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RECUENTO DE MICROORGANISMOS AEROBIOS MESFILOS

VIABLES
1. INTRODUCCIN:
La mayora de los alimentos industrializados (excepto, por ejemplo, los
productos fermentados) deben ser considerados como inadecuados
para el consumo cuando contienen un gran nmero de microorganismo
aun cuando las caractersticas del mismo no hayan sido alteradas
Recuentos altos indican que: Las materias primas contaminadas,
tratamientos sanitarios no satisfactorios. En productos perecederos
pueden

indicar

tambin

condiciones

inadecuadas

de

tiempo/temperatura.
La presencia de un nmero elevado de bacterias aerobias Mesfilos que
crecen bien a temperatura corporal o prximo a ella, pueden haberse
desarrollado microorganismos patgenos de origen humano o animal.
Algunas cepas bacterianas no consideradas como agentes de
enfermedades transmitidas por alimento pueden causar enfermedad a
un elevado nmero de clulas viables en los alimentos. Todas las
bacterias patgenas presentes en los alimentos son mesfilas y en
algunos casos contribuyen con su presencia a los recuentos en placas.
Cuando el alimento contiene 10 6 microorganismos por gramo sus
caractersticas organolpticas se ven alteradas, algunos ya son
inaceptables con 107 bacterias por gramo. En productos fermentados
(queso, embutidos, etc.) alcanzan niveles de 10 9/gramo, en contraste los
no fermentados ya tendran una alteracin muy avanzada. Las bacterias
mesfilas (las que crecen en placa de agar a 30-37C) se consideran
como organismos indicadores aunque representan una medida mucho
menos precisa y fiable del peligro de intoxicacin alimentaria que otros
indicadores. Los recuentos elevados de bacterias mesfilas en
productos crudos o no tratados, a menudo estn constituidos por la
microflora normal o quizs indican una alteracin insipiente del alimento
y no un peligro potencial para la salud del consumidor.
Es preciso advertir que el recuento de la flora aerobia mesfila tiene un
valor limitado en algunos casos:

En determinados tipos de alimentos (embutidos fermentados, col


cida, queso y otros derivados lcteos) es natural y deseable una
gran

multiplicacin

bacteriana,

con

una

fermentacin

maduracin paralela del alimento. En estos productos, un


recuento elevado carece prcticamente de significado, ya que los
microorganismos

impropios

no

pueden

diferenciarse

generalmente de la microflora propia o normal.


En los alimentos tratados por el calor, la poblacin de
microorganismos viables suele ser muy baja, aunque un examen
microscpico de estos productos puede a veces poner de
manifiesto la presencia de microorganismos muertos, cuyo

nmero indica que la materia prima estaba muy contaminada.


Del mismo modo, en los alimentos deshidratados y en los
congelados, siempre se obtienen recuentos de bacterias viables
ms bajos. As, un recuento en placa puede no reflejar la calidad
bacteriolgica de la materia prima antes de los procesos o
tratamientos correspondientes, y por ello, es necesario llevar a
cabo un examen microscpico directo para comprobar si,
efectivamente, en un principio existan o no abundantes

grmenes.
Los recuentos de bacterias mesfilas son de escaso valor a la
hora de predecir la vida til de un alimento conservado en
refrigeracin, ya que muchos microorganismos mesfilos no
crecen a temperaturas por debajo de los 5C. Para esta finalidad
es preferible el recuento de bacterias viables psicrotrficas con

temperaturas de incubacin entre 0 y 5 C durante 10 das.


El recuento en placa es el mtodo ms utilizado para la determinacin
del nmero de clulas viables o unidades formadoras de colonias (u.f.c.)
en un alimento. Los recuentos totales deben hacerse en funcin de uno
de los siguientes factores:

Mtodo de muestreo utilizado.


Distribucin de los microorganismos en la muestra.
Naturaleza de la microflora del alimento.
Naturaleza del alimento.
Antecedentes del alimento.

Adecuacin nutricional del medio de cultivo.


Temperatura y medio de incubacin.
pH, aw, potencial de oxidacin reduccin del medio.
Tipo de diluyente utilizado.
Nmero relativo de microorganismos en la muestra.
Los recuentos de microorganismos viables se basan en el nmero de
colonias que se desarrollan en placas previamente inoculadas con una
cantidad conocida de alimento e incubadas en unas condiciones
ambientales determinadas.
Estos recuentos no pueden considerarse como recuentos totales ya que
solo son susceptibles del contaje aquellos microorganismos capaces de
crecer en las condiciones establecidas.
Se puede conseguir una amplia gama de condiciones variando la
temperatura, la atmsfera, la composicin del medio y el tiempo de
incubacin.
En funcin de esto se encuadra a los microorganismos en tres grupos:
Los que crecen bien a 7 C o por debajo de esta temperatura

cuya temperatura: psicrtofos.


Los que crecen entre 20 30 C, con una temperatura ptima de

crecimiento est entre 30 40 C: mesfilos.


Los que crecen por encima de los 45 C: termfilos
Recuento de aerobios mesfilos:
En este grupo se incluyen todas las bacterias, mohos y levaduras
capaces de desarrollarse a 30 C en las condiciones establecidas. En
este recuento se estima la microflora total sin especificar tipos de
microorganismos. Refleja la calidad sanitaria de un alimento, las
condiciones de manipulacin, las condiciones higinicas de la materia
prima. Un recuento bajo de aerobios mesfilos no implica o no asegura
la ausencia de patgenos o sus toxinas, de la misma manera un
recuento elevado no significa presencia de flora patgena.
2. OBJETIVOS:
Determinar el nmero de Microorganismos aerobios mesfilos
viables por el mtodo de recuento convencional en placa segn la
ICMSF, presentes en una muestra de refresco.
3. METODOLOGA:
3.1. Mtodo 1: Recuento Estndar en Placa, Recuento en Placa
por Siembra en todo el Medio o Recuento en Placa de
Microorganismos Aerobios.
Hartman y Huntsberger, 1961; Angelotti, 1964.

3.1.1. Materiales y Aparatos:


Agua peptonada para disolucin (Straka y Stokes, 1957):
Disolver 1 g de peptona en 1 litro de agua destilada y
ajustar a pH 7, distribuir en frascos de diluciones o en
tubos de volmenes predeterminados, autoclavar (121

C durante 15 min.).
Placas Petri de vidrio (100 x 15).
Pipetas bacteriolgicas de 1, 5 y 10 ml.
Estufa.
Estufa de incubacin.
Contador de colonias (modelo Quebec de campo oscuro
o equivalente).
Agar para recuento en placa
Formula:
Triptona
5g
Glucosa
1g
Extracto de levadura
2,5 g
Agar
15 g
Aadir los ingredientes en 1 litro de agua destilada,
calentar en ebullicin agitando hasta obtener la completa
dilucin, dejar enfriar a 45-60 C, autoclavar a 121 C
por 15 min. Este medio existe en el mercado en forma
deshidratada, reconstituido en la forma indicada en el

envase.
3.1.2. Tcnica:
Preparar la muestra del alimento por los mtodos de
dilucin, agua peptonada.
Aproximadamente se aadir en un matraz de 500 ml
225 ml de agua peptonada estril, posteriormente

aforar con 25 ml de la muestra, homogenizar.


Pipetear por duplicado, en placas Petri, alcuotas de 1
ml de las diluciones 10-1, 10-2 y 10-3; lo que supone la

siembra por placa de 10-1 a 10-3 g de alimento.


Fundir el agar para el recuento, templar el medio a 4446 C y controlar cuidadosamente su temperatura para
que al mezclarlo con la dilucin del alimento no sean

inactivados lo grmenes. Verter a las palcas Petri.


Acto seguido, mezclar el inoculo con el medio fundido,
inclinando y girando las placas.

3.2.

Una vez solidificado el agar, invertir las placas

incubarlas a 29-31 C durante 48 horas.


Calcular el recuento estndar en placa o el recuento

estndar en placa estimado.


Mtodo 2: Recuento en Placa de Siembra por Extensin en
Superficie.
Reed y Reed, 1948; J.J.R. Campbell y Konowalchuk, 1948; Gaud
y col., 1963; D.S. Clark Clark, 1967.
3.2.1. Materiales y Aparatos:
Agua peptonada para dilucin.
Agar para recuento en placa.
Placas Petri de vidrio (100 x 15).
Pipetas bacteriolgicas de 1, 5 y 10 ml.
Asas de Digralsky.
Estufa.
Estufa de incubacin.
Contador de colonias (modelo Quebec de campo
oscuro o equivalente).
3.2.2. Tcnica:
Fundir el Agar para Recuento en Placa (45-60C), y
aadir a cada placa Petri 15 ml del medio (2 placas

por dilucin).
Preparacin de la muestra y diluciones (se usarn
diluciones ms altas si se sospecha que la muestra

est muy contaminada).


Tomar dos alcuotas de 0.1 ml de cada dilucin y
depositarla en la superficie del medio contenido en

dos placas Petri.


Extender las alcuotas con ayuda del asa de

Drigalsky
Incubar las placas Petri invertidas durante 3 das a

29-31C.
Realizar el conteo de colonias escogiendo dos

placas, correspondientes a una dilucin.


Proceder a calcular el recuento estndar en placa.

4. CLCULOS:
4.1. Clculo del Recuento Estndar en Placa:
Si las placas escogidas de cierta dilucin tienen 30 y 300
colonias.
Se cuentan todas las colonias de cada placa.

Se halla la media aritmtica de los dos valores y


multiplicarla por el factor de dilucin (inversa de la
dilucin).
Dar el valor obtenido como el recuento estndar en

placa.
Si una de las placas de la dilucin escogida presenta algo
menos de 30 colonias o algo ms de 300.
Contar todas las colonias y proceder como en el caso

anterior.
Si las placas de dos diluciones consecutivas presentan
entre 30 y 300 colonias.
Deben hallarse el recuento en placa de todas las
colonias de cada dilucin.
El resultado ser la media de los dos valores, a no
ser que uno de ellos sea superior al doble del otro.
En ese caso se dar como recuento estndar en

placa el valor ms bajo.


Si ninguna placa tiene entre 30 y 300 colonias, el valor se
da como recuento estndar en placa estimado.
Si todas las placas presentan ms de 300 colonias.
Dividir las dos placas correspondientes a la dilucin
ms elevada, en secciones radiales (2, 6, 8).
Contar todas las colonias que se hallan en una o
ms secciones.
Multiplicar el total de colonias obtenidas en cada
caso por el factor adecuado (segn el nmero de
secciones).
Hallar la media del valor estimado por las dos placas
y

multiplicar

por

el

factor

de

dilucin

correspondiente.
Dar el valor obtenido como el recuento estndar en
4.2.

placa estimado.
Clculo del Recuento Estndar en Placa Estimado:
Si todas las placas presentan ms de 300 colonias.
Dividir las dos placas correspondientes a la dilucin
ms elevada, en secciones radiales (2, 6, 8).
Contar todas las colonias que se hallan en una o
ms secciones.

Multiplicar el total de colonias obtenidas en cada


caso por el factor adecuado (segn el nmero de
secciones).
Hallar la media del valor estimado por las dos placas
y multiplicar por el factor de dilucin correspondiente
Dar el valor obtenido como el recuento estndar en

placa estimado.
Si en las placas inoculadas con la dilucin menos
concentrada se encuentran ms de 200 colonias en una
seccin correspondiente a la octava parte de la placa
Multiplicar 1, 600 por el factor de dilucin
Expresar el recuento estndar en placa estimado

como superior (<) al valor obtenido.


Aconsejable es sealar entre parntesis la dilucin usada.
Cuando no se encuentra colonias en placas de la dilucin
ms concentrada
Expresar el recuento estndar en placa estimado
como inferior a (>) 1 multiplicado por el factor de
la dilucin ms concentrado.

4.3.

Clculo y presentacin de los resultados:


Se deben utilizar nicamente 2 cifras significativas.
Correspondiente al primer y segundo

dgito

(empezando por la izquierda).


Los restantes se reemplazan por ceros.
Si el tercer dgito (empezando por la izquierda) es 5
o superior, se aumenta en una unidad al segundo
dgito

4.4.

Presencia de Colonias de Crecimiento Difusivo en Superficie


Si este crecimiento no supera la mitad de la placa.

4.5.

Contar las colonias fuera de esta zona.


Corregir la cifra obtenida teniendo en cuenta el rea que no

se a podido contar.
Siempre que la zona ocupada por este tipo de colonias

ocupe ms de un cuarto de la placa.


Hay que registrar su presencia.
Presentacin e Interpretacin de los Resultados:
Los resultados deben darse en como:
Recuento estndar en placa o recuento estndar en placa
estimado por gramo o por mililitro de alimento, segn

corresponda.
Para decidir si una partida de alimentos se acepta o se
rechaza, debe tenerse en consideracin nicamente:
El recuento estndar en placa y nunca el recuento

4.6.

estndar en placa estimado


Diferencias Respecto al Recuento en Placa de la FDA, 2001:
El intervalo adecuado, segn la FDA, para el recuento en

placa es de 25 a 250.
Usan la siguiente frmula para sus clculos.
Casos:
Placas Normales (25-250):
Seleccione placa(s) libre de esparcimiento. Cuente
todas las unidades formadoras de colonia (UFC).
Placas con ms de 250 colonias:
Cuando la cantidad de UFC por placa excede a 250,
para todas las diluciones, registre los recuentos
como demasiado numeroso para el conteo.
Placas con menos de 25 colonias:
Registrar el conteo como menos de 25 1/d cuando
d es el factor de dilucin para la dilucin de la que
se obtuvieron los primeros recuentos.
Placas sin UFC:
Cuando las placas de todas las diluciones no tienen
colonias, reportar el APC como menos de 1 vez la
correspondiente dilucin ms baja utilizada.
Todas las placas con crecimiento difusivo
(esparcimientos) y/o accidentes de laboratorio.
Reportar respectivamente como:
Propagacin (SPR).
Accidente de Laboratorio (AL).

Clculo y Registro de los Recuentos:


Redondear subiendo el segundo dgito hasta el
siguiente nmero ms alto cuando el tercer dgito
sea 6, 7, 8, 9.
Usar ceros para cada dgito sucesivo hacia la
derecha del segundo dgito.
Redondee hacia abajo cuando el tercer dgito sea 1,
2, 3, 4.
Cuando el tercer dgito sea 5, redondee hacia arriba
cuando el segundo dgito sea impar y redondee
hacia abajo si fuera par.