UNIVERSIDAD DE LOS LLANOS

______________________________________________________________________________
__ LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

PRACTICA N°3. ANALISIS MICROBIOLOGICO EN ALIMENTOS.

_______________________________________________________

_________________________

Javier Argoty Ortegón1; Alexis Devia2; Cristian Rueda3

1. Código: 117004103
2. Código: 117004115
3. Código: 117003833
Facultad de Ciencias Agropecuarias y Recursos Naturales Universidad de los
Llanos. Sede Barcelona. Villavicencio, Meta, Colombia.
Email: javier.argoty@unillanos.edu.co
________________________________________________________________________________

Resumen:
La presente práctica tuvo como objetivo determinar la calidad microbiológica de
los alimentos (muestra de queso) aplicando métodos y técnicas analíticas tales
como: método de recuento en placa, método del número más probable. Por ello
se realizó un análisis sobre los diversos microorganismos indicadores que
puedan existir en dicha muestra (aerobios mesofilos, coliformes totales, mohos
y levaduras). En agua peptona se homogenizo la muestra para luego realizar
diluciones hasta 10-4 y con las diluciones específicas para cada agar se vertieron
en: agar nutritivo, agar sabouraud, Baird Parker, PDA realizando un análisis
duplicado con cada dilución y para el método del número más probable se
utilizaron 9 tubos de ensayo con caldo de LMX fluorocult vertiendo diluciones 10-
1
, 10-2 y 10-3 tres tubos para cada una. Para que la práctica sea idónea la muestra
debe cumplir con todos los parámetros de inocuidad y así evitar nuevos
microorganismos que afecten los resultados. Parámetros que quizás algunos
compañeros no tuvieron presente y que intervinieron en nuestros resultados.
Palabras claves: Microorganismos indicadores, Aerobios mesofilos, coliformes
totales, mohos y levadura.

I. Introducción
El análisis microbiológico tiene la
finalidad de conocer la Calidad
Sanitaria: para prevenir la
descomposición temprana de los
alimentos, liberación de lotes de
ingredientes y de producción,
comercialización, para la verificación
de las especificaciones establecidas
por Regulación Sanitaria, para la
preservación de la Salud. Las
determinaciones analíticas
empleadas son de tipo cualitativo y
cuantitativo (presencia y informe de que existe un 95% de
determinación numérica de
microorganismos respectivamente)
dependiendo del tipo de alimento y
especificaciones sanitarias. [1]
El recuento en placa es uno de los
métodos más utilizados para
determinar cuál es el número de
microorganismos viables en un
medio líquido. Cuando la
concentración es baja se procede a
filtrarla muestra a través de una
membrana que será pasada al medio
de cultivo, en una placa de Petri. [1]
El método del número más probable
(NMP) se aplica para recuento de
coliformes, coliformes fecales y de
cepas gasógenas (aerógenas) de
Escherichia coli. El método no sirve
para aislar ni contar serotipos de E.
coli asociados a enfermedades
humanas, Tales cepas no dan
positiva la reacción de los coliformes
fecales y por tanto ni pueden
detectarse ni contarse con este
método. [2]
Esta estimación estadística se basa
en el hecho de que cuanto mayor sea
el número de bacterias en una
muestra mayor será la dilución
necesaria para reducir la densidad
hasta el punto en el cual no se
desarrolle ninguna bacteria en los
tubos de una serie de diluciones. El
método del NMP es el más útil
cuando los microorganismos por
contar no crecen en medios sólidos
(como las bacterias quimicautótrofas
nitrificantes). También es útil cuando
se utiliza el crecimiento en un medio
liquido diferencial para identificar el
microorganismo (como en el caso de
las bacterias coliformes, que
fermentan selectivamente te la
lactosa con producción de ácido en el
análisis del agua). EI NMP es sólo un
probabilidades de que la población
bacteriana disminuya dentro de
ciertos límites y de que el NMP es el
número estadísticamente más
probable. [3]
El recuento de aerobios mesofilos
son todas aquellas bacterias
aerobias, mesófilas capaces de
crecer en agar nutritivo. Se
investigan por el método de recuento
en placa con siembra en
profundidad, que se basa en contar
el número de colonias desarrolladas
en una placa de medio de cultivo
sólido (Agar para recuento en placa
o PCA), donde se ha sembrado un
volumen conocido de la solución
madre o sus diluciones (1 ml),
incubadas a 37° C durante 24 hs. [4]
Los mohos y las levaduras tienen
algunas características similares a
las bacterias cuando contaminan los
alimentos tales como capacidad de
alteración, producción de
metabolitos tóxicos y aún la
utilización de algunas especies para
la producción de alimentos como
quesos, pero difieren en varias
propiedades metabólicas como la
capacidad de crecer a un bajo Aw,
tolerancia a los cambios de pH y a
bajas temperaturas. [5]
Los alimentos, al igual que el agua,
Pipeta de
no son, en general, productos
1ml
estériles. En el caso del agua, sobre
todo en el caso del agua potable, III. Metodología
además de presentar una baja carga
microbiana, determinadas especies Para la práctica se recolecto
microbianas deben estar ausentes. asépticamente 11g de la muestra
En el caso de los alimentos, la carga (queso doble crema) la cual es lleva
microbiana varía dependiendo del a la licuadora para que sea
tipo de alimento. La calidad homogenizada y lograr transferirla al
microbiológica del agua y de los frasco con 99 mL de diluyente (agua
productos alimentarios hace peptona al 0.1%), para obtener la
referencia a dos aspectos primera dilución 10-1, se Agitó
fundamentales: la calidad higiénico- vigorosamente; después se preparó
sanitaria y la calidad comercial. [5] la dilución 10-2 transfiriendo 1 mL de
la dilución 10-1, con una de las
II. Materiales pipetas estériles disponibles a un
tubo que contenga 9 mL de agua
Tabla N°1. Materiales y reactivos
peptona. Se agitó nuevamente,
utilizados en la práctica.
luego se preparó la dilución 10-3 se
EQUIPOS MATERIALES REACTIVOS transfirió 1 mL de la dilución 10-2,
Y MEDIOS
DE
con una pipeta estéril a un tubo que
CULTIVO contenga 9 mL de agua peptona. Se
volvió agitar cuidadosamente. El
Licuadora Muestra de 100ml de
queso 11g agar SPC
procedimiento se repitió hasta
estéril
obtener el número de diluciones
Cuchillo 5 pipetas 100ml de necesarias que es 10-4.
Pasteur 1ml agar
Sabouraud Cuando se obtiene las diluciones
necesarias, se lleva a las cajas de
Balanza 1
Erlenmeyer
Petri cada una de las muestras
electrónica
con 99ml de dependiendo de los siguientes
agua parámetros:
peptona
Aerobios mesófilos: se transfiere por
Incubadora 3 tubos con duplicado, alícuotas de 1 mL de dos
9ml de agua
peptona diluciones consecutivas en cajas
estériles. Para luego verter agar SPC
4 cajas agar fundido, mezclar el inóculo con el
Baird Parker
medio con movimientos suaves,
9 tubos luego se deja solidificar e incubar.
con 9mL
de caldo
Para los Mohos y levadura se
LMX Transfirió por duplicado, alícuotas de
1 mL de dos diluciones consecutivas
Perlas de en cajas estériles. Luego Vertió agar
vidrio Sabouraud fundido, mezclar el
Gradilla inóculo con el medio con
movimientos suaves, dejar solidificar
e incubar.
Staphylococcus aureus se Transfiere
por duplicado, alícuotas de 0,1 mL de
dos diluciones consecutivas en cajas
con agar Baird Parker, esparce el
inóculo sobre la superficie del agar
con las perlas estériles e incubar.
Para finalizar los Coliformes totales y
Escherichia coli se Transfirió 1 mL de
cada una de tres diluciones
consecutivas a tubos con caldo LMX
fluorocult (tres tubos por cada
dilución). Incubar para luego ser
examinadas con luz UV. Figure 1. Siembra en profundidad de
aerobios mesófilos en agar SPC
IV. Resultados.
fundido.
A continuación, se evidencia los
resultados obtenidos en la práctica Caja con dilución 10-4: 65 × 104 =
“generalidades del análisis 650000 UFC/gr
microbiológico de alimentos” con  Mohos y Levaduras
base a esta información se explica el
porqué de dichos resultados y que
factores influyeron en la variación de
los datos recolectados, también se
obtuvo el conocimiento del número
de colonias por cada caja de Petri
según el agar utilizado; para así
lograr determinar la calidad de la
muestra (queso doble crema) de
acuerdo con la normativa.
Como los procedimientos fueron
realizados dos veces por separado se
reportan los datos obtenidos de las
repeticiones que se les logro hacer el
recuento.
 Aerobios mesofilos Figure 2. Siembra a profundidad de
Mohos y levaduras en agar Sabouraud
fundido

Caja con dilución 10-3: 93 x 103 =

93000 UFC/gr
  Staphylococcus aureus

Figure 3.Siembra en superficie de

Staphylococcus aureus en agar Baird
Parker

Caja con dilución 10-3: 411 x 104 =

4110000 UFC/gr

Para el conteo de esta siembra se

multiplicó por un factor decimal más
Figure 5. TABLA DEL
a la dilución aplicada, debido a que
NMP PARA AGUAS Y
la cantidad de muestra inoculada
ALIMENTOS. [5]
fue de 0,1 ml.

 Coliformes totales y
Coliformes fecales

Coliformes totales:
1100 × 102
= 1100 𝑁𝑀𝑃/𝑔𝑟
100
Coliformes fecales:
Figure 4. Análisis de coliformes totales
43 × 102
y coliformes fecales en tubos con caldo = 43 𝑁𝑀𝑃/𝑔𝑟
LMX fluorocult. 100

Los resultados de este análisis se

mostrarán en la figura siguiente,
encerrando con verde para
coliformes totales y con rojo para
coliformes fecales
 V. Discusión
Figure 6. Tabla del NTC 750 (tercera
actualización). [6]
En la figure 1 se puede apreciar Los
microorganismos mesófilos aerobios
los cuales son el grupo más grande
de los indicadores de calidad de los
alimentos. Se definen como un grupo
heterogéneo de bacterias capaces de
crecer en un rango de temperatura
entre 15 a 45 oC con un óptimo de 35
o
C, encontrados en un alimento
además de que se puede evidenciar
que esta por fuera de los rangos
permisibles, de igual manera al
analizar el recuento de mohos y
levaduras a los parámetros
establecidos. [7]
para el aislamiento de la figure 3,
que desempeña un papel muy
importante en los casos de
intoxicación por alimentos
infecciones clínicas humanas. La
fórmula del presente agar Baird-
Parker. Es un medio parcialmente
selectivo. El agar Baird-Parker se
utiliza ampliamente y se incluye en
numerosos procedimientos estándar
para el análisis de alimentos(etc) con
el fin de detectar la presencia de
Staphylococcus aureus
Figure 6. se puede presenciar un
color azul verdoso indica prueba
positiva para coliformes totales. e.
La presencia de fluorescencia,
utilizando lámpara de luz UV, indica
prueba positiva para Escherichia coli
y formación de un anillo color rojo al
utilizar el reactivo de Indol.
la muestra se considera que con lo
reglamentado en la resolución
1804/89 se puede observar que este
está por fuera de dichos
lineamientos
De acuerdo a lo que establece la NTC
750 del 2000 si la muestra ensayada
no cumple con uno o más de los
requisitos indicados en esta norma,
y de acuerdo con los criterios de
aceptación o rechazo definidos en el
plan de muestreo, se rechazará el
lote. En caso de discrepancia, se
repetirán los ensayos sobre una
nueva muestra tomada para tales
efectos.
El único lineamento que se
encuentra en una condición
aceptable para considerar al
producto de calidad, dentro de las 4
pruebas realizadas es el conteo de
coliformes totales, en el caso de
coliforme fecales estas no son
permitidas en el producto y el lote no
se considera de calidad, por otro
lado, las pruebas de aerobios
e
mesófilos, mohos y levaduras e
Staphylococcus aureus arrojaron
conteos extremadamente altos para
considerar el producto de calidad,
esto errores no son más que el
resultado del uso inadecuado de los
materiales, al momento de manejar
la muestra en donde se pudo perder
la esterilidad que llevaban varios
utensilios.
Entonces se hace posible afirmar que
la muestra de queso sufrió
contaminación por manipulación
debido a la falta de higiene por parte
de los manipuladores y las
condiciones en las que se encontraba
el producto local.
VI. Conclusiones
 podemos conocer los factores
que están presentes y que
inciden en las intoxicaciones
por alimentos
 nos permite saber si los
procesos de limpieza y alimentos: ventajas y limitaciones.,
desinfección tanto para los
manipuladores como para
superficies y ambientes
realizados han sido efectivos o
no
 Es de vital importancia el
número de diluciones con el
que se trabajara para realizar
siembras, ya que de estas
depende si la muestra a
trabajar tiene características
que indiquen una posible gran
carga microbiana.
 Gracias a la práctica se logró
entender que los alimentos en
este caso el queso, se
encuentra expuesto a la
contaminación por parte de
los manipuladores
mayoritariamente,
incrementando a un más su
microbiota.
VII. Bibliografía
[1] F. Bravo, El manejo higiénico de los
alimentos, guía para la obtención
del distintivo H., Editorial Limusa,
S.A. Grupo Noriega Editores
Balderas, México, D.F., 2004.
[2] C. Gonzales, Análisis de la calidad
microbiológica de los alimentos
procedentes de cadenas de comida
rápida., Memoria de Trabajo de Fin
de Grado. Grado en Biología.
Universidad de Coruña., 2018.
[3] B. R. F. C. L. C. Gerard J. Tortora,
Introducción a la microbiología,
Médica Panamericana, 2007.
[4] C. y. G. Y. Palomino, Técnicas
moleculares para la detección e
identificación de patógenos en
Caras Venezuela: Instituto de
Ciencia y Tecnología de Alimentos,
Facultad de Ciencias, Universidad
Central de Venezuela., 2014.
[5] F. C. G. y. P. P. Blanco, Calidad
microbiológica de alimentos
remitidos a un laboratorio de salud
pública en el año 2009,
Bucaramanga, Colombia:
Laboratorio Departamental de
Salud Pública de Santander., 2009.
[6] N. 750, Productos lacteos. Quesos,
2000.
[7] L. Cortes, Manual operativo de
análisis microbiológicos para
alimentos., Bogotá: Fundación Luis
Carlos Galán, 1991.