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AUTÓNOMA DE MÉXICO
INSTITUTO DE
BIOTECNOLOGÍA
MÉTODOS FÍSICO-QUÍMICOS
EN BIOTECNOLOGÍA
PCR
ALUMNOS:
CORTAZAR MARTÍNEZ
ADRIANA
SILVA RINCÓN ELSA
PATRICIA
JUNIO, 2004
1
ÍNDICE
Introducción 1
Historia y Desarrollo 2
Metodología básica 4
Componentes de la reacción 4
Nucleótidos 4
Primers 5
Especificidad 6
Secuencias complementarias 6
Contenido de G/C 6
Secuencia de los extremos 3’ 6
Temperatura de asociación 6
Cálculo de la temperatura de fusión (Tm) 7
Programas de Diseño de Primers 7
Templado 8
Polimerasa 8
Concentración de Magnesio 9
Otros componentes de la reacción 9
Parámetros de la reacción 9
Desnaturalización 10
Alineamiento 10
Extensión 11
Número de ciclos 11
Termocicladores 12
Identificación de los productos de PCR 13
RT PCR 15
PCR en tiempo real 16
Técnicas de detección 17
SYBR greenTM 17
Hydrolysis probes 18
Hairpin probes (Molecular BeaconsTM) 18
Hybridization probes 19
Scorpions 20
Cuantificación 21
Genes estándares 24
El efecto de limitar los reactivos 24
PCR competitivos cuantitativos 25
Máquinas para PCR en tiempo real 26
Ventajas del tiempo Real 27
Primers Degenerados 28
Uso de los primers degenerados 28
Diseño de los primers degenerados 29
Alineación de la secuencia 29
Información de la secuencia terminal de aminoácidos 29
Degeneración de primers 29
2
La reacción de PCR 29
El cóct el de PCR 29
Los ciclos de PCR (el termociclador) 29
Problemas comunes 30
Secuenciación 30
Controles 30
Long PCR 30
Aspectos Generales 31
Programa genérico para Long PCR para el Perkin Elmer 9600 32
Hot Start 32
PCR in situ 32
Principios y Métodos 32
Otras variantes de la PCR 33
Multiplex PCR 33
Nested PCR 34
Clonación de productos de PCR 34
Clonación TA 35
Clonación de extremos romos 36
Clonación direccional a través de primers modificados. 36
Clonación de fragmentos largos de DNA 37
Mutagénesis por PCR 37
Mutagénesis con PCR-extensión solapada 37
Mutagénesis sitio dirigida 38
Aplicaciones especiales de la PCR 39
Bibliografía 40
3
INTRODUCCIÓN
No cabe ninguna duda de que la técnica más revolucionaria de los últimos 15 años
ha sido la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que ha dado nuevas alas a la propia
Ingeniería genética y a toda la biología molecular. Fue inventada por Kary Mullis a
mediados de los años 80.
4
HISTORIA Y DESARROLLO
Kary Mullis
Hasta mediados de la década del ochenta, la única estrategia posible para aislar un
gen y obtener grandes cantidades del mismo en estado puro era el "clonado molecular".
Este método se basa en la introducción de fragmentos de ADN, uno de los cuales contendrá
el gen de interés, en vectores. Éstos son moléculas de ADN (plásmidos o ADN de
bacteriófagos) capaces tanto de transportar fragmentos ajenos a su estructura original como
de multiplicarlos dentro de bacterias. Si se conoce un pequeño tramo de la secuencia de
aminoácidos de una proteína cuyo gen se desea "clonar" (multiplicar), se pueden diseñar
métodos para identificar qué bacterias llevan el vector que transporta dicho gen. Este
reconocimiento también se puede realizar si se dispone de un anticuerpo contra la proteína
resultante del gen que se desea clonar. En este caso se reconoce la bacteria portadora
porque fabrica la proteína codificada por el fragmento de interés, la cual se une
específicamente al anticuerpo.
Una vez aislado el gen no sólo resulta posible determinar con exactitud su secuencia
de bases o analizar en detalle la información de la que es portador, sino que también se
puede estudiar su expresión (la manera en que dirige la síntesis de la proteína
correspondiente) en distintos organismos y tipos celulares, introducido en células en cultivo
o en animales de experimentación, etcétera. Estas técnicas, ya clásicas, han permitido el
aislamiento y caracterización de decenas de miles de genes de microorganismos, animales y
plantas, lo que provocó un cambio cualitativo en la comprensión del funcionamiento de la
célula.
2
Esta técnica permite multiplicar ("amplificar" es, en realidad, el término que se ha
impuesto) pequeñas cantidades de ADN entre cientos de miles y millones de veces. El
tramo destinado a reproducirse puede tener desde cincuenta hasta más de dos mil
nucleótidos de longitud. El segmento de ADN que sirve de molde no requiere estar
necesariamente en estado puro, sino que puede ser parte de mezclas complejas.
Cuando el proceso era manual la técnica de PCR era lenta y requería de trabajo
intensivo. Por lo tanto, los científicos de Cetus comenzaron a buscar las maneras de
automatizar el proceso.
En 1991 Hoffmann-La Roche Inc. adquiere los derechos y las patentes mundiales de
la PCR.
El Dr. Kary Mullis comparte el premio Nobel de Química en 1993 por inventar la
tecnología de PCR.
3
METODOLOGÍA BÁSICA
Componentes de la reacción
Los nucleótidos
Los nucleótidos se diluyen en agua, la solución debe ser protegida (por ejemplo con
el 10mM Tris pH 7,7-8,0 , concentración final) . Si no, un pH ácido promoverá la hidrólisis
del dNTP en dNDP y dNMP y los hará inútiles para las reacciones de polimerización de la
DNA enzimática. Los stocks son diluidos a 10 mM, alicuotados y almacenados a -20 ºC.
Es recomendado usar un stock de trabajo que contenga 1mM de cada dNTP.
4
Concentraciones entre 20 y 200 µM resultan en un balance óptimo entre
rendimiento, especificidad y fidelidad. Los cuatro dNTP deben ser usados en
concentraciones equivalentes para minimizar errores de incorporación de bases. Se debe
decidir la mas baja concentración adecuad de dNTP para la longitud y composición de la
secuencia blanco. Por ejemplo, 20 µM de cada dNTP en una reacción de 100 µl es
suficiente para sintetizar 2.6 µg de DNA o 100 pM de una secuencia de 400 bp.
Primers
Las concentraciones óptimas de los primers son generalmente entre 0.1 y 0.5 µM.
Altas concentraciones de primer pueden promover “mispriming” y acumulación de
producto no específico y puede incrementar la probabilidad de generar un templado
independiente llamado dímero de primer. Los productos no específicos y los dímeros de
primers son por si mismos sustratos para PCR y compiten con el producto deseado por la
enzima, dNTPs y primers, resultando en un bajo rendimiento del producto deseado.
5
Una razón menos obvia por la que los primers fallan es la presencia de estructuras
secundarias en el templado de DNA. En este caso la substitución de dGTP por 7-deazo-2’-
deoxiGTP ha sido muy usada
Especificidad
Los primers necesitan ser diseñados con menos de 3 pares de bases de homología
entre ellos. Si un primer tiene tal región de homología se formarán estructuras parciales de
doble cadena que interferirán con el alineamiento. Si la homología ocurre en el extremo 3'
de cualquier primer, ocurrirá la formación de dímeros de primer que, a menudo, prevendrá
la formación del producto deseado por competición.
Contenido de G/C
La composición base de los primers debe estar entre el 45% y el 55% de G/C. La
secuencia de los primers debe ser elegida de tal forma que no haya regiones de poliG o de
poliC que pueden promover el reconocimiento no específico. Las regiones poliA y poliT
deben también ser evitados ya que interfieren con el complejo del primer-templado. Esto
puede bajar la eficacia de la amplificación. El primer tendrá un contenido de G/C del 50% y
~20 bases de largo. Esto pondrá la Tm en la gama de 56°C - 62°C.
Temperatura de Asociación
6
Cálculo de la temperatura de fusión (Tm)
Tm = 2ºC (A + T) + 4ºC (G + C)
donde se asume una concentración de sal de 0.9M, típica de "dot blot" y otros ensayos de
hibridización
Los efectos de Na+ y K+ son equivalentes dentro de los márgenes del error
experimental.
http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi
http://alces.med.umn.edu/rawprimer.html
7
Templado
La polimerasa
a
Porcentaje de conversión de templado a producto por ciclo.
b
Frecuencia de error por pares de bases incorporadas.
c
Número promedio de nucleótidos adicionados antes de la disociación.
d
Número promedio de nucléotidos adicionados por segundo.
n.d. = no determinado
8
Concentración de Magnesio
Un buffer recomendado para PCR es de 10-50 mM de Tris-HCl (pH entre 8.3 -8.8).
Tris es un buffer iónico bipolar que tiene un pKa de 8.3 a 20ºC y un _ pKa de -0.021/ºC sin
embargo el verdadero pH de una buffer 20mM de Tris (pH 8.3 a 20ºC) varia entre 7.8 y 6.8
durante las condiciones típicas del termociclador.
Parámetros de la reacción
Con la PCR se realiza in vitro el proceso de replicación del ADN. Está basado en la
acción de la polimerasa, que como se sabe es la enzima que dirige la síntesis de ADN, y
desde una cadena simple de ADN sintetiza la complementaria. Para ello necesita al menos
una pequeña fracción de cadena doble de ADN para iniciar la síntesis. Esto hace posible, si
de forma voluntaria le proponemos una pequeña fracción de oligonucleótidos que sean
complementarios de una porción, se unirá después de la desnaturalización de la doble
cadena y mediante el crecimiento hacia el extremo 3´ del DNA por aposición de los
nucleótidos correspondientes suministrados y, a través de la acción de la polimerasa, se
hace la amplificación del fragmento deseado.
9
Desnaturalización.
Las condiciones típicas de desnaturalización son 95ºC por 30 segundos, o 97ºC por
15 segundos; sin embargo temperaturas más altas pueden ser apropiadas especialmente para
templados ricos en G + C.
Alineamiento.
10
Extensión.
Número de ciclos.
Los tres pasos anteriores constituyen un ciclo. La repetición de este ciclo unas 40
veces, por ejemplo, permite obtener, como resultado de un experimento de amplificación,
millones de copias del fragmento de interés.
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Tabla 3. Relación entre cantidad de DNA y el número de ciclos.
Termocicladores
Los primeros termocicladores eran robots que movían una gradilla de tubos entre
varios baños termostáticos a tiempos preestablecidos. Los actuales constan, básicamente, de
un bloque de metal que puede ser calentado o enfriado, con posibilidad de programar las
temperaturas y los tiempos.
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uno de los factores de falta de reproducibilidad, lo que hace que deban ajustarse de
nuevo las condiciones de tiempos y temperaturas.
Existen bloques que permiten ajustar distintas temperaturas en función de las zonas
del mismo. Se dice que tienen función gradiente. Son muy útiles cuando se realiza ajuste
continuo de programas de PCR, especialmente de temperaturas de hibridación, o cuando se
necesitan realizar diversos protocolos de forma simultánea.
Por otra parte, la identidad del producto puede ser confirmada mediante hibridación
(unión complementaria) con una sonda marcada radiactivamente, cuya secuencia de bases
esté contenida en el fragmento de interés. En este caso se procede así: el ADN fraccionado
por electroforesis es desnaturalizado y luego transferido a una membrana de nitrocelulosa o
nylon, que actúa como soporte sólido (Southern blot), y luego es puesto en contacto con la
sonda, que se unirá al fragmento buscado ya que ha sido preparada de modo tal que resulta
ser complementaria del mismo. También es posible colocar el ADN directamente en la
membrana en forma de pequeñas manchas (dot blot) para su posterior hibridación con la
13
sonda. La localización de las sondas radiactivas se logra, en ambos casos, mediante
autorradiografías
Figura 1. Tres formas de analizar los fragmentos de ADN amplificados mediante la técnica PCR. A:
visualización directa. Las muestras colocadas sobre un gel y sometidas a la acción de un campo eléctrico
(electroforesis) migran de una manera característica que se puede visualizar por tinción (coloreado) del ADN.
(Carriles 1-8: productos de distintas PCRs; carril M: marcadores de ADN de tamaño conocido.) B: Southern
blot. El ADN es desnaturalizado (separación de sus hebras constituyentes) y transferido a una membrana de
nitrocelulosa o nylon para luego incubar la hibridación (unión) con una sonda radiactiva. Ésta quedará fijada
donde se encuentre el tramo de ADN de interés y su presencia se revelará a través de una autorradiografía
(placa fotográfica sensible a la emisión radiactiva de la sonda). C: dot blot. Método análogo al anterior, pero
practicado sobre una siembra en forma de manchas de los fragmentos de ADN a analizar previamente
desnaturalizados.
Una estrategia distinta para confirmar la identidad del fragmento replicado consiste
en realizar dos reacciones de PCR consecutivas. Al finalizar la primera, una alícuota de la
misma es sometida nuevamente al proceso de multiplicación tras haber colocado dos
primers internos. Mediante el empleo de esta metodología, conocida como nested PCR
(PCR anidada), la filiación de los fragmentos obtenidos queda confirmada por el hecho de
que poseen tamaños previsibles.
14
RT PCR
El cDNA se desnaturaliza a mas de 90º (~94º), las dos hebras se separan. A 50 o 60º
los primers específicos se alinean con el sitio complementario en cada cadena. Los sitios de
unión a los primers deben estar separados 400 bases, pero generalmente se encuentran a
100 bases de distancia especialmente cuando se usa el PCR en tiempo real
15
Después de 30 o 40 ciclos de síntesis de cDNA, los productos de reacción son
analizdos usualmente por electroforesis en gel de agarosa. El gel se tiñe con bromuro de
etidio. Los geles de agarosa para analizar los productos de cDNA de la RT-PCR no nos
permite la cuantificación ya que el bromuro de etidio es muy insensible y cuando una banda
es perceptible sobrepasa la etapa logarítmica de amplificación.
Figura 3. El SYBR green fluoresce brillantemente solo cuando se une a DNA de doble cadena.
Éstos incluyen:
− northern blotting
− análisis de protección de ribonucleasa (RPA)
− hibridación in situ
− PCR
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La PCR es el método más sensible y puede discriminar entre mRNAs cercanamente
relacionados. Es una técnico simple pero es difícil conseguir resultados verdaderamente
cuantitativos usando PCR convencional.
Las técnicas tales como el northern blotting y los RPAs trabajan muy bien, pero
requieren más RNA del que a veces se dispone. Los métodos de PCR son por lo tanto
particularmente valiosos cuando las cantidades de RNA son bajas, puesto que el hecho de
que la PCR implica un paso amplificación significa que es más sensible. Sin embargo, la
PCR tradicional es solamente semicuantitativa en parte debido a las dificultades de
observar la reacción durante la parte verdaderamente linear del proceso de la amplificación.
Técnicas de detección
SYBR greenTM
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y a otros productos inespecíficos, resultando en una sobreestimación de la concentración
del DNA blanco.
Estas sondas poseen secuencias repetidas invertidas (ITR) en sus extremos 5´y 3´.
Este diseño permite que se forme una estructura de horquilla (hairpin) por
complementariedad de las dos regiones ITR, en ausencia de la secuencia blanco.
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Figura 5. Funcionamiento de las Hairpin probes (Molecular BeaconsTM)
Entre sus ventajas están el que son más específicas que las sondas TaqMan (deben
tener un cambio conformacional para hibridar con el blanco), permiten distinguir dos
secuencias blanco muy similares entre sí y que se pueden combinar varias Molecular
Beacons en una única reacción empleando diferentes compuestos fluorescentes para
identificar secuencias blanco específicas distintas (Múltiplex PCR).
Hybridization probes
Las dos sondas están diseñadas para hibridar en sus blancos específicos en un
arreglo cabeza-cola que permite que ambos fluoróforos estén en estrecha proximidad
entre sí. Así, la transferencia de energía de resonancia sólo ocurre cuando ambas sondas
se hibridan al blanco muy próximas entre sí, siendo la distancia óptima de 1 a 5 bases
entre las sondas.
19
Figura 6. Hybridization probes
En comparación con las otras dos técnicas, estas sondas están marcadas con un
único fluorocromo. Esto hace que sean más fáciles de sintetizar y caracterizar, y que el
control de calidad sea más sencillo que para las sondas doblemente marcadas.
Scorpions
Los scorpions son primers de PCR con una cola tallo y asa ("Stem-Loop") que
contiene un fluoróforo y un quencher. La estructura de tallo y asa es separada de la
secuencia de del primer de PCR por una modificación química que evita que se copie la
secuencia de tallo y asa del scorpion (Figura 7).
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Figura 7. Scorpions
Cuantificación
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Se adquieren los datos cuando la amplificación está todavía en la fase exponencial.
Esto está determinado por la identificación del número de ciclo al cual la intensidad de
emisión del fluoróforo aumenta con respecto al ruido de fondo (background). Este número
de ciclo se llama ciclo umbral (Ct: threshold cycle). El Ct está determinado en la fase
exponencial de la reacción y es más confiable que las mediciones en el punto final
convencionales (Figura 9). El Ct es inversamente proporcional al número de copias del
DNA blanco: a mayor concentración de blanco, menor Ct medido.
La gráfica del logaritmo del número inicial de copias del blanco para un sistema de
estándares contra Ct es una línea recta (Figura 10). La cuantificación de la cantidad de
blanco en muestras desconocidas es lograda midiendo Ct y usando la curva estándar para
determinar el inicio del número de copias. El proceso entero de calcular los Cts, de
preparar una curva estándar, y de la determinación del número de copias iniciales para las
muestras es realizado por el software del sistema 5700 y 7700.
22
La figura 11a muestra la amplificación, usando el sistema 5700, del gen humano de
la β-actinia en diluciones de DNA genómico. En esta figura, el cambio en la fluorescencia
del SYBR Green se grafica contra el número de ciclos. Se corrieron seis réplicas para cada
cantidad de DNA. La figura 11b muestra los mismos datos, pero graficando el logaritmo
del cambio en la fluorescencia contra el número de ciclos. El software del sistema 5700
calcula el Ct para cada reacción. Los valores de Ct se trazan contra el logaritmo de la
cantidad inicial de DNA genómico para dar la curva estándar mostrada en la figura 11c
23
Genes estándares
Un gen que puede ser usado como “loading control” (o estándar interno) debe tener
varias características:
• El gen estándar debe tener el mismo número de copias en todas las células.
• Debe expresarse en todas las células
• Un número de copias intermedio es ventajoso
Sin embargo, el estándar perfecto no existe, por tanto lo que se decida usar como
estándar o estándares debe ser validado para su muestra. Si es posible, se debe ser capaz
de demostrar que la expresión del estándar no cambia significativamente cuando las
células o tejidos son sujetos a las variables experimentales que se planean usar.
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Por otra parte, la cantidad de producto de PCR observada en el final de la reacción
es muy sensible a variaciones leves en los componentes de la reacción. Esto es porque las
medidas en el punto final se hacen generalmente cuando la reacción esta más allá de la fase
exponencial y una diferencia leve en un componente limitante puede tener un efecto
drástico en la cantidad final de producto. Por ejemplo, las reacciones laterales, como la
formación de dímeros de primer, pueden consumir los reactivos a diversos grados de tubo a
tubo. Así, es posible que una muestra que comienza con un número más alto de copias
termine con menos producto acumulado que una muestra que comienza con un número
más bajo de copias. Las diferencias entre el punto final y la detección en tiempo real se
ilustran gráficamente en la figura 12, que demuestra la amplificación de 96 muestras
idénticas. El cambio total en la señal del reportero, en el ciclo 40, varía ampliamente entre
las réplicas (Figura 12a). Sin embargo, los diagramas de la amplificación son notablemente
similares entre los ciclos 22 y 25, durante los cuales se determinan los valores de Ct (Figura
12b).
Para compensar los problemas con las medidas en el punto final, se han desarrollado
una variedad de técnicas de PCR competitivo cuantitativo. Se construye un amplicon
competidor que contiene los mismos sitios de unión que el primer y tiene la misma
eficiencia de amplificación que el blanco, pero es de alguna manera distinguible del
blanco. Una característica distinguible es hacer al blanco y los amplicones competidores de
diferentes tamaños para poder utilizar la electroforesis en gel para discriminar los dos
productos.
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del competidor en el final de la reacción y conociendo la cantidad inicial de competidor
agregada, la cantidad de blanco puede ser calculada. PCR competitivo se ha utilizado con
éxito para cuantificar DNA y RNA, pero su rango dinámica se limita a un cociente del
blanco/competidor cercano de 1:10 a 10:1. La mayor exactitud es obtenida encontrando el
punto de equivalencia en el cual el cociente del blanco y el competidor es 1:1. Para lograr
esto, se deben probar varias diluciones para alcanzar un cociente conveniente.
Hay muchas máquinas para PCR en tiempo real disponibles. El que se muestra en
la figura 13 es el ICycler® de BioRad. La tapa se desliza para acomodar las muestras en
una placa de formato 96-pozos (96-well). Esto significa que podemos mirar varias muestras
simultáneamente. La máquina contiene una cámara fotográfica sensible que supervisa la
fluorescencia en cada pozo de la placa en intervalos frecuentes durante la reacción de PCR.
El sistema ABI PRISM 7700, de Applied Biosystems (antes, Perkin Elmer) se basa
en el empleo de placas especiales, con tapas ópticas para su adaptación al lector de
fluorescencia. Cada pocillo tiene una forma similar a la de los tubos de 0,2 µL. El
funcionamiento es semejante al de un termociclador convencional, en cuanto a tiempos y
temperaturas, aunque se ajusta y se controla desde un ordenador que posee el software
específico. Se registran las emisiones de fluorescencia de forma continua, el software lo
convierte posteriormente en una representación gráfica, y preestablece un valor de Ct que
puede ser modificado con posterioridad, en función del análisis del usuario (Figura 14).
26
Figura14 .El software 7700 muestra una representación de una placa con 96 pozos, donde se pueden
identificar fácil y rápidamente los estándares y las muestras no conocidas. Después de una corrida de PCR el
número inicial de copias se muestra para cada muestra en el pozo.
27
La PCR en tiempo real permite una amplificación confiable con alta especificidad
y sensibilidad. El producto de PCR se cuantifica en cada ciclo. Hay una alta correlación
entre la señal (Ct) y la cantidad de blanco.
Con esta técnica se tiene alta precisión y exactitud. También hay la posibilidad de
PCR múltiplex. No requiere de análisis posterior a la PCR (electroforesis,etc.). Esto reduce
la posibilidad de contaminación y elimina fuentes potenciales de error. Se puede realizar un
mayor número de reacciones por día. El sistema a “tubo cerrado” sirve como control de
contaminación. Existe un amplio rango de aplicación. El diseño de primers y sondas tiene
que ser más exigente.
PRIMERS DEGENERADOS
Por ejemplo:
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utilizar para diseñar primers degenerados. El producto de PCR puede ser secuenciado. Si
los primers producen una secuencia truncada (del gen) o parcial, pueden ser utilizadas
como sondas.
Alineación de la secuencia
Si estos datos están disponibles pueden ser utilizados como un punto de partida para
el diseño de los primers.
Degeneración de primers
La Reacción de PCR
El cóctel de PCR
Una mezcla estándar del cóctel de PCR será un buen inicio. Sin embargo, una
excepción se observa para las concentraciones de primers. Un aumento de la concentración
puede ser necesario para compensar la degeneración. Si los primers usados son
absolutamente degeneradas, se pueden utilizar 50 pmoles como punto de partida y
optimizar a partir de ahí.
29
Los ciclos de PCR (el termociclador)
Problemas Comunes
Secuenciación
Después de que la banda del tamaño previsto se haya extraído del gel de agarosa, el
producto se puede secuenciar o clonar directamente. Aunque los primers degenerados se
pueden utilizar directamente para secuenciar, pueden dar lugar al apareamiento no
específico dependiendo del templado. La secuenciación de los productos permite el uso de
los sitios del primer situados generalmente en los flancos del vector.
Controles
30
LONG PCR
Para llevar a cabo esta técnica de manera eficiente es necesario el uso de dos
polimerasas: una polimerasa principal en la reacción que no tenga actividad de
proofreading, y una polimerasa que posea una actividad exonuclease 3’-5’, que esté
presente en una concentración más baja. La eficiencia disminuye drásticamente cuando se
incorporan las bases incorrectas. La actividad exonucleasa 3’-5’ elimina estos errores en
las bases y hace que la reacción posterior proceda. Por lo tanto, la amplificación de
fragmentos largos de DNA puede llevarse a cabo (Figura 16).
Aspectos Generales
La concentración óptima de los primers está en un rango de 0.1 a 1.0 mM. En una
concentración más baja que la óptima, el producto de la amplificación puede ser pobre. Por
otra parte, en una concentración más alta, el alineamiento no específico pueden superar la
amplificación del producto deseado. Las concentraciones del primer se pueden fijar
dependiendo de las características y las cantidades de DNA. Bajas concentraciones de
primer se recomiendan para DNA altamente complejo, tal como DNA genómico humano, o
para altas concentraciones de DNA templado. Mientras que altas concentraciones se
prefieren para templados de poca complejidad tales como DNA de plásmido, o para
cantidades limitadas de DNA templado.
31
Para establecer la concentración de enzima deben ser consideradas la cantidad o la
complejidad del DNA templado y de la longitud del fragmento amplificado. Exceso de la
enzima puede causar reacciones no específicas. La eficacia de la amplificación puede ser
disminuida cuando la concentración de la enzima es baja.
Los 15 segundos por ciclo para los ciclos 16-30 puede ser necesaria para solamente
fragmentos más largos (20 Kb).
Hot Start
Se puede utilizar el método de hot start para hacer una Long PCR. La reacción se
divide en dos partes: una fracción de templado/primer que es 3/4 o 4/5 del volumen de la
reacción, y una fracción de la polimerasa que constituye el resto. Cada fracción contiene la
misma concentración de buffer. La fracción de la polimerasa contiene solamente la
polimerasa, el buffer y agua; el resto de los componentes se incluyen en la fracción de
templado/primer. Se pone la fracción de templado/primer en el tubo y se calienta en la
máquina de PCR a 94ºC por 10 segundos. para desnaturalizar. Después se agrega la
fracción de la polimerasa durante el primer paso de alineamiento y extensión.
PCR in situ
En años recientes, las estrategias para mejorar los límites de detección en estudios
de ISH han incluido protocolos que amplifican la detección de la señal, o incrementando la
cantidad de sondas de hibridación usando cócteles del oligonucléotido o múltiples sondas
de cRNA. Una tercera estrategia que emplea la PCR es la amplificación basada en las
32
secuencias de nucleótidos del blanco. Esta estrategia fue desarrollada independientemente
por varios laboratorios en 1980
Principios y métodos
Antes de llevar a cabo la PCR in situ, las células o las muestras del tejido fino son
fijadas y permeabilizadas para preservar la morfología y permitir el acceso de los reactivos
de PCR a las secuencias intracelulares que se quieren amplificar. La amplificación de PCR
de las secuencias blanco se realiza después en las células intactas en tubos micro-Eppendorf
o directamente en preparaciones citocentrifugadas o secciones del tejido fino en laminillas
de cristal (Figura 17).
33
OTRAS VARIANTES DE LA PCR
Multiplex PCR
Es una PCR en la cual hay múltiples pares de primers (hasta 8) lo que da una serie de
productos. Éstos pueden verse como múltiples bandas en un gel de azarosa. Se usa
frecuentemente en diagnóstico médico. Ahorra templado, tiempo y gastos. Requiere una
cuidadosa optimización
Nested PCR
Se puede resolver utilizando un segundo par de primers que hibriden un poco más
internamente que los primeros. Se obtiene un producto único porque solo el fragmento
correcto de ADN posee los sitios correctos de hibridización para el segundo par de primers.
Para conseguir una mayor eficiencia en varios usos del “downstream” (por ejemplo,
la expresión de genes, la transcripción in vitro, secuenciación, preparación de sondas
marcadas para hibridización) los productos de PCR se clonan a menudo en vectores
apropiados (Figura 19).
34
Figura 19. Clonación de productos de PCR
Clonación TA
Los vectores T pueden ser hechos usando una enzima de restricción como la XcmI.
Sin embargo, debido a que Xcm I tiene una secuencia de reconocimiento poco común, el
sitio de restricción de Xcm I tiene que ser introducido por inserción de un oligonucleótido
sintético en el sitio de clonación.
35
Clonación de extremos romos
Las DNA polimerasas con actividad exonucleasa 3'-5' remueve los nucleótidos mal
apareados de los extremos 3' del DNA de doble cadena y genera productos con extremos
romos. Los productos de PCR generados por estas polimerasas se pueden clonar en
vectores con extremos romos.
Existen técnicas que permiten remover una sola extensión de nucleótidos de los
productos de PCR generados con la Taq polimerasa; estos productos de PCR se pueden
también clonar por la ligación de extremos romos en un vector conveniente.
Otro método que utiliza los primers modificados es la clonación con ligadura-
independiente
36
Un ejemplo de clonación direccional que no requiere primers especiales es la
clonación direccional basada en la Exonucleasa III. Bajo condiciones controladas de
reacción, la actividad exonucleasa 3'-5' de la Exonucleasa III se puede utilizar para
degradar el producto de PCR de los extremos 3' de ambas cadenas. El producto modificado
de PCR que resulta se puede clonar fácilmente en un vector linearizado con las bases
complementarias.
37
Mutagénesis sitio dirigida
38
Figura 21. Estrategias para mutagénesis, con el fin de obtener las modificaciones localizadas o en
genes enteros. En el panel (A) se muestra en forma esquemática el proceso de PCR “sujeto a error”, como
una estrategia para la distribución no dirigida de mutaciones en un gen de interés. Se muestran dos tipos de
mutaciones, las favorables (cuadrados) y las desfavorables (círculos). En ciclos sucesivos de PCR, se
introducen más mutaciones de cada tipo y, generalmente, las moléculas contendrán alguna de cualquier tipo.
Así, el efecto benéfico de las mutaciones favorables puede ser opacado, completamente, por la presencia de
las desfavorables. Una posible solución a este problema, se muestra en el panel (B) y se conoce como
“mezclado de ADN”. El producto de PCR se corta en pequeños trozos, utilizando la enzima ADNasa I y se
reensamblan, subsecuentemente, mediante PCR. Las mutaciones quedan, por lo tanto, cruzadas y los genes
con el mayor número de mutaciones favorables pueden ser enriquecido por selección. El panel (C) muestra el
principio de PCR utilizando un “primer degenerado”. Este “primer” o iniciador contiene una mezcla de todos
los cuatro posibles nucleótidos (abreviados en la letra N) en una posición determinada o, alternativamente,
una mezcla de codones ensamblados a partir de trinucleótidos. Las proteínas sintetizadas a partir de este gen
llevarán, por lo tanto, un grupo “randomizado” de aminoácidos en esta posición.
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BIBLIOGRAFÍA
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