PCR a Tiempo Real o PCR

cuantitativa (Q-PCR) para

medir la expresin gnica

SERVICIO DE GENMICA Y PROTEMICA

UNIDAD DE EXPRESIN GNICA

PCR a tiempo Real o

PCR cuantitativa
z La PCR a tiempo Real o PCR cuantitativa es una variacin
de la tcnica PCR estndar que se emplea para la
cuantificacin tanto de DNA como de mRNA en una
muestra (medida de la expresin gnica)
z Utilizando primers especficos puede medirse el nmero de
copias relativo de mRNA que contienen una muestra (RTPCR para la medida de la expresin gnica)

Cuantificacin del
producto de PCR
zTericamente en cada ciclo se duplica la
cantidad de producto: Producto (P) aumenta
exponencialmente con el nmero de ciclos
de PCR (n)
z El producto de PCR depende del nmero
de copias inicial del molde de cDNA (T)
Si partimos del doble de molculas iniciales de
cDNA obtendremos el doble de producto

P = (2)n T

Representacin
grfica de la PCR
Visin lineal

Deteccin PCR
tradicional

Elevada
variabilidad

Elevada
precisin

Visin logartmica
Elevada
precisin

Deteccin PCR
tradicional

Problemas asociados
a la PCR tradicional
zDeteccin fase final
zBaja resolucin del gel de agarosa: no se
pueden detectar pequeos cambios
zProcesamiento post-PCR
zTincin de bromuro de etidio no es muy
cuantitativa
zPobre precisin y menor sensibilidad

Problemas asociados
a la PCR tradicional
Misma cantidad de material de inicio
da lugar a diferente cantidad de
producto final

Diferente cantidad de material de

inicio da lugar a la misma cantidad de
producto final

Solucin: PCR a
tiempo real
z Detecta la acumulacin de amplicn o producto
durante la reaccin.
z La deteccin se realiza por medio de la
fluorescencia
El producto de PCR es marcado con un fluorocromo
reporter
La cantidad de fluorescencia es directamente
proporcional a la cantidad de producto
Se cuantifica la cantidad de fluorescencia en cada ciclo
y se representa una grfica: fluorescencia vs. Ciclo PCR
El anlisis de los datos y cuantificacin de producto se
realiza en la fase exponencial de la PCR, elevada
precisin.

Escala lineal

Resultados de PCR a
tiempo real

Fluorescencia

CT: Threshold
cycle o ciclo
umbral
Umbral o Threshold

Lnea base
Baseline

Valor CT

Fluorescencia basal

Fluorescencia

Escala logartmica

Definiciones
z Lnea Base o Baseline:

Ciclos iniciales de PCR, donde no

hay cambios significativos en la seal de fluorescencia. Determina la
fluorescencia basal.

z Umbral o Threshold: Nivel determinado automticamente o

manualmente y fijado en la regin exponencial de la grfica de
amplificacin, por encima de la lnea base, determina el nivel de
fluorescencia significativamente superior a la fluorescencia basal. Se
emplea para la determinacin del Ciclo umbral o CT.

z CT: Ciclo umbral, ciclo en el que la fluorescencia de la

muestra supera el umbral. Se calcula en escala logartmica.

El CT se emplea para la cuantificacin relativa de la
expresin gnica.

Anlisis de
resultados o
cuantificacin
z Se emplean muestras estndar, muestras con
concentracin conocida. En expresin gnica se
emplean diluciones seriadas de un cDNA de
concentracin conocida.
z Se determina el CT de las muestras estndar y de
las muestras desconocidas
z Se realiza una curva estndar a partir de los datos
de CT y concentracin de las muestras estndar.
z Se calcula la concentracin de las muestras
desconocidas extrapolando el valor de CT de
dichas muestras en la curva estndar.

Anlisis de resultados:
determinacin de CT y cuantificacin
Determinacin de CT en escala logartmica
(en verde, la curva de la muestra
desconocida)

Fluorescencia

CTs
y y y y yy y y

CT value

Curva estndar: generada a partir de los

CTs de las muestras estndar

y
y

Extrapolacin de la concentracin de cDNA a partir del

valor CT de la muestra desconocida

Log [cDNA]

Ventajas de la PCR a
tiempo Real
z Elevada precisin y
exactitud en la
cuantificacin

Ventajas de la PCR a
tiempo Real
z Elevada sensibilidad (capaz de detectar 0.5 femtogramos de RNAr)
z Amplio rango dinmico lineal: 9-logs

Qumica: tipos de
fluorocromos

Sondas especficas
z Basadas en la tcnica FRET (fluorescence
resonance energy transfer)
Marcadas con dos fluorocromos, uno de elevada
energa (Reporter), y el otro de baja energa (Quencher)
Cuando ambos fluorocromos estn cercanos, la energa
emitida por el Reporter es absorbida por el Quencher:
No hay emisin de fluorescencia
Cuando se separa el Reporter del Quencher ste no
absorve energa y se detecta un aumento en la
fluorescencia del Reporter

Sondas TaqMan
Reporter

: FAM o VIC

Quencher:
Excitation

TAMRA

FRET

Emission

FRET
Amplicon

ANNEALING

EXTENSION

Amplicon

5-3 exonuclease

5 Exonucleasa

Sondas TaqMan
MGB
NFQ: non-fluorescent Quencher
MGB: Minor Groove Binder
R

NFQ

MGB

MGB: Estabiliza los ltimos 5-6 pb del extremo 3

Sondas ms cortas para la misma Tm
NFQ: no emite fluorescencia basal: menor background o
ruido, mayor sensibilidad

Fluorocromo no
especfico: SYBR
Green
Desnaturalizacin

Hibridazin

Polimerizacin

La fluorescencia de SYBR
Green es proporcional a la
cantidad de producto

Fluorocromo no
especfico: SYBR
Green

z Problemas: No es especfico, se une a cualquier

producto de doble cadena
Deteccin de productos inespecficos
Deteccin de dmeros de primer

z Solucin:
Diseo muy estricto y cuidadoso de los primers
Optimizacin de la reaccin PCR

z Al finalizar la PCR hay que realizar una Curva de

desnaturalizacin o disociacin
Al desnaturalizar el producto disminuye la
fluorescencia

SYBR Green: curva

de disociacin
Tm del amplicon o producto de PCR

De esta manera se pude analizar si hay diferentes productos de

PCR o inespecificidades, ya que cada tipo de amplicn tendr
una Tm diferente

SYBR Green: curva de

disociacin
NTC: no template control:
contiene todos los reactivos
excepto el molde (cDNA o
DNA): permite detectar la
amplificacin de dmeros de
primer

Deteccin de productos
inespecficos

Diseo y Validacin de la
reaccin

Diseo de primers y
sondas especficas

zExisten mltiples programas informticos y

webs para el diseo de primers y sondas
TaqMan

Diseo de sondas
especficas
z Tm : 8- 10 C superior a la Tm de los primers
z Sondas TaqMan:
Mximo 30 pb de largo (si no, disear sondas MGB), mnimo 13
pb
Contenido GC 30-80%
Evitar runs de nucletidos idnticos (>3), especialmente 4 o ms Gs.

No Gs en el extremo 5 (quencher)
Seleccionar la hebra que contenga ms Cs que Gs

z Disear primero la sonda y luego los primers, lo ms cerca

posible a la sonda, sin que se solapen
z Se recomiendan amplicones entre 50-150 pb

Diseo de los primers

z 18-30 nucletidos
z Tm: 58-60C
z Contenido GC: 30-80 %
z Evitar complementariedad interna y
complementariedad entre los primers,
especialmente en los extremos 3
z Evitar runs de nucletidos idnticos,
especialmente 4 o ms Gs.
z Los 5 ltimos nucletidos del extremo 3 no
deberan contener ms de dos G y/o Cs.
z Cercanos a la sonda pero sin solapamiento

Diseo de los primers

zDisearlos en las uniones exn-exn o en
exones diferentes: no-coamplificacin de
DNA genmico contaminante
Si se desconoce la estructura exnica o se
trata de genes con un nico exon: tratar la
muestra de RNA con DNase RNAse-free

zVerificar la especificidad de los primers

utilizando herramientas como el Blast
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)

Validacin de la
eficiencia de PCR
zUnos resultados reproducibles requiere que
la eficiencia de la PCR sea del 100 %
(duplicacin del producto en cada ciclo)

P = T(1 + E)

T: cantidad de muestra inicial

P: producto
Si la eficiencia es 1 (100%): P = T (2)n

Eficiencia de la PCR
zLa realidad es que las eficiencias no son del
100%
10,000,000,000
100% EFF

1,000,000,000
AMOUNT OF DNA

CYCLE AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA AMOUNT OF DNA

100% EFFICIENCY 90% EFFICIENCY 80% EFFICIENCY 70% EFFICIENCY
0
1
1
1
1
1
2
2
2
2
2
4
4
3
3
3
8
7
6
5
4
16
13
10
8
5
32
25
19
14
6
64
47
34
24
7
128
89
61
41
8
256
170
110
70
9
512
323
198
119
10
1,024
613
357
202

100,000,000

90% EFF

10,000,000

80% EFF
70% EFF

1,000,000
100,000
10,000
1,000
100
10
1
0

10

20

PCR CYCLE NUMBER

30

Clculo de la
eficiencia de PCR

Slope: -3.34

La eficiencia se
calcula a partir
de la pendiente
(slope) de la
curva estndar

Eficiencia = [10 (-1/slope) ] - 1

E = 10 (-1/-3.34) 1 = 10 0.30 1 = 1.995 1 = 0.995 = 99.5%

Clculo de la
eficiencia de PCR

Stratagene Application Notes #10

Factores que afectan

a la eficiencia de
PCR
z Tamao del amplicn: amplicones de menor tamao tienen
una eficiencia mayor
Recomendado: 50-150 pb. Para sondas TaqMan se recomiendan <
100 pb)

z Diseo de los primers: hibridacin con secuencias

inespecficas
z Contenido GC
z Concentracin de reactivos
z Presencia de inhibidores
SDS >0.01 %, fenol >0.2%, etanol <1%, sod. Acetato >5mM, DTT
>1 mM, DMSO >5%

Factores que afectan

a la eficiencia de
PCR

z Estructura secundaria del amplicn.

Analizar la estructura secundaria con el servidor DNA mfold del

Dr. Michael Zuker u otro programa equivalente.
http://frontend.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/
z La Tm de cualquier estructura secundaria debe ser inferior a 60C
z Para mejorar la eficiencia puede ser necesario que tengan que
disearse los primers fuera de las regiones con estructura secundaria
del amplicn. Esto tambin mejora la sensibilidad

Controles y
replicados
z Siempre migrar replicados de las reacciones
Comenzar por triplicados. Desviacin estndar entre
triplicados <0.30

z Migrar NTCs o No Template Control por cada

ensayo (mezcla de PCR) o gen
Recciones sin muestra aadida
Dmeros de primer

z Migrar controles RT minus

Muestras de RNA sin haber realizado la RT (no cDNA)
Amplificacin de DNA genmico

Cuantificacin de la expresin
gnica
Cuantificacin relativa

Cuantificacin
relativa
zAnaliza los cambios de expresin del gen
analizado de una muestra dada respecto a la
expresin dicho gen en una muestra de
referencia (calibrador)
Calibrador: muestra de referencia respecto a la
que se cuantifica los cambios de expresin
zMuestra no tratada, t=0 de estimulacin, muestra
normal, sano, tejido de referencia, ratn salvaje, etc.

Control endgeno o
gen de referencia
z Housekeeping genes o genes de mantenimiento, estn presentes en
todos los tipos celulares
z Su expresin se mantiene relativamente constante en las condiciones
del ensayo
Entre diferentes tejidos, durante el tratamiento o estimulacin, etc.

z Sirve para corregir diferencias de expresin relacionadas con

diferencias en la cantidad de RNA total de las muestras
z No existe un control endgeno perfecto para todos los tipos de
experimentos. Cada investigador debe poner a punto cul es el mejor
control endgeno en sus condiciones experimentales, es decir, aquel
que vare lo menos posible en sus condiciones experimentales
concretas. Es posible que para el mismo tejido pero diferentes
condiciones o experimentos sean necesarios diferentes controles.
z Se recomienda testar varios controles endgenos.

Tipos de controles
endgenos
z Esta es una lista de los controles endgenos ms utilizados

Beta-actina
GAPDH
Beta-2-microglobulina
TATA box binding protein (TBP)
Ciclofilina (varias tipos, mejor la ciclofilina B)
18S rRNAs
Receptor de transferrina
HPRT
Ribosomal protein, large PO
Phosphoglycerate kinase 2 (PGK2)
Factor de elongacin 1 alpha
-glucuronidasa

z Podra emplearse como control cualquier gen que se

exprese en el tejido o tipo celular y que no vare entre las
condiciones experimentales a comparar.

Cuantificacin relativa
en Real time PCR
z Tres mtodos alternativos:
z Mtodo de la curva estndar
Una curva estndar para cada gen, target y referencia
Ventaja: se puede aplicar cuando ambos genes tienen distintas
eficiencias

z Mtodo del CT comparativo

La eficiencias del gen target y del control endgeno debes ser
comparables

z Mtodo Pfaff1 y el mtodo E-Method, Roche

El cambio o fold-change del gen diana se normaliza frente al gen
referencia
Se puede aplicar cuando las eficiencias de ambos son diferentes.
Se incluye la eficiencia de cada gen en el clculo
Se obtiene una gran reproducibilidad y exactitud con estos mtodo

Comparacin de
eficiencias

Si las eficiencias son distintas, la

diferencia de CT ( CT)entre gen y
control endgeno no son iguales para las
distintas concentraciones de muestra (
CT vs. Log [RNA] slope > 0.1)

Curvas estndar

Si las eficiencias son comparables, la diferencia

de CT ( CT)entre gen y control endgeno es
constante para las diferentes concentraciones
( CT vs. Log [RNA] slope < 0.1)

Mtodo PffafI

CT comparativo

Mtodo del CT
comparativo

Mtodo del CT
comparativo
zSe normaliza la cantidad o CT del gen target
respecto al gen referencia (CT)
zSe comparan los CT de cada muestra
experimental o referencia (c) (CT, r), con el
CT de la muestra calibrador (CT, cb):
CT
zLa cantidad relativa en cada muestra viene
definida por la siguiente frmula

Mtodo del CT
comparativo
CT
c-myc

CT
GAPDH

CT
c-mycGAPDH

CT
CT CT,cerebro

Cerebro:
Calibrador

30.49

23.63

6.86

0.00

1.00

Rion

27.03

22.66

4.37

-2.50

5.66

Hgado

26.25

24.60

1.65

-5.21

37.0

Muestra

2- CT
C-myc relativo
al cerebro

Mtodo de las curvas

estndar
IL-1

GAPDH
R2 = 0.999
Y = -3.488x + 39.04

R2 = 0.995
Y = -3.33x + 37.21

Log [IL-1]

Log [gapdh]

Muestra

[IL-1]

[GAPDH]

[IL-1]
[GAPDH]

[IL-1]
[GAPDH]

Cerebro:
Calibrador

0.039

0.54

0.07

1.00

Rion

0.41

1.02

0.40

5.7

Hgado

0.70

0.28

2.49

35.6

relativo al calibrador

Mtodo PffafI

z Etarget : eficiencia del gen diana o target (c-myc)

z Ereference: eficiencia del gen referencia o control endgeno (GAPDH)
z CPtarget (control-sample): cambio en los valores de los ciclos umbral
(CP = CT) del gen target entre la muestra calibradora (control) y la
muestra referencia o experimental (sample)
z CPreference (control-sample): cambio en los valores de los ciclos
umbral (CP = CT) del control endgeno entre la muestra calibradora
(control) y la muestra referencia o experimental (sample)