12. TÉCNICAS DE CULTIVO DE MICROORGANISMOS.

MEDIOS Y MODELOS DE SELECCIÓN,

CRECIMIENTO Y MANTENIMIENTO.

Postulados de Koch

Los postulados fueron formulados a partir de los experimentos de Robert Koch con Bacillus anthracis. Demostró que,
al inyectar una pequeña cantidad de sangre de un ratón enfermo en uno sano, en el último aparecía carbunco.
Tomando sangre del segundo animal e inyectándola en otro, obtenía de nuevo los síntomas de la enfermedad. Luego
de repetir la operación una veintena de veces, consiguió cultivar la bacteria en caldos nutritivos fuera del animal y
demostró que, incluso después de muchas transferencias de cultivo, la bacteria podía causar la enfermedad cuando
se reinoculaba a un animal sano.

Los postulados son los siguientes:

 El agente patógeno debe estar presente en los animales enfermos y ausente en los sanos.
 El agente debe ser cultivado en un cultivo axénico puro aislado del cuerpo del animal.
 El agente aislado en un cultivo axénico debe provocar la enfermedad en un animal susceptible al ser
inoculado.
 El agente debe ser aislado de nuevo de las lesiones producidas en los animales de experimentación y ser
exactamente el mismo al aislado originalmente.

Condiciones generales para el cultivo de microorganismos

1. Disponibilidad de nutrientes adecuados: Un medio de cultivo adecuado para la investigación microbiológica

ha de contener, como mínimo, carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y sales inorgánicas. En muchos casos
serán necesarias ciertas vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Siempre han de estar
presentes las sustancias adecuadas para ejercer de donantes o captadores de electrones para las reacciones
químicas que tengan lugar.
Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de infusiones de carne, extractos de carne o
extractos de levadura. Sin embargo, las preparaciones de estas sustancias para su aplicación a los medios de
cultivo provocaban la pérdida de los factores nutritivos lábiles. Actualmente, la forma más extendida de
aportar estas sustancias a los medios es utilizar peptona que, además, representa una fuente fácilmente
asequible de nitrógeno y carbono, ya que la mayoría de los microorganismos, que no suelen utilizar
directamente las proteínas naturales, tienen capacidad de atacar los aminoácidos y otros compuestos más
simples de nitrógeno presentes en la peptona.
Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas específicas por lo que se añade muchos medios sustancias
como suero, sangre, líquido ascítico, etc. Muy a menudo se añaden al medio de cultivo ciertos colorantes,
bien como indicadores de ciertas actividades metabólicas o bien por sus capacidades de ejercer de
inhibidores selectivos de ciertos microorganismos.
2. Consistencia adecuada del medio: Partiendo de un medio líquido podemos modificar su consistencia
añadiendo productos como albúmina, gelatina o agar, con lo que obtendríamos medios en estado
semisólido o sólido. Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de que muchos
microorganismos no se desarrollan adecuadamente a temperaturas inferiores al punto de fusión de este
sólido y de que otros tienen la capacidad de licuarla. Actualmente los medios sólidos son de uso universal,
por su versatilidad y comodidad, pero hay también gran cantidad de medios líquidos cuyo uso está
ampliamente extendido en el laboratorio.
3. Presencia (o ausencia) de oxígeno y otros gases: Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmósfera
con tensión de oxígeno normal. Algunas pueden obtener el oxígeno directamente de variados sustratos.
Pero los microorganismos anaerobios estrictos sólo se desarrollarán adecuadamente en una atmósfera sin
oxígeno ambiental. En un punto intermedio, los microorganismos microaerófilos crecen mejor en
 condiciones atmosféricas parcialmente anaerobias (tensión de oxígeno muy reducida),mientras los
anaerobios facultativos tienen un metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas condiciones.
4. Condiciones adecuadas de humedad: Un nivel mínimo de humedad, tanto en el medio como en la
atmósfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las células vegetativas microbianas en los cultivos.
Hay que prever el mantenimiento de estas condiciones mínimas en las estufas de cultivo a 35-37ºC
proporcionando una fuente adecuada de agua que mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de
los cultivos y evitar así que se deseque el medio.
5. Luz ambiental: La mayoría de los microorganismos crecen mucho mejor en la oscuridad que en presencia de
luz solar. Hay excepciones evidentes como sería el caso delos microorganismos fotosintéticos.
6. pH: La concentración de iones hidrógeno es muy importante para el crecimiento delos microorganismos. La
mayoría de ellos se desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que requieren medios
más o menos ácidos. No se debe olvidar que la presencia de ácidos o bases en cantidades que no impiden el
crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso alterar sus procesos metabólicos normales.
7. Temperatura: Los microorganismos mesófilos crecen de forma óptima a temperaturas entre15 y 43ºC. Otros
como los psicrófilos crecen a 0ºC y los temófilos a 80ºC, o incluso a temperaturas superiores
(hipertemófilos). En líneas generales, los patógenos humanos crecen en rangos de temperatura mucho más
cortos, alrededor de 37ºC, y los saprofítos tienen rangos más amplios.
8. Esterilidad del medio: Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la
aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano
normal del o de los especímenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios
de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante)

TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

ATENDIENDO A SU ESTADO FÍSICO:

 Medios de cultivo: Sólido y Líquido (caldos). En ambos medios debe haber una buena cantidad de
nutrientes que faciliten el crecimiento bacteriano. En los medios sólidos, el “Agar-Agar” es la molécula
encargada de darle la solidez y consistencia al medio. Esta sustancia proviene, principalmente, de un
alga llamada Gelidium, aunque muchos otros géneros pueden servir como fuente de este polisacárido
(es decir, un azúcar grande formado por la unión de azúcares pequeños). La ventaja fundamental de usar
un medio de cultivo líquido, es que permite que crezcan bacterias que se encuentran en muy poca
cantidad, es decir, cuya concentración es muy baja en la muestra que estemos analizando. Para el caso
del medio de cultivo sólido, la ventaja radica en que permite detectar los diferentes tipos de bacterias
que puedan encontrarse en una sola muestra.
 Medios semisólidos. Se preparan a partir de los medios líquidos, agregando a éstos un agente
solidificante en una proporción menor que para preparar medios sólidos. Uno de sus usos es la
investigación de la movilidad de las bacterias.

SEGÚN SU UTILIZACIÓN:

1) Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes mínimos para el crecimiento de bacterias que no
necesiten requerimientos especiales. El medio más conocido es el agar nutritivo o agar común, que resulta de la
adición de agar al caldo nutritivo. Otros medios son el agar tripticasa de soja, el agar Columbia, etc.

2) Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, además de las sustancias nutritivas normales tiene una serie
de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes. Estos medios se enriquecen por
adición productos biológicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis…) En ocasiones es posible añadir suplementos
artificiales a los enriquecimiento del mismo (p. ej. Polivitex, Isovitalex, etc).
 3) Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias en una población
polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente una población microbiana
específica. Un ejemplo de medio selectivo es el caldo selenito, que favorece el crecimiento de salmonellas y
frenar el del resto de enterobacterias.

4) Medios inhibidores: Cuando las sustancias añadidas a un medio selectivo impiden totalmente el crecimiento
de una población microbiana, se denomina inhibidor. Los medios inhibidores podrían considerarse la variante
más restrictiva de los medios selectivos. Los medios inhibidores se consiguen habitualmente de sustancias
antimicrobianas o de cualquier otra que inhiba completamente el desarrollo de una población determinada. Un
medio inhibidor es el MacConkey que permite el crecimiento de los gérmenes Gram negativos e impide el
crecimiento de Gram positivos.

5) Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia características bioquímicas para diferenciar géneros
o especies. Un ejemplo es la adición de un azúcar fermentable o un sustrato metabolizable con este fin.

6) Medios de identificación: Son los destinados a comprobar alguna cualidad específica que sirva para reconocer
la identidad de un microorganismo. Estos medios han de poseer los elementos para asegurar el crecimiento de
los microorganismos, el sustrato específico que vaya a ser metabolizado que nos muestre el resultado. El agar
Kligler, el medio de Simmons y en general, cualquier medio que haya añadido un elemento diferencial de un
microorganismo, son medios utilizados. Un ejemplo son los medios que sirven para identificar bacterias de
infecciones de orina.

7) Medios de multiplicación: Sirven para obtener una gran cantidad de células a partir de un microorganismo ya
aislado. Se emplean en la obtención de vacunas, en la investigación y en la industria. Los medios utilizados para
la multiplicación suelen ser líquidos. El caldo-infusión cerebro-corazón (BHI), es un ejemplo de estos medios.

8) Medios de conservación: Se utilizan para conservar una cepa que, por diversas razones, interesa mantener.
Fundamentalmente se utilizan como controles de calidad de las pruebas de laboratorios de Microbiología. En el
laboratorio se pueden conservar las cepas de tres formas:

 haciendo pases periódicos de placa a placa,

 mediante liofilización de una suspensión bacteriana
 congelando las cepas en leche descremada estéril al 0,1%.

9) Medios de transporte: Se usan para el transporte de muestras clínicas que no pueden sembrarse
inmediatamente. Su utilización debe hacerse introduciendo la torunda con la que se obtuvo la muestra en el
interior del medio (generalmente en un tubo). Son ejemplos típicos de este grupo los medios de Stuart-
Amies,Cary-Blair, etc

ATENDIENDO A SU COMPOSICIÓN:
Según las sustancias que entren a formar parte en su composición, los medios de cultivo pueden ser clasificados en:

1-. Medios Complejos: Fueron los primeros utilizados, y los más empleados se preparan a partir de tejidos animales,
y más raramente de vegetales. Su composición no es exactamente definida, y por consiguiente no es rigurosamente
constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en condiciones experimentales, donde la reproductibilidad no
podrá ser exacta. En la práctica corriente estos medios dan excelentes resultados y son los más empleados.

2-. Medios Sintéticos: Son aquellos que contienen en su composición exclusivamente sustancias químicas conocidas
y disueltas en agua destilada en proporciones determinadas, resultando un medio de composición perfectamente
definida.
3-. Medios Semisintéticos: El gran número de factores de crecimiento exigidos para ciertos gérmenes hace que la
fabricación de un medio sintético para estos gérmenes sea imposible o demasiado cara. En este caso se aportan los
factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgánico complejo (extracto de levadura, extracto de tejidos,
etc.). Ciertos gérmenes no crecen en ningún medio por muy enriquecido que esté éste, haciéndolo exclusivamente
en células vivas con unas características determinadas. Ejemplos de este tipo son, aparte de los virus, las Chlamydias,
Rickettsias, etc.

SEGÚN SU ORIGEN:

a) NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal como ser extractos
de tejidos o infusiones y cuya composición química no se conoce exactamente.

b) SINTÉTICOS: son los medios que contienen una composición química definida cuali y cuantitativamente. Se
utilizan para obtener resultados reproducibles.

c) SEMISINTÉTICOS son los sintéticos a los que se les añaden factores de 13 crecimiento bajo una forma de un
extracto orgánico complejo, como por ejemplo extracto de levadura.

TÉCNICAS DE SIEMBRA

Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio adecuado, con el fin
de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y multiplicación.
Una vez sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento.
Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen:
 Que se efectúen asépticamente
 Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estén esterilizados
 Que se realicen solo los manipuleos indispensables
 Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando un mechero o bien Flujo laminar.

PLACA
Tipos de siembra
 Siembra por inmersión: se coloca el inóculo en una placa o caja de Petri y sobre el mismo se vierte el medio
de cultivo previamente fundido. Este método se utiliza para microorganismos aerobios.
 Siembra en doble capa: se procede de la misma manera que por inmersión. Una vez solidificado el medio se
vierte una cantidad extra de medio necesaria para cubrir la capa anterior (generalmente 10 ml. aprox.). Este
método se utiliza para microorganismos anaerobios facultativos y microaerofílicos.
 Siembra en superficie: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido, se deja solidificar y se
coloca sobre la superficie el inóculo. Con ayuda de una espátula de Drigalsky se extiende el inóculo hasta su
absorción total por el medio de cultivo. Este tipo de siembra se recomienda para microorganismos aerobios
estrictos.
 Siembra en estría: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido y se deja solidificar.
 Siembra volumétrica: Este método de siembra consiste en sembrar una muestra liquida cuyo volumen no
puede ser predeterminado, en medio de cultivo sólidos o líquidos. Por ejemplo: En las muestras de exudado
vaginal tomadas con pipetas de Pasteur, no puede determinarse el volumen, ya que este tipo de pipeta
carece de escala de graduación, sin embargo, la orina empleadas en el urocultivo o la sangre para el
hemocultivo se puede determinar con pipeta o jeringuilla respectivamente el volumen que será sembrado.
 Siembra masiva: Cuando se desea realizar una siembra masiva se puede utilizar la espátula de Driglaski. En
este caso la gota de muestra liquida se esparce con la espátula por toda la superficie del medio de cultivo
sólido imprimiéndo un movimiento en espiral. La siembra masiva también se puede realizar con un hisopo
grueso embebido de un cultivo liquido, procediendo a su deslizamiento sobre toda la superficie de una placa
de agar.
Técnicas de cultivo:
 Técnica de siembra por estría en placa
Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. Para ello, con un asa de siembra se toma
una muestra de la población mixta y a continuación se hacen estrías sobre la superficie de un medio sólido
preparado en una placa Petri (a las placas Petri también se les denomina simplemente placas). Conforme se van
haciendo estrías en zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos
microorganismos. A continuación, se flamea el asa, se toca en la región donde se han realizado las últimas
estrías y se continúa la siembra con la misma técnica, en la superficie de medio sin sembrar aún. Repitiendo este
proceso varias veces se logra separar células individuales. A continuación, las placas se incuban en un lugar
adecuado, permitiendo que las células aisladas experimenten un número suficiente de divisiones para formar
colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon derivado de una sola célula, no
podemos asegurarlo. Quizás, dos células quedaron depositadas tan juntas que han originado una única colonia
mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo axénico, conviene repetir el
procedimiento a partir de una colonia bien aislada en la primera placa. Las colonias que se desarrollen la
segunda vez, serán, casi con toda seguridad, cultivos axénicos (de una misma cepa o variedad del organismo).

 Técnica de extensión en placa:

Las muestras diluidas se siembran directamente en la superficie de la placa
de agar, extendiéndolas con ayuda de un asa de Diralsky de cristal estéril.
La suspensión se absorbe en el agar, dejando las células microbianas sobre
la superficie. En ambas técnicas las placas se incuban hasta la aparición de
las colonias. Como en el método de siembra por estría, no existe la
seguridad de que las colonias que aparecen en las placas sembradas por
extensión o en el agar solidificado sembrado por el método del vertido en
placas sean cultivos axénicos hasta que se repita el proceso. Las dos
técnicas de siembra por dilución presentan la ventaja de que permiten
obtener un mayor número de colonias aisladas que el método de siembra
por estría, por tanto, se eligen cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con varios tipos de
microorganismos

TUBO
Tipos de siembra
 Siembra por dilución: Se toma el tubo de ensayo con medio líquido, como el caldo simple. Se toma el
material a diluir y se siembra en el tubo con el uso del asa cargada con el material bacteriológico, se agita,
con movimientos moderados.
 Siembra por estrías en superficie: Se siembra el material en la superficie de el agar inclinado en un tubo de
ensayo, allí se extiende por toda la superficie con el asa bacteriológica, previamente esterilizada y cargada
con el material a sembrar, haciendo estrías no muy amplias, pero tampoco muy estrechas. Se inicia por la
 parte más profunda de la superficie inclinada y se termina la estría en la parte más cerca de la boca del
tubo.
 Siembra por punción. Como es obvio, el instrumento de siembra a emplear será la aguja de platino y el
medio de cultivo sólido, generalmente, en tubo de ensayo. Las manipulaciones y la observancia de las
precauciones de asepsia, son similares que cuando se utiliza el asa. La particularidad que tiene este método,
es que la aguja (con el inoculo) debe atravesar perpendicularmente el medio de cultivo.

Técnicas de siembra
 Siembra por inoculación o agitación: Con un asa bacteriológica, esterilizada, se toma cantidad de inoculo, se
intorduce en el centro del medio liquido, agitándose, no tocando la pared del tubo.

 Siembra por estría ( en tubos de agar inclinado): Se toma una muestra de material en el asa de siembra, se
desliza en zigzag desde la superficie más profunda del tubo.

 Siembra por picadura: con el asa recta, tomar la muestra, sembrar en agar semisólido, en el tubo de ensayo
hasta que la muestra quede bien impregnada al agar.

 Siembra por vertido en placa: Diluciones en varios tubos, pipeta 1cc de muestra o dilución, agregar tubo de
ensayo estéril, se agrega medio licuado, mantener a 55°C, movimientos rotatorios, solidificar.