HPLC

25/1/22
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1
BUENAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
ENERO 26 DE 2.022
FABIOLA BUCHELLI VARONA

QUÍMICA FARMACÉUTICA - UNIVERSIDAD NACIONAL
MBA - UNIVERSIDAD DE LA SALLE

2
1
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TÉCNICAS DE SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICAS
LAS TÉCNICAS DE SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICAS SON MÉTODOS DE

SEPARACIÓN DE ETAPAS MÚLTIPLES, EN LAS QUE LOS COMPONENTES
DE UNA MUESTRA SE DISTRIBUYEN EN DOS FASES: LA FASE
ESTACIONARIA Y LA FASE MÓBIL
LA FASE ESTACIONARIA
• SÓLIDO
• LÍQUIDO ABSORBIDO SOBRE UN SÓLIDO
• GEL
• PUEDE ESTAR EMPACADA EN UNA COLUMNA
• EXTENDIDA COMO UNA CAPA
• DISTRIBUIDA COMO UNA PELÍCULA SOBRE UNA PLACA
LA FASE MÓBIL
• GASEOSA
• LÍQUIDA

3
EL MECANISMO DE LA SEPARACIÓN DE LOS COMPONENTES DE UNA

MUESTRA PUEDE BASARSE EN:
• ADSORCIÓN
• DISTRIBUCIÓN DE MASAS (PARTICIÓN)
• INTERCAMBIO IÓNICO
• DIFERENCIAS EN LAS PROPIEDADES FISICOQUÍMICAS DE LAS MOLÉCULAS (TAMAÑO,
MASA O VOLÚMEN)
TIPOS DE CROMATOGRAFÍA EN ANÁLISIS CUALITATIVOS Y

CUANTITATIVOS
• CROMATOGRAFÍA EN PAPEL (ASCENDENTE O DESCENDENTE)
• CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA (CAPA FINA) QUE TAMBIÉN INCLUYE LA
CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA DE ALTA RESOLUCIÓN
• CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
• CROMATOGRAFÍA DE GASES
• CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS PRESURIZADOS (CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE
ALTA PRESIÓN O ALTA RESOLUCIÓN )

4
2
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CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA (CAPA FINA) QUE TAMBIÉN INCLUYE LA

FASE ESTACIONARIA
• ES UN MATERIAL SECO Y REDUCIDO A POLVO QUE SE APLICA DE MANERA
UNIFORME SOBRE UNA CAPA PLANA ( VIDRIO, PLÁSTICO O METAL). PUEDEN TENER
UNA ZONA PRE-ADSORBENTE. LA MUESTRA APLICADA EN LA REGIÓN PRE-
ADSORBENTE SE DESARROLLA EN BANDAS ESTRECHAS Y DEFINIDAS EN LA REGIÓN
ENTRE EL PRE-ADSORBENTE Y EL SORBENTE
• TAMAÑO DE PARTÍCULA: TLC 10-15 MICRAS Y EN HPTLC 5 MICRAS
APARATO
CONSISTE EN UNA CÁMARA CROMATOGRÁFICA DE MATERIAL INERTE Y TRANSPARENTE:
• CUBETA DE FONDO PLANO O CUBETAS GEMELAS
• UNA TAPA DE CIERRE HERMÉTICO
• REVESTIR COMO MÍNIMO UNA PARED DE LA CÁMARA CON PAPEL DE FILTRO
• AGREGAR UNA CANTIDAD SUFICIENTE DE FASE MÓBIL A LA CÁMARA
CROMATOGRÁFICA PARA QUE SE IMPREGNE EL PAPEL DE FILTRO, Y PROPORCIONE
UN NIVEL DE PROFUNDIDAD APROPIADO A LA DIMENSIÓN DE LA PLACA UTILIZADA
• CERRAR LA CÁMARA Y DEJAR QUE SE EQUILIBRE O SE SATURE

5

Fase Estacionaria
Placa plana
Aluminio, Vidrio,
Plástico Cámara de Elución
Sílica Gel, Celulosa,
Óxido de Aluminio,
Saturada
Poliamidas
Separador
Punto de inyección Fase Móbil

Solvente
Nivel del Solvente

6
3
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SIEMBRA
• LAS SOLUCIONES A SEPARAR SE APLICAN EN PEQUEÑOS VOLÚMENES EN FORMA DE
PUNTOS O ZONAS EN LA FASE ESTACIONARIA PARA OBTENER CÍRCULOS DE 1-2 mm
EN TLC Y DE 1-2 mm EN HPTLC, O EN BANDAS DE 10-20 mm X 1-2 mm EN TLC Y DE
5-10 mm X 0,5-1 mm EN HPTLC
• LA DISTANCIA ADECUADA DEL BORDE INFERIOR Y DE LOS BORDES LATERALES
• LA POSICIÓN DE LA APLICACIÓN A 5 mm EN TLC Y A 3 mm EN HPTLC POR ENCIMA
DEL NIVEL DE LA FASE MÓBIL
• LA SEPARACIÓN ENTRE LAS APLICACIONES DE MÍNIMO 10 mm TLC Y DE 5 mm EN
HPTL ENTRE LOS CENTROS DE LAS MANCHAS Y DE 4 mm EN TLC Y DE 2 mm EN
HPTLC ENTRE LOS BORDES DE LAS BANDAS
• DESPUÉS DE APLICAR DEJAR QUE SE SEQUEN
DETECCIÓN / VISUALIZACIÓN DE LAS MANCHAS

• UTILIZAR UNA FUENTE DE LUZ UV PARA LAS OBSERVACIONES DE LONGITUD DE
ONDA CORTA (254 nm) Y PARA ONDA LARGA (365 nm)
• SOLUCIONES REVELADORAS PARA VISUALIZAR LAS MANCHAS

7

Frente del Solvente

R1(A)=dA/dS
R1(B)=dB/dS
dA dB
dS
1cm
A B Punto de inyección

8
4
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PROCEDIMIENTO
• COLOCAR LA PLACA EN LA CÁMARA SATURADA, ASEGURANDO QUE LAS MANCHAS O
BANDAS ESTÉN POR ENCIMA DE LA SUPERFICIE DE LA FASE MÓBIL
• CERRAR LA CÁMARA
• DEJAR QUE LA FASE MÓBIL ASCIENDA EN LA PLACA HASTA QUE SU FRENTE HAYA
RECORRIDO TRES CUARTOS DE LA LONGITUD DE LA PLACA O LA DISTANCIA
INDICADA EN LA MONOGRAFÍA
• RETIRAR LA PLACA, MARCAR EL FRENTE DE LA FASE MÓBIL Y DEJAR QUE SEQUE
• VISUALIZAR LOS CROMATOGRAMAS SEGÚN SE INDICA
• DETERMINAR LOS VALORES DEL FACTOR DE RETARDO R1 CROMATOGRÁFICO
PARA LAS MANCHAS O ZONAS PRINCIPALES
• SE PUEDE REALIZAR UNA IDENTIFICACIÓN PRELIMINAR O SEMI-CUANTITATIVA DE
LAS MANCHAS O ZONAS CON LOS VALORES R1 IDÉNTICOS Y CON MAGNITUD
SIMILAR, POR COMPARACIÓN DE UNA MUESTRA DESCONOCIDA Y UN ESTÁNDAR
SEMBRADOS EN LA MISMA PLACA
• LAS MEDICIONES CUANTITATIVAS SE PUEDEN EFECTUAR MEDIANTE
DENSITOMETRÍA, POR ABSORBANCIA O FLUORESCENCIA
9
CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS PRESURIZADOS (HPLC)

CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA PRESIÓN
O CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA RESOLUCIÓN
LA SEPARACIÓN SE REALIZA MEDIANTE PROCESOS DE
PARTICIÓN, ADSORCIÓN O INTERCAMBIO IÓNICO
UNA FASE ESTACIONARIA SÓLIDA Y UNA FASE MÓBIL LÍQUIDA
FASE ESTACIONARIA
COLUMNA CROMATOGRÁFICA
FASE MÓBIL
ELUCIÓN EN GRADIENTE
EQUIPO DE ANÁLISIS (CROMATÓGRAFO)
PROCEDIMIENTO EN GENERÁL

10
5
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CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS (HPLC)
FASE ESTACIONARIA
• SÍLICE MODIFICADA
• PERLAS DE POLÍMERO DE TAMAÑO DETERMINADO, MODIFICADAS CON
HIDROCARBUROS DE CADENA LARGA ( SEGÚN LA MONOGRAFÍA INDIVIDUAL)
COLUMNA CROMATOGRÁFICA
• SON COLUMNAS DE ACERO INOXIDABLE , DE ACERO INOXIDABLE CON
RECUBRIMIENTO INTERNO Y POLIMÉRICAS
• RELLENAS CON UNA FASE ESTACIONARIA
• LONGITUD Y DIÁMETRO INTERNO (MÉTODO O MONOGRAFÍA INDIVIDUAL)
PRE-COLUMNAS (PROTEGEN LA COLUMNA)

• LA LONGITUD < 15 % DE LA LONGITUD DE LA COLUMNA
• EL DIÁMETRO INTERNO =/< DEL DIÁMETRO DE LA COLUMNA
• EL MISMO MATERIAL DE RELLENO DE LA COLUMNA
• (EJEMPLO, SÍLICE Y FASE LIGADA C18)
• CUMPLIR LA APTITUD DEL SISTEMA

11
FASE MÓBIL
ES UN DISOLVENTE O MEZCLA DE DISOLVENTES
ELUCIÓN POR MÉTODO ISOCRÁTICO

SON AQUELLAS SEPARACIONES DONDE LA CONCENTRACIÓN Ó
COMPOSICIÓN DE LA FASE MÓBIL PERMANECE CONSTANTE
ELUCIÓN EN GRADIENTE
ES LA VARIACIÓN GRADUAL DE LA CONCENTRACIÓN Ó COMPOSICIÓN DE LA FASE MÓBIL
DURANTE LA CORRIDA, CON EL OBJETO DE LOGRAR LA SEPARACIÓN Y ELUCIÓN DE TODOS
LOS COMPUESTOS PRESENTES EN LA MUESTRA
PROGRAMACIÓN DEL DISOLVENTE,
ES LA TÉCNICA DE CAMBIAR LA COMPOSICIÓN DEL DISOLVENTE DURANTE LA
CROMATOGRAFÍA. EL PERFIL DE ELUCIÓN EN GRADIENTE
SE PRESENTA COMO UNA TABLA DE GRADIENTES (EN LA MONOGRAFÍA),
QUE INDICA EL TIEMPO Y LA COMPOSICIÓN PROPORCIONAL DE LA FASE MÓBIL
EN EL TIEMPO INDICADO

12
6
25/1/22
LA ELUCIÓN EN GRADIENTE SE UTILIZA EN LOS SIGUIENTES CASOS:
Ø PARA MATRICES MUY COMPLEJAS, EN LAS CUÁLES NO SE PRODUCE

RESOLUCIÓN DE LOS COMPUESTOS AL TRABAJAR CON FASE MÓBIL DE
COMPOSICIÓN CONSTANTE, O SISTEMA ISOCRÁTICO
Ø CUANDO EN UNA MUESTRA EXISTEN DIFERENCIAS DE POLARIDAD O EN

FUERZA IÓNICA ENTRE LOS COMPUESTOS QUE SE QUIERE ANALIZAR DE
FORMA QUE SE TIENEN DOS CASOS:
a. BUENA RESOLUCIÓN AL PRINCIPIO Y MALA RESOLUCIÓN AL FINAL DEL
CROMATOGRAMA
b. MALA RESOLUCIÓN AL INICIO Y BUENA RESOLUCIÓN AL FINAL DEL
CROMATOGRAMA
Ø CON EL FÍN DE ACORTAR TIEMPOS DE ANÁLISIS, CUANDO LAS SUSTANCIAS

QUE ACOMPAÑAN LA MUESTRA DE ANÁLISIS ELUYEN CON TIEMPOS MÁS
LARGOS QUE EL COMPUESTO DE INTERÉS

13
CROMATÓGRAFO DE LÍQUIDOS (HPLC)

• RECIPIENTE QUE CONTIENE LA FASE MÓBIL
• UNA BOMBA PARA FORZAR EL PASO DE LA FASE MÓBIL A TRAVÉS DEL SISTEMA DE
ALTA PRESIÓN
• UN INYECTOR PARA INTRODUCIR LA MUESTRA EN LA FASE MÓBIL
• UNA COLUMNA CROMATOGRÁFICA
• UN DETECTOR
• SISTEMA PARA LA RECOLECCIÓN DE LOS DATOS
PROCEDIMIENTO
• EQUILIBRAR LA COLUMNA Y EL DETECTOR CON LA FASE MÓBIL A LA VELOCIDAD DE
FLUJO SEGÚN LA ESPECIFICACIÓN
• OBTENER UNA SEÑAL CONSTANTE
• INYECTAR LA MUESTRA A TRAVÉS DEL INYECTOR O MUESTREADOR AUTOMÁTICO
• SI APLICA, COMENZAR EL PROGRAMA DE GRADIENTES
• OBTENER EL REGISTRO DEL CROMATOGRAMA
• REALIZAR EL ANÁLISIS SEGÚN EL MÉTODO O MONOGRAFÍA

14
7
25/1/22
CONCEPTOS E INTERPRETACIÓN DE LOS CROMATOGRAMAS
EL CROMATOGRAMA ES LA REPRESENTACIÓN GRÁFICA

DE LA RESPUESTA DEL DETECTOR,
CORRESPONDE A LA CONCENTRACIÓN DEL ANALITO EN EL EFLUENTE
EN FUNCIÓN DEL VOLÚMEN DEL EFLUENTE
O DEL TIEMPO

15
SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA DE DOS SUSTANCIAS
MÉTODO, RESPUESTA, SEÑAL, TRANSFORMACIÓN DE DATOS, RESULTADO
F
R P Tm: ,empo muerto
E I tR: ,empo de Retención
C
R N
O
E T
S E D
C
O
P I I
L
U F S
N A O
A
E Y
S L
D
S E E V
T C I
E
A C M N
S
O
h
I O T
L
D Ó E
B V
W1/2
E N I E
T L N
E
T
E
h/2
C W1 W2
T
O tM tR1
R
tR2
TIEMPO DE ELUCIÓN (MINUTOS)

16
8
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CROMATOGRAMAS (HPLC)
VOLÚMEN DE RESIDENCIA (D)

• ES EL VOLÚMEN ENTRE EL PUNTO EN EL QUE SE ENCUENTRAN LOS ELUYENTES Y LA
ENTRADA DE LA COLUMNA; EN ELUCIÓN A GRADIENTE SE LLAMA VOLÚMEN DE
DEMORA EN ELUCIÓN
TIEMPO MUERTO ( tM)

• ES EL TIEMPO REQUERIDO PARA LA ELUCIÓN DE UN COMPONENTE NO RETENIDO,
EN MINUTOS
VOLÚMEN MUERTO (VM)

• ES EL VOLÚMEN DE LA FASE MÓBIL REQUERIDO PARA ELUIR UN COMPONENTE NO
RETENIDO, SE PUEDE CALCULAR A PARTIR DEL TIEMPO MUERTO Y DE LA
VELOCIDAD DE FLUJO (F) EN mL/minuto
• VM = tM x F
• EN LA CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN POR TAMAÑO SE UTILIZA EL SÍMBOLO Vo
EN LUGAR DE VM

17
NÚMERO DE PLATOS TEÓRICOS (N) EFICIENCIA DE LA COLUMNA

• ES UNA MEDIDA DE LA EFICIENCIA DE LA COLUMNA QUE DEPENDE DE LA
SUSTANCIA, DE LAS CONDICIONES OPERATIVAS COMO LA VELOCIDAD DE FLUJO
Y LA TEMPERATURA DE LA FASE MÓBIL, LA CALIDAD Y UNIFORMIDAD DEL
RELLENO DENTRO DE LA COLUMNA, Y PARA COLUMNAS CAPILARES DEPENDE DE
SU LONGITUD, EL DIÁMETRO INTERNO Y EL ESPESOR DE LA PELÍCULA DE LA FASE
ESTACIONARIA. PARA LOS PICOS GAUSSIANOS SE CALCULA CON LA SIGUIENTE
ECUACIÓN
2
N = 16 tR / W
• CUANDO SE UTILIZAN INTEGRADORES ELECTRÓNICOS SE CALCULA CON LA

SIGUIENTE ECUACIÓN:
• 2
N = 5,54 tR
Wh/2
tR: TIEMPO DE RETENCIÓN DE LA SUSTANCIA
W: ANCHO DEL PICO EN SU BASE
Wh/2: ANCHO DEL PICO A MITAD DE LA ALTURA
18
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PICO
LA PORCIÓN DEL CROMATOGRAMA QUE REGISTRA LA RESPUESTA DEL DETECTOR
CUANDO UN COMPONENTE INDIVIDUAL ELUYE DE LA COLUMNA.
SI LA SEPARACIÓN ES INCOMPLETA SE PUEDE REGISTRAR LA ELUCIÓN DE DOS O MÁS
COMPONENTES COMO UN PICO NO RESUELTO
RELACIÓN PICO/VALLE (p/v)

SE PUEDE UTILIZAR COMO UN CRITERIO DE LA APTITUD DEL SISTEMA, EN UNA
PRUEBA DE SUSTNACIAS RELACIONADAS CUANDO NO SE LOGRA LA SEPARACIÓN
ENTRE DOS PICOS EN LA LÍNEA BASE
p/v = Hp / Hv
Hp
Hv

19
RETENCIÓN RELATIVA ( r )
ES EL COCIENTE ENTRE EL TIEMPO DE RETENCIÓN AJUSTADO DE UN COMPONENTE Y
EL DE OTRO USADO COMO REFERENCIA OBTENIDO EN CONDICIONES IDÉNTICAS
r = ( tR2 - tM ) / ( tR1- tM )
tR2: TIEMPO DE RETENCIÓN DESDE EL PUNTO DE INYECCIÓN DEL COMPUESTO DE

INTERÉS
tR1: TIEMPO DE RETENCIÓN DESDE EL PUNTO DE INYECCIÓN DEL COMPUESTO DE
REFERENCIA
tM: TIEMPO DE RETENCIÓN DE UN MARCADOR NO RETENIDO, DEFINIDO EN EL
PROCEDIMIENTO, TODOS DETERMINADOS EN CONDICIONES IDÉNTICAS EN LA MISMA
COLUMNA
TIEMPO DE RETENCIÓN RELATIVO (RRT, o rG)

ES EL TIEMPO RELATIVO NO AJUSTADO
RRT = tR2 / tR1

20
10
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DESVIACIÓN ESTÁNDAR RELATIVA PORCENTUAL
Desviación estándar x 100

%RSD =
X promedio
FACTOR DE RETENCIÓN ó FACTOR DE CAPACIDAD (k)
Cantidad de sustancia en la Fase Estacionaria

K=
Cantidad de sustancia en la Fase Móbil
Tiempo de la sustancia en la Fase Estacionaria

K=
Tiempo de la sustancia en la Fase Móbil

21
FACTOR DE RETENCIÓN ó FACTOR DE CAPACIDAD (k)

SE PUEDE DETERMINAR A PARTIR DEL CROMATOGRAMA
K = ( tR – tM ) / tM
TIEMPO DE RETENCIÓN ( tR )
ES EL TIEMPO QUE TRANSCURRE ENTRE LA INYECCIÓN DE LA MUESTRA Y LA
APARICIÓN DE LA RESPUESTA MÁXIMA. PUEDE USARSE COMO UN PARÁMETRO DE
IDENTIFICACIÓN, LOS TIEMPOS DE RETENCIÓN CROMATOGRÁFICOS SON
CARACTERÍSTICOS DE LOS COMPUESTOS QUE REPRESENTAN PERO NO SON ÚNICOS.
LOS TIEMPOS DE RETENCIÓN ABSOLUTOS DE UN COMPUESTO DADO VARÍAN DE UN
CROMATOGRAMA A OTRO.
VOLÚMEN DE RETENCIÓN ( V2 )
ES EL VOLÚMEN DE FASE MÓBIL REQUERIDO PARA LA ELUCIÓN DE UN COMPONENTE.
SE PUEDE CALCULAR A POARTIR DEL TIEMPO DE RETENCIÓN Y DE LA VELOCIDAD DE
FLUJO EN mL/minuto

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11
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VOLÚMEN DE RETENCIÓN ( VR )
ES EL VOLÚMEN DE FASE MÓBIL REQUERIDO PARA LA ELUCIÓN DE UN COMPONENTE.
SE PUEDE CALCULAR A PARTIR DEL TIEMPO DE RETENCIÓN Y DE LA VELOCIDAD DE
FLUJO EN mL/minuto
Flujo = Volúmen / Tiempo
VR = tR x F
RESOLUCIÓN ( Rs )
ES LA SEPARACIÓN DE DOS COMPONENTES EN UNA MEZCLA
Rs = 2 x ( tR2 – tR1 ) / ( W1 + W2 )
tR1 y tR2: TIEMPOS DE RETENCIÓN DE DOS COMPONENTES
W1 y W2: ANCHOS DE LOS PICOS EN LA BASE
CUANDO SE USAN INTEGRADORES ELECTRÓNICOS:

Rs = 1,18 x ( tR2 – tR1 ) / ((W1, h/2) + (W2, h/2))

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FACTOR DE SEPARACIÓN (alfa )

ES LA RETENCIÓN RELATIVA CALCULADA PARA DOS PICOS ADYACENTES, POR
CONVENCIÓN SIEMPRE ES > 1
Factor de separación = k2 / k1
k1= factor de retención del componente 1

k2= factor de retención del componente 2
FACTOR DE SIMETRÍA Ó DE ASIMETRÍA (As) DE UN PICO
As = W0.05 / 2f
W0.05 : es el ancho del pico a l 5 % de la altura

F : distancia del máximo del pico hasta el borde inicial del pico, midiendo la distancia en un
punto ubicado al 5 % de la altura desde la línea base

24
12
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FACTOR DE SIMETRÍA Ó DE ASIMETRÍA (As) DE UN PICO
F
R
E
N
T
E
COLA DEL PICO h
P
I
C
O 0,05h
F W0,05 5% de la altura del pico
MÁXIMO DEL PICO

25
APTITUD DEL SISTEMA
LAS PRUEBAS DE APTITUD DEL SISTEMA
SON UNA PARTE INTEGRAL DE LOS MÉTODOS DE CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS Y

GASES Y SE USAN PARA VERIFICAR QUE EL SISTEMA CROMATOGRÁFICO ES ADECUADO
PARA EL ANÁLISIS QUE SE VA A EFECTUAR
v LAS PRUEBAS SE BASAN EN QUE EL EQUIPO, LA PARTE ELECTRÓNICA, LAS

OPERACIONES DE ANÁLISIS Y LAS MUESTRAS A SER ANALIZADAS CONSTITUYEN UN
SISTEMA INTEGRAL Y SE PUEDE EVALUAR COMO TAL
v LAS PRUEBAS DE APTITUD DEL SISTEMA SE REALIZAN RECOLECTANDO DATOS A

PARTIR DE INYECCIONES REPETIDAS DEL ESTÁNDAR U OTRAS SOLUCIONES SEGÚN
LO ESPECIFIQUE LA MONOGRAFÍA INDIVIDUAL
v LA ESPECIFICACIÓN DE PARÁMETROS DEFINIDOS EN UNA MONOGRAFÍA NO EXCLUYE

EL USO DE OTRAS CONDICIONES DE OPERACIÓN APTAS PARA EL ANÁLISIS

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13
25/1/22
APTITUD DEL SISTEMA
FACTORES QUE PUEDEN AFECTAR EL COMPORTAMIENTO CROMATOGRÁFICO
v FASE MÓBIL: COMPOSICIÓN, FUERZA IÓNICA, pH y TEMPERATURA

v COLUMNA: DIMENSIONES, TEMPERATURA, PRESIÓN Y VELOCIDAD DE FLUJO
v FASE ESTACIONARIA: CARACTERÍSTICAS INCLUYENDO EL TIPO DE SOPORTE
CROMATOGRÁFICO, TAMAÑO DE PARTÍCULA, TAMAÑO DE PORO Y ÁREA SUPERFICIAL
ESPECÍFICA
v EN LA FASE REVERSA Y OTRAS MODIFICACIONES SUPERFICIALES DE LAS FASES
ESTACIONARIAS, EL GRADO DE MODIFICACIÓN QUÍMICA POR EJEMPLO CARGA DE
CARBONO

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APTITUD DEL SISTEMA
FACTORES QUE PUEDEN AFECTAR EL COMPORTAMIENTO CROMATOGRÁFICO
v LA RESOLUCIÓN Rs , ES UNA FUNCIÓN DEL NÚMERO DE PLATOS TEÓRICOS

v LA EFICIENCIA DE LA COLUMNA, N
v EL FACTOR DE SEPARACIÓN, alfa
v EL FACTOR DE CAPACIDAD, k
Ø PARA UNA FASE MÓBIL Y UNA FASE ESTACIONARIA DETERMINADAS, SE PUEDE

ESPECIFICAR N PARA ASEGURAR QUE LOS COMPUESTOS QUE ELUYEN MUY CERCA
ENTRE SÍ, SE RESUELVAN UNOS DE OTROS, PARA ESTABLECER EL PODER DE
RESOLUCIÓN GENERÁL DEL SISTEMA, Y PARA ASEGURAR QUE EL ESTÁNDAR INTERNO
SE RESUELVA DEL FÁRMACO
Ø LA EFICIENCIA DE LA COLUMNA ES EN PARTE UN REFLEJO DE LA AGUDEZA DEL PICO

Ø ES IMPORTANTE EN LA DETECCIÓN DE TRAZAS DE COMPONENTES

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14
25/1/22
APTITUD DEL SISTEMA
PRECISIÓN EN LAS PRUEBAS DE APTITUD DEL SISTEMA
Ø LAS INYECCIONES REPETIDAS DE UNA PREPARACIÓN ESTÁNDAR U OTRAS

SOLUCIONES ESTÁNDAR SE COMPARAN ENTRE SÍ PARA DETERMINAR SI SE CUMPLEN
LOS REQUISITOS DE PRECISIÓN
Ø SE USAN LOS DATOS DE 5 INYECCIONES REPETIDAS DEL ANALITO PARA CALCULAR LA

DESVIACIÓN ESTÁNDAR RELATIVA, % RSD, SI EL REQUISITO ES 2 % O MENOS, SINO
SE ESPECIFICA ALGO DIFERENTE EN LA MONOGRAFÍA INDIVIDUAL
Ø SE USAN LOS DATOS DE 6 INYECCIONES REPETIDAS DEL ANALITO PARA CALCULAR LA

DESVIACIÓN ESTÁNDAR RELATIVA, % RSD, SI EL REQUISITO ES MÁS DE 2 %

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APTITUD DEL SISTEMA
PRECISIÓN EN LAS PRUEBAS DE APTITUD DEL SISTEMA
Ø CUANDO EL VALOR PARA LA SUSTANCIA PURA ES 100 % Y NO SE ESPECIFICA UNA

DESVIACIÓN ESTÁNDAR RELATIVA MÁXIMA, ÉSTA SE CALCULA PARA UNA SERIE DE
INYECCIONES DE LA SOLUCIÓN DE REFERENCIA CON LA SIGUIENTE FÓRMULA:
% RSD = K . B n / t 90%, n-1
K= 0,349
B= Es el límite superior provisto en la definición de la monografía individual menos 100 %
N= es el número de inyecciones repetidas de la solución de referencia
(3 </= n>/=6)
T 90 %, n-1= es el valor t de Student al 90 % del nivel de probabilidad de dos colas con
(n-1) grados de libertad
Consultar tabal de Repetibilidad USP <621>

30
15
25/1/22
APTITUD DEL SISTEMA
FACTOR DE ASIMETRÍA (As)
Ø PARA PICOS SIMÉTRICOS SU VALOR ES: 1

Ø SU VALOR SE INCREMENTA PARA PICOS ASIMÉTRICOS
Ø A MEDIDA QUE SE ALEJA DEL VALOR 1, LA INTEGRACIÓN Y LA PRESCICIÓN SON
MENOS CONFIABLES
LA RELACIÓN SEÑAL –RUIDO S/N ES UN PARÁMETRO ÚTIL DE LA APTITUD DEL SISTEMA
S/N = 2H/ h
H: Es la altura del pico desde el ápice del pico hasta la línea base extrapolada
sobre una distancia >/= 5 veces el ancho del pico a su altura media
h: es la diferencia entre el valor del ruido más grande y más pequeño observado
sobre una distancia >/= 5 veces el ancho del pico a su altura media

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VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS

LÍMITE DE DETECCIÓN Y LÍMITE DE CUANTIFICACIÓN

32
16
25/1/22
APTITUD DEL SISTEMA

AJUSTES AL SISTEMA CROMATOGRÁFICO
v SE PUEDEN REALIZAR AJUSTES AL SISTEMA CROMATOGRÁFICO ESPECIFICADO, PARA

CUMPLIR CON LOS REQUISITOS DE APTITUD DEL SISTEMA
v ÉSTOS AJUSTES NO DEBEN HACERSE PARA COMPENSAR FALLAS EN LA COLUMNA, O

UN MALFUNCIONAMIENTO DEL SISTEMA
v SE PERMITEN LOS AJUSTES CUANDO SE DISPONE DE ESTÁNDARES ADECUADOS

INCLUIDOS LOS DE REFERENCIA PARA TODOS LOS COMPUESTOS USADOS EN LA
PRUEBA DE APTITUD, Y CUANDO LOS AJUSTES GENERAN UN CROMATOGRAMA QUE
CUMPLE CON TODOS LOS REQUISITOS DE APTITUD DEL SISTEMA ESPECIFICADOS EN
EL PROCEDIMIENTO OFICIAL

33
APTITUD DEL SISTEMA

Ø SI ES NECESARIO HACER AJUSTE A LAS CONDICIONES OPERATIVAS PARA CUMPLIR

CON LOS REQUISITOS DE APTITUD DEL SISTEMA, SE DEBE CONSIDERAR UNA
VARIACIÓN MÁXIMA PERMITIDA A MENOS QUE SE INDIQUE ALGO DIFERENTE EN LA
MONOGRAFÍA INDIVIDUAL
Ø SE DEBEN EVALUAR LAS CARACTERÍSTICAS DE DESEMPEÑO ANALÍTICO QUE

PUDIERON SER AFECTADAS CON LOS CAMBIOS
Ø VARIOS AJUSTES PUEDEN TENER UN EFECTO ACUMULATIVO EN EL DESEMPEÑO DEL

SISTEMA Y SE DEBEN TENER EN CUENTA ANTES DE IMPLEMENTARLOS
Ø COLUMNAS DE HPLC: CAMBIAR LAS DIMENSIONES POR EJEMPLO LONGITUD,

DIÁMETRO INTERNO, TAMAÑO DE PARTÍCULA
Ø CAMBIOS EN LA COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LA FASE ESTACIONARIA, SE CONSIDERAN

UNA MODIFICACIÓN DEL MÉTODO Y REQUIEREN UNA VALIDACIÓN COMPLETA

34
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25/1/22
APTITUD DEL SISTEMA

ELUCIÓN POR GRADIENTE
Ø NO SE RECOMIENDA HACER AJUSTES A LA COMPOSICIÓN DE LA FASE MÓBIL YA QUE

PUEDE CAMBIAR LA SELECTIVIDAD
Ø SI SE REQUIEREN AJUSTES SE PUEDEN HACER CAMBIOS EN EL RELLENO DE LA
COLUMNA, MANTENIENDO LAS MISMAS PROPIEDADES QUÍMICAS, EN LA DURACIÓN
DEL TIEMPO ISOCRÁTICO INICIAL CUANDO SE INDIQUE Y/O AJUSTES EN EL VOLÚMEN
DE RESIDENCIA
Ø pH DE LA FASE MÓBIL HPLC PARA SEPARACIONES EN GRADIENTE ISOCRÁTICAS: SE
PUEDE AJUSTAR EL pH DE LA SOLUCIÓN AMORTIGUADORA DENTRO DE +/_ 0,2
UNIDADES DEL VALOR O INTERVALO ESPECIFICADO
Ø CONCENTRACIÓN DE SALES EN LA SOLUCIÓN AMORTIGUADORA HPLC PARA
SEPARACIONES EN GRADIENTE ISOCRÁTICAS: SE PUEDEN AJUSTR EN +/_ 10 %

35
APTITUD DEL SISTEMA

FASE ESTACIONARIA / TAMAÑO DE PARTÍCULA HPLC:

Ø PARA SEPARACIONES ISOCRÁTICAS SE PUEDE MODIFICAR EL TAMAÑO DE PARTÍCULA
(dP) O LA LONGITUD DE LA COLUMNA (L), SIEMPRE QUE LA RELACIÓN L/dp
PERMANEZCA CONSTANTE O ENTRE EL INTERVALO -25% y +50%.
Ø EL NÚMERO DE PLATOS TEÓRICOS (N) DEBE PERMANECER EN ESE INTERVALO CON

RESPECTO A LA COLUMNA PRESCRITA
Ø SE DEBE TENER CUIDADO CUANDO EL AJUSTE RESULTE EN UN NÚMERO MAYOR DE

PLATOS TEÓRICOS, PUES ÉSTO GENERA VOLÚMENES DE PICO MENORES Y PUEDE
REQUERIR AJUSTES PARA MINIMIZAR EL ENSANCHAMIENTO DE LA BANDA
Ø CUANDO NO SE MENCIONA EL TAMAÑO DE PARTÍCULA EN LA MONOGRAFÍA, LA

RELACIÓN SE DEBE CALCULAR TENIENDO EN CUENTA EL TAMAÑO DE PARTÍCULA MÁS
GRANDE DE LA COLUMNA DESIGNADO EN LA USP
Ø PARA SEPARACIONES EN GRADIENTE NO SE PERMITEN CAMBIOS EN LA LONGITUD DE

LA COLUMNA, EN SU DIÁMETRO INTERNO NI EN EL TAMAÑO DE LA PARTÍCULA

36
18
25/1/22
APTITUD DEL SISTEMA

VELOCIDAD DE FLUJO (HPLC)

Ø CUANDO SE MODIFICA EL TAMAÑO DE PARTÍCULA PUEDE SER NECESARIO AJUSTAR
LA VELOCIDAD DE FLUJO DEBIDO A QUE LAS COLUMNAS CON UN TAMAÑO DE
PARTÍCULA MENOR, REQUERIRÁN VELOCIDADES LINEALES MUY ALTAS PARA LOGRAR
EL MISMO DESEMPEÑO (MEDIDO POR UNA REDUCCIÓN DEL TAMAÑO DEL PLATO)
Ø LOS CAMBIOS EN LA VELOCIDAD DE FLUJO PARA UN CAMBIO EN EL TAMAÑO DE

PARTÍCULA SE PUEDEN REALIZAR MEDIANTE LA SIGUIENTE FÓRMULA:
2 2
F2 = F1 x (( dc2 x dp1) / (dc1 x dp2))
F1 y F2: Velocidades de Flujo para las condiciones originales y modificadas

dc1 y dc2: Diámetros de columna respectivos
dp1 y dp2: Tamaños de partícula

37
APTITUD DEL SISTEMA


Ø CUANDO SE REALIZA UN CAMBIO DE PARTÍCULA DE >/= 3 micras, EN
SEPARACIONES ISOCRÁTICAS, SE PUEDE JUSTIFICAR UN AUMENTO EN LA VELOCIDAD
LINEAL AJUSTANDO LA VELOCIDAD DE FLUJO, SIEMPRE QUE LA EFICIENCIA DE LA
COLUMNA NO CAIGA EN MÁS DEL 20%.
Ø UN CAMBIO DE PARTÍCULAS DE <3 micras A >/= 3 micras, PUEDE REQUERIR LA

REDUCCIÓN DE LA VELOCIDAD DE FLUJO, PARA EVITAR UNA REDUCCIÓN DE LA
EFICIENCIA DE LA COLUMNA MAYOR AL 20%.
Ø NO SE PERMITEN CAMBIOS EN F, dc, dp PARA SEPARACIONES EN GRADIENTE

38
19
25/1/22
APTITUD DEL SISTEMA


Ø EN SEPARACIONES ISOCRÁTICAS LA VELOCIDAD DE FLUJO SE IUEDE AJUSTAR EN UN
50 %
Ø LOS AJUSTES EN LA LONGITUD DE LA COLUMNA, EL DIÁMETRO INTERNO, EL TAMAÑO

DE PARTÍCULA, Y LA VELOCIDAD DE FLUJO SE PUEDEN USAR DE MANERA COMBINADA
PARA PROVEER CONDICIONES EQUIVALENTES (EL MISMO (N) NÚMERO DE PLATOS
TEÓRICOS Ó EFICIENCIA DE LA COLUMNA), PERO CON DIFERENCIAS EN LA PRESIÓN
Y EL TIEMPO DE CORRIDA
Ø CONSULTAR TABLA DE LAS CONFIGURACIONES DE COLUMNA PARA PROVEER UNA

EFICIENCIA EQUIVALENTE (N) AJUSTANDO VARIAS VARIABLES. USP<621>
• LONGITUD (L) mm
• DIÁMETRO DE LA COLUMNA (dc) mm
• TAMAÑO DE PARTÍCULA (dp) micras
• (L/dp)
• F= FLUJO
• N= PLATOS TEÓRICOS
• PRESIÓN
• TIEMPO DE CORRIDA
39
APTITUD DEL SISTEMA

VOLÚMEN DE INYECCIÓN HPLC

Ø SE PUEDE AJUSTAR SIEMPRE QUE SEA CONGRUENTE CON LA PRECISIÓN, LA
LINEALIDAD Y LOS LÍMITES DE DETECCIÓN ACEPTADOS
Ø SE DEBE TENER EN CUENTA QUE UN VOLÚMEN EXCESIVO DE INYECCIÓN PUEDE

OCASIONAR EL ENSANCHAMIENTO INACEPTABLE DE LA BANDA, OCASIONANDO UNA
REDUCCIÓN EN PLATOS TEÓRICOS (N) O EN LA RESOLUCIÓN
Ø APLICA EN LAS SEPARACIONES EN GRADIENTE E ISOCRÁTICAS

40
20
25/1/22
APTITUD DEL SISTEMA

TEMPERATURA DE LA COLUMNA HPLC

Ø SE PUEDE AJUSTAR EN +/_ 10°C
Ø SE RECOMIENDA QUE LA COLUMNA ESTÉ TERMOSTATADA PARA MEJORAR EL

CONTROL Y LA REPRODUCIBILIDAD DEL TIEMPO DE RETENCIÓN
Ø APLICA EN LAS SEPARACIONES EN GRADIENTE E ISOCRÁTICAS

41
APTITUD DEL SISTEMA

Ø LOS PARÁMETROS DE APTITUD DEL SISTEMA SE DETERMINAN A PARTIR DEL PICO

DEL ANALITO, A MENOS QUE SE ESPECIFIQUE ALGO DIFERENTE EN LA MONOGRAFÍA
Ø NO EXISTEN CRITERIOS DE ACEPTACIÓN REFERENTES A LOS TIEMPOS DE

RETENCIÓN RELATIVOS. LAS MONOGRAFÍAS LOS PROPORCIONAN PARA FACILITAR LA
IDENTIFICACIÓN DE LOS PICOS
Ø EL SISTEMA OPERATIVO FINAL DEBE SOMETERSE A UNA PRUEBA DE APTITUD PARA

DETERMINAR SU EFICIENCIA
Ø SE DEBEN REALIZAR INYECCIONES DE LAS PREPARACIONES APROPIADAS.
Ø LA PREPARACIÓN PUEDE SER UNA PREPARACIÓN ESTÁNDAR O UNA SOLUCIÓN QUE

CONTENGA UNA CANTIDAD CONOCIDA DE ANALITO, Y CUALQUIER MATERIAL
ADICIONAL POR EJEMPLO IMPUREZAS O EXCIPIENTES PARA EL CONTROL DEL
SISTEMA

42
Ø
21
25/1/22
APTITUD DEL SISTEMA

Ø SIEMPRE QUE HAYA UN CAMBIO SIGNIFICATIVO EN EL SISTEMA CROMATOGRÁFICO,

YA SEA EL EQUIPO, COMPONENTES DE LA FASE MÓBIL, U OTROS COMPONENTES, O
EN UNREACTIVO CRÍTICO, DEBE RE-ESTABLECERSE LA APTITUD DEL SISTEMA
Ø NINGÚN ANÁLISIS DE MUESTRAS ES ACEPTABLE, A MENOS QUE SE HAYA

DEMOSTRADO LA APTITUD DEL SISTEMA

43
CUANTIFICACIÓN
CUANTIFICACIÓN
MÉTODO DEL ESTÁNDAR INTERNO

Ø LA CONCENTRACIÓN DEL COMPONENTE CUANTIFICADO SE DETERMINA
COMPARANDO LAS RESPUESTAS OBTENIDAS A PARTIR DE LA SOLUCIÓN MUESTRA
CON LAS RESPUESTAS OBTENIDAS A PARTIR DE UNA SOLUCIÓN ESTÁNDAR
MÉTODO DEL ESTÁNDAR INTERNO
Ø SE INTRODUCEN IGUALES CANTIDADES DEL ESTÁNDAR INTERNO EN LA SOLUCIÓN

DE LA MUESTRA Y EN UNA SOLUCIÓN ESTÁNDAR
Ø EL ESTÁNDAR INTERNO NO DEBE REACCIONAR CON EL MATERIALDE PRUEBA, DEBE

RESOLVERSE DE LOS COMPONENTES CUANTIFICADOS Ó ANALITOS, Y NO DEBE
CONTENER IMPUREZAS CON EL MISMO TIEMPO DE RETENCIÓN DE LOS ANALITOS
Ø LAS CONCENTRACIONES DE LOS ANALITOS SE DETERMINAN COMPARANDO LOS

COCIENTES ENTRE LAS ÁREAS DE SUS PICOS Y EL ESTÁNDAR INTERNO EN LA
SOLUCIÓN MUESTRA, CON LOS COCIENTES ENTRE LAS ÁREAS O ALTURAS DE SUS
PICOS Y EL ESTÁNDAR INTERNO EN LA SOLUCIÓN ESTÁNDAR

44
22
25/1/22
FUENTES DE INFORMACIÓN
VALIDACIÓN DE MÉTODOS DE ANÁLISIS
1. BUENAS PRÁCTICAS DE LABORATORIO DE LA OMS PARA CONTROL

DE CALIDAD DE PRODUCTOS FARMACÉUTICOS, INFORME 44 ANEXO 1
2. USP, CROMATOGRAFÍA, CAPÍTULO <621>
4. “MANUAL DE CROMATOGRAFÍA DE ALTA EFICIENCIA PARA LA
INDUSTRIA FARMACÉUTICA”

45
www.ascolda.com
ascolda@ascolda.com;
qms@ascolda.com;
ascolda.aslaval@outlook.com;
qms.qms@outlook.com Bogotá-
Colombia; Celular: 315 3644487
46
23

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