiente. Ver en cada una de las tres diluciones
seleccionadas el número de tubos que presenten gas. Buscar en la tabla del NMP y anotar el
NMP que corresponde al número de tubos positivos de cada dilución.
PRUEBA

1. Lavar la verdura fresca (cebolla china).

2. Preparar una solución de 50ppm de cloro activo a partir de un frasco de lejía comercial.

3. Agregar la verdura para desinfectar a la solución de 50 ppm de cloro. Dejar reposar por 30
minutos. Sacar y escurrir.

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 4. Realizar los demás procedimientos según la secuencia señalada.

V. RESULTADOS

RESULTADOS BLANCO

Método recuento total

PLACA N° COLONIAS UFC/g

10-4 370 3,7. 106
10-5 29 2,9. 106
10-6 9 0.9. 107

Placa 10-4 - 370 colonias - Placa 10-5 - 37 colonias - Placa 10-6 - 9colonias -
Formación de colonias grenado Formación de colonias Formación de colonias
grenado grenado

Método del NMP/9 tubos

DISOLUCION REACCION NMP/g

10-2 (+) >30% de gas >1100/g
10-3 (+) >30% de gas >1100/g
10-4 (+) >30% de gas >1100/g

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RESULTADOS PRUEBA

Método recuento total

PLACA N° COLONIAS UFC/g

10-3 108 1.08. 105
10-4 12 1,2 . 105
10-5 2 0,2. 106

Placa 10-3 - 108 colonias - Placa 10-4 - 12 colonias - Placa 10-5 - 2 colonias -
Formación de colonias grenado Formación de colonias Formación de colonias
grenado grenado

Método del NMP/9 tubos

DISOLUCION REACCION NMP/g

10-1 (+) >30% de gas 3
10-2 (-) >30% de gas 0 23 NMP/g
10-3 (-) >30% de gas 0

disolución 10-1 , disolución 10-2 Presencia de gas en las campanas

disolución 10-3 Durham, disolución 10-1

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CÁLCULOS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

CÁLCULOS E INTERPRETACIÓN DEL BLANCO

Solo en las placas con disolución 10-4 presenta 370 UFC, que se encuentra en el rango establecido de 30
-300 UFC.

Forma de cálculo:

10-4
1g-------1000mL 370 UFC ------ 0,0001g

X -------1mL X2 -------------1g

X = 0,0001g X2= 3,7. 106 UFC/g

Las microorganismo aerobios mesófilos viables en placa en agar triptona extracto de levadura incubadas
por 48h a 37 °C del alimento cebolla china fresca sin la adición de un agente químico (desinfectante-
cloro) es igual a 4.106 UFC / g.

CÁLCULOS E INTERPRETACIÓN DE LA PRUEBA

Solo en las placas con disolución 10-4 presenta 108 UFC, que se encuentra en el rango establecido de 30
-300 UFC.

Forma de cálculo:

10-3
1g-------1000mL 108 UFC ------ 0,001g

X -------1mL X2 -------------1g

X = 0,001g X2= 1.08. 105 UFC/g

Las microorganismo aerobios mesófilos viables incubadas por 48h a 37 °C del alimento cebolla china
fresca con la adición del desinfectante- cloro es igual a 1.105 UFC / g.

VI. DISCUSIONES

Según las norma sanitaria que establece los criterios microbiológicos de calidad sanitaria e inocuidad
para los alimentos y bebidas de consumo humano en el grupo de alimento frutas y hortalizas frescas
semiprocesadas (lavadas y desinfectadas); nos indica en su tabla referente que para el alimento cebolla
china presenta el agente microbiano aerobio mesófilos en un límite por g (104 - 106) por lo que resulta
interpretar el límite de UfC/g de la verdura sin la adición de un agente químico que es igual a 4.106 UFC
/ g lo cual se sobrepasa de límite máximo del rango, éste no es aceptado por la norma.
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VII. CONCLUSIONES

 Los resultados del presente estudio (blanco) dan una idea del alto riesgo para los consumidores
de contraer alguna enfermedad transmitida por este alimento, ya que al no adicionarle un
agente químico (desinfectante- cloro) se obtiene un resultado igual a 4.106 UFC / g que no
está permitido por la norma (límite/ g 104 - 106)
 Los resultados del estudio (prueba) dan una idea de ser aceptables para los consumidores y de
no causar alguna enfermedad transmitida por el alimento, ya que adicionarle el agente
químico (desinfectante- cloro) se obtiene un resultado igual a 1.105 UFC / g que se encuentra
en el rango del límite/g lo cual está permitido por la norma.
 Los resultados del estudio (blanco) indica que hubo formación de gas en todos los tubos de 10-2
10-3, 10-4 lo cual alcanza > 1100 NMP/g con lo que concluimos que la muestra al no ser
desinfectado se encontraba en una posición no es apto para el consumo.
 Los resultados del estudio (prueba) indica que hubo formación de gas en los tubos de 10 -1 lo
cual alcanza 23 NMP/g con lo que concluimos que la muestra al ser desinfectado con cloro
50ppm se encontraba apto para el consumo.
 Aprendimos a determinar los NMP, contando la cantidad de tubos con gas y observando en la
tabla.
 Es necesario homogenizar el alimento antes de realizar el experimento en sí ya que los
microorganismos de los alimentos sólidos se encuentran adheridos en el interior de los tejidos
y esto hace difícil su determinación.

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

 Mendo R. Manuel. (2003). Medios de cultivo en microbiología. Ediciones laborales S.R.L. Quinta
edición. Perú.

 George A. Wistreich, Max D. Lechtmam. (1989). Prácticas de laboratorio en microbiología.

Editorial Limusa, S.A de C.V. Segunda edición. México.

 William B. Sarles, Joe B. Wilson, William, C. Frazier. (1973). Microbiología general aplicada.
Editorial Salvat S.A. Primera edición. Madrid Barcelona.

 Norma sanitaria que establece los criterios microbiológicos de calidad sanitaria e inocuidad
para los alimentos y bebidas de consumo humano. NTS N°071 – MINSA/DIGESA –V.01.