Unidad II Microbiología General

UNIDAD II
INSTRUMENTOS Y MEDIOS DE
TRABAJO EN
MICROBIOLOGIA
CULTIVO DE MICROORGANISMOS
Se llama cultivo al proceso de propagar microorganismo
brindndoles las condiciones ambientales adecuadas.
Los factores que se deben regular durante el crecimiento son:
- Nutrimentos
-Temperatura
-Aireacin
-Concentracin de sales.
- Potencial. inica del medio.
Con objeto, de crecer, un microorganismo requiere todos los
elementos de sumatoria orgnica y el complemento total de iones
necesarios para la energtica y catlisis.
Adems debe haber una fuente de energa que establezca la fuerza
motriz protnica y permita la sntesis macromolecular.
Los microorganismos varan ampliamente en cuanto a sus
demandas nutricionales y sus fuentes de energa metablica.
Los tres mecanismos para desarrollar energa metablica son
* Fermentacin.
* Respiracin
* Fotosntesis.
1) Fermentacin : Se caracteriza por fosforilacin de sustrato,
proceso enzimtico en el cual un intermediario metablico
fosforilado dona directamente un enlace de Pirofosfato al ADP
(Difosfato de Adenosina).
2) Respiracin: La reduccin qumica de un oxidante (aceptor de
electrones) por una serie especifica de portadores de electrones en
la membrana, establece la fuerza motriz protnica a travs de la
membrana bacteriana. El agente reductor (donador de electrones)
puede ser orgnico o inorgnico.
3) Fotosntesis: La fotosntesis es semejante a la respiracin en que la

reduccin de un oxidante, por medio de una serie de portadores de
electrones, es la que establece la fuerza motriz protnica.
NUTRICION.
Fuentes de Carbono : Las plantas y algunas bacterias son capaces de
recurrir a la energa fotosinttica para reducir al dioxido de carbono a
expensas del agua.
Fuentes de Nitrgeno : EI nitrgeno es un componente de primer orden
de las protenas y los cidos nucleicos, constituyen cerca del 10% del peso
seco de la clula bacteriana tpica.
Fuentes de Azufre : AI igual que el nitrgeno, el azufre es un componente
de muchas sustancias celulares orgnicas . ( coenzimas, cisteinilo y
metiondo de proteinas).
Fuente de Fsforo: Se requiere fosfato como componentes de ATP,
cidos nucleicos y coenzimas como NAD, NADP y algunas protenas. El
fosfato se asimila siempre como fosfato inorgnico libre (P),
Fuentes de Minerales : se requieren numerosos minerales para la
funcin enzimtica. Los iones magnesio (Mg-) ferroso (Fe ),K+, Mg
, Ca y Mn , Co y Zn.
Factores de Crecimiento : Se llama factores de crecimiento a un
compuesto orgnico que debe contener una clula con el objeto de
crecer, pero que es incapaz de sintetizar.
Factores Ambientales que Afectan el Crecimiento

Un medio de cultivo adecuado debe contener todos los nutrientes
requeridos por el microorganismo que va ser cultivado y factores
tales como :
* PH
* Temperatura.
* Aireacin
Cultivos puros
La importancia del cultivo puro
Koch observ que, cuando una superficie de nutriente slido (como
una rebanada de patata) era expuesta al aire y posteriormente
incubada, se desarrollaban colonias bacterianas cada una con una
forma y color caracterstico.
Este investigador infiri que cada colonia se haba originado de una
clula bacteriana nica que creca sobre la superficie, encontrando
nutrientes adecuados e iniciando su multiplicacin.
Cultivos puros
Encontr que, si los cultivos mezclados eran extendidos en forma
de rayas sobre la superficie de nutrientes slidos, los diferentes
organismos se diseminaban y quedaban los suficientemente
separados como para producir colonias que no se mezclaban.
METODOS DE CULTIVO
MTODOS DE CULTIVO
La tcnica usada y el tipo de medio seleccionado dependen de la
naturaleza de la investigacin, se pueden presentar tres
situaciones:
1. Se puede levantar una cosecha de clulas de una especie
particular.
2. Puede ser necesario determinar el nmero y tipo de
microorganismo presentes en un material dado.
3. Se puede desear aislar un tipo particular de microorganismo de
un material natural.
METODOS DE CULTIVO
Flora bacteriana general
Para observar la flora bacteriana general de una muestra de
cualquier sustancia se utilizan medios no selectivos.
Ni un medio cualquiera, ni cualquier temperatura pueden permitir el

crecimiento de todos los posibles grmenes.
Es preferible utilizar varios medios diferentes, cada uno de ellos

favorable a un grupo distinto de organismos e incubar a varias
temperaturas, aerbica y anaerbicamente.
El pH del medio utilizado debe estar prximo al del producto que se

examina.
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METODOS DE CULTIVO
Mtodo de la placa vertida
Se funden varios tubos que contengan 15 ml de medio.
Se ponen a enfriar en bao mara a 45-50 C.
Se emulsiona el producto que se va a examinar en agua de

peptona al 0.1% y se preparan diluciones 1:10, 1:100 y 1:1.000 en
la misma solucin.
A 15 ml de medio fundido a 45 C se aade 1 ml de una de las

diluciones, se mezcla haciendo rotar el tubo entre las palmas de las
manos y se vierte en una placa de petri.
Se hacen rplicas de placa vertida para cada dilucin, para la

incubacin a temperaturas adecuadas. Se deja solidificar el medio,
se invierte la placa y se incuba.
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METODOS DE CULTIVO
Mtodo de la extensin
Se hacen diluciones del material emulsionado como se ha descrito

anteriormente.
Se ponen unos 0.05 ml (1 gota) de dilucin en el centro de una

placa y se extiende sobre el medio impulsando el extendedor hacia
delante y atrs mientras se hace girar la placa.
Se vuelve a poner la tapa de la placa de petri y se deja secar 1 o 2

minutos antes de invertir la placa e incubarla como anteriormente.
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METODOS DE CULTIVO
Mtodo del agotamiento del asa
Se hacen diluciones del producto como se ha indicado antes. Por lo
general es suficiente la emulsin original y una dilucin 1:10.
Se pone un asa cargada de material sobre el medio, cerca del

borde de la placa y se extiende sobre un sector (Figura 5.1).
Se flamea el asa y se hace la extensin desde el rea A sobre la

zona B en estras paralelas, cuidando no dejar que se solapen las
estras. Se flamea el asa y se repite en la zona C y as
sucesivamente. Cada estriacin con el asa diluye el inculo.
Las placas se invierten y se incuban.

Cuando se emplea el mtodo del agotamiento del asa, es til
disponer de dos asas; una de ellas se enfra mientras se usa la otra.
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Se dice que estos mtodos de placas en superficie dan

mejores aislamientos de anaerobios que las placas
vertidas.
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METODOS DE CULTIVO
Siembra en placas en espiral o por rotacin
Este mtodo mecnico es muy valioso para hacer placas de
grandes cantidades de muestras o cultivos y para realizar las
pruebas de sensibilidad por el mtodo de Stokes.
Se dispone de modelos que funcionan manualmente (con mesa

giratoria guiada elctricamente) y de otros totalmente
automatizados.
Con los ltimos, deben sembrarse volmenes exactos.
Para utilizar las mquinas manuales se pone la placa abierta en la

mesa giratoria.
Se toca la superficie de la placa que gira con el asa cargada en la
circunferencia exterior del medio y se la lleva lentamente hacia el
centro. Se obtendr una espiral de colonias tras la incubacin, que
presentar colonias aisladas (Figura 5.1. Diapositiva 52)
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METODOS DE CULTIVO
Inoculadoras multipuntos
Son especialmente tiles en las pruebas de sensibilidad y de
orientacin de los antibiticos.
Cultivos en tubos agitados
Son tiles para observar la formacin de colonias en la profundidad
de los tubos de agar, especialmente de organismos anaerobios o
microaerfilos.
Cultivos en picadura
Pueden utilizarse para observar la motilidad y la licuacin de la
gelatina. El medio se distribuye en cantidades de 5 ml en tubos o
frascos de 12.5 mm de dimetro y se siembran picando con el
alambre en el centro del agar.
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METODOS DE CULTIVO
Subcultivos
Para exmenes posteriores se preparan cultivos puros de diversos
tipos de colonias de los cultivos mezclados.
Se pone la placa de cultivo bajo un microscopio binocular a
pequeos aumentos y se escoge la colonia que va a examinarse.
Con un alambre recto flameado (no con el asa) se toca la colonia.
No es necesario hurgar o frotar; la manipulacin demasiado
enrgica puede dar lugar a la contaminacin con colonias
adyacentes o con las que se hallan debajo de la colonia
seleccionada.
Con el alambre cargado se toca el medio de otra placa, se flamea el
alambre y se emplea un asa para extender la siembra por
agotamiento del asa y obtener colonias aisladas.
Esta tcnica debe proporcionar un cultivo puro, aunque el proceso

puede repetirse.
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METODOS DE CULTIVO
Cultivo anaerobio
Jarros anaerbicos
Los jarros anaerbicos modernos se fabrican de metal o de plstico,
van provistos de vlvulas de Schrader y emplean catalizadores
fros.
Por tanto, son ms seguros que los primitivos modelos: las

temperaturas y presiones internas son inferiores. Se emplea ms
catalizador y se impide el escape de pequeas partculas de
catalizador, que puede inflamar la mezcla de hidrgeno y aire.
Sin embargo, el catalizador debe mantenerse seco, desecarlo

despus de su empleo y sustituirlo con frecuencia.
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METODOS DE CULTIVO
Cabinas de anaerobiosis
Son muy aconsejables en los laboratorios en los que una gran parte
del trabajo se hace con anaerobios.
Los medios de cultivo se reducen previamente, se siembran y se

incuban en una atmsfera inerte exenta de oxgeno.
La mayor parte de las cabinas recuerdan a las cabinas de seguridad

microbiolgica y estn fabricadas a un alto nivel (Whitley, Horwell,
Rayen, Heinecke).
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METODOS DE CULTIVO
Cultivos de dixido de carbono

Algunos microaerfilos crecen mejor cuando se reduce la tensin
de oxgeno.
Los grmenes de latas de conserva requieren dixido de carbono.
Para algunos fines, son adecuados los jarros de buja. Se ponen los
cultivos en una caja de galletas o en una lata de leche en polvo, con
una vela o una vela encendida.
Se cierra con la tapa. La llama se apagar cuando se haya agotado

la mayor parte del oxgeno, que se habr sustituido por dixido de
carbono.
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METODOS DE CULTIVO
Incubacin de los cultivos
En lugar de usar una estufa para el cultivo a 20-22 C, se deja al
ambiente.
Los grmenes psicrtrofos se incuban generalmente a 4-7 C.
Puede utilizarse un frigorfico domstico si no se abre con
demasiada frecuencia.
Los grmenes termfilos requieren 55-60 C.
Los cultivos en placas de petri se incuban boca abajo, es decir, con
la parte que lleva el medio arriba (excepto en los recipientes de
cultivo de anaerobios), ya que en otro caso se deposita agua de
condensacin sobre la superficie del medio e impide el desarrollo
de colonias aisladas.
Si es necesario incubar los cultivos en placas de petri durante
varios das, deben cerrarse hermticamente para impedir la
desecacin del medio. Pueden utilizarse bolsas de plstico.
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METODOS DE CULTIVO
Cultivos de estirpes microbianas

La mayora de los laboratorios necesitan cultivos de estirpes de
algunas cepas estandarizadas de microorganismos que se
utilizan en los ensayos de los medios de cultivo como controles de
determinadas pruebas o con fines de demostracin.
Estas estirpes deben subcultivarse peridicamente para

conservarlas vivas, con el consiguiente riesgo de contaminacin y,
an ms importante, la seleccin involuntaria de mutantes en los
laboratorios comprometidos en trabajos de contrastacin.
Es precisamente por las mutaciones de los cultivos bacterianos por

lo que las llamadas cepas estndares o cultivos tipo varan con
tanta frecuencia de un laboratorio a otro.
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METODOS DE CULTIVO
Para superar estas dificultades se mantienen en los laboratorios
estatales Colecciones de Cultivos Tipo.
En tales establecimientos los cultivos se conservan liofilizados y

durante el transcurso de mantenimiento de las estirpes se
comprueban para tener la seguridad de que concuerdan con las
descripciones oficiales de las cepas estandarizadas o cepas tipo.
Pueden obtenerse cultivos de microorganismos de los siguientes
Centros: National Collection of Cultures, American T Culture
Collection (ATCC).
Las que son de uso constante pueden conservarse por perodos
cortos mediante subcultivos seriados, por perodos largos por
algunos de los procedimientos de desecacin e indefinidamente por
liofilizacin. Sin embargo, cuando sea necesario renovar las
estirpes de cultivos desecados o liofilizados, es aconsejable
iniciarlos de nuevo partiendo de un cultivo de alguna de las
Colecciones Nacionales, mejor que perpetuar alguna de la estirpe
propia.
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METODOS DE CULTIVO
Subcultivos seriados
Lo principal es hacer subcultivos con la menor frecuencia posible al
objeto de mantener el cultivo vivo y detener el crecimiento tan
pronto como sea posible en la fase logartmica, evitando as la
aparicin y posible seleccin de mutantes.
Medios tiles para el mantenimiento de cultivos de estirpes de

bacterias son los de huevo de Griffith, de carne cocida de
Robertson y de leche desnatada.
Los hongos pueden mantenerse en el medio de Saboureaud.
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METODOS DE CULTIVO
Dichos medios deben estar en frascos de tapn y rosca.
Es difcil mantener cultivos de algunos organismos muy exigentes,

por ejemplo, de gonococos y es aconsejable conservarlos
liofilizados.
Se siembran dos tubos, se incuban hasta que el crecimiento sea
ostensible y activo, por ejemplo, 12-18 horas para las
enterobactericeas, otros bacilos Gram-negativos y micrococos, dos
o tres das para lactobacilos.
Se enfran los cultivos y se conservan en frigorfico durante 1-2
meses.
Uno de estos cultivos, A, se conserva como estirpe y el otro, B, se

utiliza para los fines del laboratorio.
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METODOS DE CULTIVO
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METODOS DE CULTIVO
Congelacin
Se hacen suspensiones densas de bacterias en 0.5 ml de agua del
grifo estril o leche desnatada en frascos de tapn a rosca y se
llevan a un congelador a -20 C.
De esta forma permanecen vivos muchos organismos durante

largos perodos.
Feltham , han descrito un mtodo de congelacin de suspensiones

sobre perlas de vidrio.
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METODOS DE CULTIVO
Liofilizacin
Las suspensiones de bacterias en una mezcla de 1 parte de
glucosa al 30 % en caldo nutritivo y de 3 partes de suero de caballo
comercial se congelan y despus se desecan por evaporacin al
vaco.
Este proceso conserva a las bacterias indefinidamente y se conoce

con el nombre de liofilizacin.
Las levaduras, criptococos, nocardias y estreptomicetos pueden

liofilizarse haciendo una suspensin densa en leche desnatada
estril, reforzada con 5 % de sacarosa.
Este sencillo medio protector puede esterilizarse al autoclave.

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METODOS DE CULTIVO
USO DE TEJIDOS (vegetales y animales) PARA

CULTIVO DE MICROORGANISMOS (Rickettsias y
Virus)
Desde principios del siglo XX se han logrado cultivar en
clulas animales en tubos de ensayo, matraces y
botellas y estas clulas en cultivo artificial brindan
sostn al desarrollo y la multiplicidad de prcticamente
todos los virus conocidos.
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METODOS DE CULTIVO
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METODOS DE CULTIVO
IDENTIFICACIN Y DIFERENCIACIN DE BACTERIAS.
Cultivos Puros
Segn se presenta en la naturaleza los microorganismos son una
mezcla de distintas formas, por ello suele ser muy importante
obtener nicamente microorganismos de una clase, los llamado
cultivos puros. En trminos generales deben emplearse tcnicas
especiales para obtener cultivos puros.
Identificacin de Microorganismos
Identificacin por medio de claves: Con una descripcin del
microorganismo desconocido, hasta donde sea posible. Se busca
por medio de una clave adecuada, para un microorganismo con las
mismas caractersticas.
Se han elaborado muchas claves en forma, es bastante sencillo
seguir las vas para cotejar las caractersticas por contraste y por
ltimo llegar al nombre cientfico del organismo Ejemplo: 1vs2.
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METODOS DE CULTIVO
Forma o morfologa
Para la identificacin de las colonias aisladas se siguen
procedimientos bastante especializados.
Ejemplo:
Caracteres de tincin
Caracteres de cultivo.
Caractersticas bioqumicas
La morfologa de una bacteria varia con los factores y

circunstancias en que se cultiv, es importante la edad del cultivo.
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Caracteres de cultivo
El aspecto general de los cultivos bacterianos indican la identidad
del organismo.
Descripciones de colonias en placas de agar :
Tamao.
Forma.
Color.
Elevacin.
Aspecto con la luz reflejada y luz trasmitida.
Bordes.
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METODOS DE CULTIVO
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METODOS DE CULTIVO
b) Cultivos en medio inclinado de agar.
Forma:
Filiforme.
Espinosa.
Granulosa.
Punteada.
Arborescentes.
Rizoide.
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METODOS DE CULTIVO
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METODOS DE CULTIVO
c) Cultivo en caldo.
Turbidez:
-Uniforme
-nebulosa
- Sedimento en el fondo del cultivo
-Pelcula en la superficie del cultivo.
Pueden aparecer a veces variaciones temporales en

distintas condiciones de cultivo.
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TECNICAS DE COLORACIN Y CARACTERISTICAS

MICROSCOPICAS
Estudio Microscpico de las Bacterias
Leeuwnhock y otros microbilogos de la segunda mitad del siglo
pasado tuvieron que observar microorganismos sin teir.
Ventajas: Estudio directo de las clulas vivas en su forma

disposicin y tamao natural.
Desventajas: ndice de refraccin del protoplasma de
microorganismos se acerca al del agua y por ello la clula en sus
estructuras no puede diferenciarse entre s del lquido en que estn
incluidas.
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MICROSCOPICAS
Preparaciones sin tincin

A) Montaje hmedo.
1. Se coloca en un lamina una gota de suspensin de bacterias.
2. Se coloca sobre la gota un laminilla.
3. Observar al microscopio con aumentos de poca potencia.
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MICROSCOPICAS
B) Tcnica de la gota pendiente.
1. Se emplean portaobjetos especiales con una concavidad en el
centro.
2. Se coloca vaselina en el borde de la concavidad
3. En cubreobjeto se coloca la gota de suspensin
4. Se coloca la concavidad sobre la gota y se invierte.
5. Observar con lente de poca potencia.
C) Coloracin de hongos con colorante lactofenol azul algodn.
D) Coloracin de protozoos con lugol.
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MICROSCOPICAS
E) Coloracin Bacteriana
El estudio microscpico de las bacterias se facilita notablemente al
tratarlas con colorantes o tintes.
a) Forma
b) Tamao
c) Estructura Celulares.
Los colorantes son compuestos orgnicos que contienen radicales

cromforos y de auxocromo.
a-Cromforo: producen color (-OH, -NH.,)
b- Auxocromo: que forman sales ejemplo grupos
NITRO (-NO2)
AZO (-N = N-)
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MICROSCOPICAS
Los colorantes pueden ser cidos o bases.
cidos : porcin coloreada acta como cido (material bsico)
Bases : porcin coloreada acta como base (material cido)

Mecanismos de Coloracin.
La coloracin de clulas y tejidos quiz sea una combinacin de
fenmenos fsicos y qumicos.
Fsico: adsorcin, absorcin capilaridad y osmosis.
Qumicos: afinidad del colorante bsico por los tejidos cidos y

viceversa conduce a la formacin de nuevos compuestos.
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MICROSCOPICAS
Preparacin de frotis bacteriano para coloracin
Frotis bacteriano.
Antes de la tincin, las bateras suelen encontrarse en agua u otro
lquido en un portaobjeto limpio:
a- Se extiende en una pelcula uniforme y delgada (frotis)
b. Secar al aire.
c. Fijar al portaobjetos con sustancias qumicas o por calor
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MICROSCOPICAS
Colorante simple
Solucin de colorante en agua o alcohol.
Colorantes bsicos. Ejemplo: Azul de metileno, cristal violeta.
Colorantes cidos. Ejemplo: Fucsina.
El tiempo necesario para la coloracin vara de uno a cinco

minutos.
El Frotis es lavado brevemente con agua para quitar exceso de
colorante.
Se tie durante 1 minuto con una solucin acuosa de azul de
metileno al 0,5 %.
Luego son secados en el aire, y se examina en el microscopio.
Utilidad: Para apreciar la forma, la disposicin y tamao relativo de

las bacterias.
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MICROSCOPICAS
Colorante diferencial o por contraste
Se utiliza para distinguir las estructuras intracelulares o distinguir un
tipo de clulas de otras.
Pueden emplearse dos colorantes, y en la preparacin final algunas
estructuras celulares o tipos de clulas tienen un color y el resto
otro.
El primer colorante aplicado es el colorante primario.
Despus de el suele hacerse la diferenciacin, aplicando una
solucin que quita el colorante primario a estructuras o clulas.
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MICROSCOPICAS
El otro colorante conocido como colorante secundario o de

contraste se aplica.
Ejemplo Coloracin diferencial:
1. Coloracin de endospora
2. Coloracin cido resistente.
3. Coloracin de Gram.
4. Coloracin nuclear.
5. Coloracin de la pared celular.
6. Coloracin negativa.
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MICROSCOPICAS
Coloracin de endospora.
El colorante primario en el mtodo de Schaeffer -Fulton es el verde
de malaquita colorante secundario de contraste es la safranina.
Se hace una extensin gruesa, se tie durante 3 minutos con
fuchina fenicada caliente (Ziehl-Neelsen).
Se lava, se cubre con solucin acuosa de cloruro frrico al 30 %

durante 2 minutos.
Se decolora con solucin de sulfito sdico al 5 %.
Se lava y se tie de contraste con verde de malaquita al 1 %.

Los esporos se tien de rojo
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MICROSCOPICAS
Coloracin cido resistente (Lipidos).
El mtodo de Ziehl-Neelsen emplea fuchina fenicada, alcohol cido
y una tincin de contraste en azul o verde.
Los tcnicos daltnicos deben usar como colorante de contraste el

cido pcrico.
Tincin de Gram.
Esta tcnica de tinsin es la mas utlizada en bacteriologa, segn
el se divide las bacterias en dos grandes grupos :
a. Gram+ ~ violeta)
b. Gram- (rosado)
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TECNICAS DE COLORACIN Y
CARACTERISTICAS MICROSCOPICAS
Una tincin diferencial muy importante y ampliamente usada en

bacteriologa es la denominada tincin de Gram
Estas diferencias en la tincin de Gram se deben a diferencias en la
estructura de la pared celular de las bacterias Gram positivas y
Gram negativas, de tal modo que el alcohol es capaz de decolorar
las clulas Gram negativas pero no las Gram positivas
Dependiendo del resultado de esta tincin, las bacterias pueden

dividirse en dos grandes grupos.
Gram positivas y Gram negativas.
Una vez terminada la tincin de Gram, las bacterias Gram positivas

aparecen de color morado mientras que las Gram negativas
presentan color rojo (Figura 4.4b).
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MICROSCOPICAS
Hay muchas modificaciones de ella.
La siguiente es la versin de Jensen:
(1) Se disuelve 0,5 g de violeta de metilo en 100 ml de agua
destilada.
(2) Se disuelven 2 g de yoduro potsico y 1 g de yodo (triturados
conjunta mente en un mortero hasta polvo fino) en no ms de 20 ml
de agua destilada.
El yodo no se disolver en una solucin ms dbil de yoduro

potsico. Una vez disuelto se lleva a 100 ml.
(3) Fuchina bsica 0,1 % (preparada como se ha indicado

anteriormente) o solucin acuosa de safranina al 1% .
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MICROSCOPICAS
Se tie con la solucin de violeta de metilo durante 20 segundos.
Se lava y se sustituye por la solucin yodurada.
Se deja 1 minuto. Se lava la solucin yodurada arrastrndola con

alcohol de 95 % o acetona, dejando que acten solamente unos
segundos.
Lavar en agua. Teir de contraste con fuchina o safranina.
Se requiere alguna prctica con el mtodo para obtener el grado
correcto de decoloracin.
La acetona decolora mucho ms rpidamente que el alcohol.

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MICROSCOPICAS
Coloracin Nuclear.
Reaccin de Feulgen (material nuclear).
Indica presencia de DNA .
- El Frotis fijado con un vapor osmico son sometidos a hidrolsis
moderada con IN HCL ( 7 a 8 minutos a 58C) son tratadas con
reactivo de Schiff (fuesina decolorada con SO2) .
El color rosa plido indica DNA.
Coloracin de Pared Celular. La pared celular se puede teir con
azl alciano.
El mtodo de Bisset y Hale incluye la inmersin de los frotis
delgados en solucin de cido fosfomolbdico a 1% durante tres a
cinco minutos y luego aplicar verde metilo a 1% al mismo tiempo
Despus de lavar y secar se examina el frots con aceite
Resultado: Pared color violceo o verde oscuro, citoplasma sin
teir.
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MICROSCOPICAS
Coloracin de flagelo.
1. Comprobar movilidad de los microorganismos.
2. Coloracin de flagelo.
a) Se lavan cuidadosamente con dos o tres mililitros de agua
destilada estril.
b) Se incuba el cultivo joven en placas de agar fresco( unos
minutos).
e) Se pasan unas gotitas con una pipeta capilar donde se haya
mas concentracin, en una lmina limpia
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MICROSCOPICAS
d) Se deja que corra la gotita por el portaobjetos inclinado.
e) Secar al aire sin agitar mecnicamente.

f) Usar el colorante de Leifson que contiene sulfato de aluminio
potasico o amoniaco y cido tanico, como mordiente y color bsico
fuesina (reposar diez minutos)
g) Lavar, secar y se examina con aceite.
h) Resultado flagelo de rosa
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MICROSCOPICAS
Tincin de cpsulas
Se pone una pequea gota de tinta china sobre un portaobjetos.
Se mezcla con ella un asa pequea de cultivo o suspensin
bacteriana.
Se pone un cubreobjetos, evitando se formen burbujas de aire y se
oprime con fuerza entre papel absorbente. Se examina a pequeos
aumentos.
Para preparaciones en seco, se mezcla un asa de tinta china con un
asa de suspensin del grmen en solucin de glucosa al 5 % en un
extremo del portaobjetos.
Se extiende la mezcla con el extremo de otro portaobjetos, se deja
secar y se vierten sobre la extensin algunas gotas de alcohol
metlico para fijarla. Se tie durante algunos segundos con violeta
de metilo. Los grmenes aparecen teidos de azul con cpsulas
como halos.
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MICROSCOPICAS
Se extiende la mezcla con el extremo de otro portaobjetos, se deja

secar y se vierten sobre la extensin algunas gotas de alcohol
metlico para fijarla.
Se tie durante algunos segundos con violeta de metilo.
Los grmenes aparecen teidos de azul con cpsulas como halos.
Lactofenol-azul de algodn
Se aade 0,05 % de azul de algodn (azul de metilo) al lactofenol.
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Caractersticas Bioqumicas
Caractersticas Bioqumicas
Propiedades fisiolgicas:
a) Desdoblamiento bacteriano de los carbohidratos (indicador cido
base, produccin de gases)
b) Pruebas de protelisis. Ejemplo capacidad de un microorganismo
para atacar las protenas. Ejemplo licuacin de suero sanguneo,
licuacin de gelatina, produccin de cido sulfrico.
c) Reduccin de nitrato : Utilizacin nitratos como aceptor de
hidrogeno y lo reduce a nitritos.
d) Prueba de oxidasa y catalasa.
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PRUEVAS DE IDENTIFICACIN
Propiedades serolgicas: Las bacterias contienen numerosas

sustancias antignicas, esto es sustancias que estimulan la
produccin de anticuerpos en el interior de los animales, que
pueden reaccionar especficamente con los antgenos.
Para la identificacin de los antgenos bacterianos la prueba que

mas se usa es la de aglutinacin.
Se mezcla una suspensin salina de las bacterias con el antisuero

por valorar, se incuban, las bacterias que contienen antgenos. Se
encuentran los anticuerpos en el suero de los animales inoculados.
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Patogenicidad.
La importancia de la patogenicidad en la identificacin bacteriana es
limitada, dado que no siempre puede contarse con medios
adecuados para valorarla y que tambin algunos microorganismos
pierden su patogenicidad despus de cultivo duradero en el
laboratorio.
Se emplean como una gua, no obstante, en la bacteriologa mdica
diagnstica; por ejemplo: en el examen de muestras obtenidas de
un paciente en que se sospecha fiebre tifoidea para la bsqueda de
Salmonella tifhosa .
Puede a veces valorarse la patogenicidad en el laboratorio al

inocular animales.
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FORMA DE CRECIMIENTO (segn la disponibilidad de oxigeno)
Los microorganismos varan desde los que solo se desarrollan en
oxigeno atmosfrico hasta los que no crecen cuando lo hay.
Se han dividido en microorganismos aerobios, anaerobios,

facultativos y microaerfilos fundndose en la necesidad de
oxigeno.
Aerobios: son microorganismos cuyo crecimiento necesita oxgeno.

Los que solo se desarrollan en presencia de aire (oxigeno) suelen
llamarse aerobios estrictos u obligados.
Anaerobios: Los microorganismo de esta clase viven nicamente
cuando no hay oxigeno. Los anaerobios obligados parecen ser
incapaces de desarrollarse en presencia de oxigeno atmosfrico.
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Microorganismos facultativos: Muchos de los microorganismos en el

medio que nos rodean no son aerobios ni anaerbicos estrictos
pues pueden vivir en presencia de aire o sin el; se llaman
microorganismos facultativos o anaerobios facultativos.
Muchas bacterias (E.col) de uso corriente en experimentos de
laboratorio son anaerobios facultativos.
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RECUENTO DE MICROORGANISMOS
Frecuentemente es necesario determinar el tamao de la poblacin
bacteriana de una muestra.
Desgraciadamente, las industrias han estado tratando de atribuir
ms importancia a estos recuentos bacterianos que lo que
permite su seguridad tcnica o estadstica.
Si se requiere un recuento total, debe tenerse presente que muchos
de los grmenes contados pueden estar muertos o que son
indistinguibles de otras partculas materiales.
71
El recuento de grmenes vivos se fundamenta en que se desarrollar de

cada germen una colonia visible.
Sin embargo, las bacterias estn rara vez separadas por completo de sus
vecinas y se agrupan frecuentemente en racimos en gran nmero, en
especial cuando se reproducen activamente.
Por ello, una colonia aislada puede originarse de un slo organismo o de

cientos o aun miles de organismos. Cada colonia se desarrolla a partir de
una unidad viable.
Puesto que cualquier agitacin, como sucede en la preparacin de
diluciones, puede deshacer o inducir la formacin de racimos, es
naturalmente difcil obtener resultados reproducibles.
Rara vez las bacterias se hallan distribuidas uniformemente en una muestra
y como, por lo general, se examinan solamente muestras pequeas,
pueden introducirse grandes errores.
72
Muchas de las bacterias presentes en una muestra pueden no

crecer en el medio utilizado, por el pH o la temperatura de
incubacin empleados o en el tiempo que se ha permitido el
crecimiento.
Los mtodos fsicos se emplean para determinar las poblaciones
totales, es decir, organismos vivos y muertos.
Se incluyen entre ellos los recuentos en placa, el recuento en tubo

arrollado, recuento de gota, recuento en lmina profunda, placa de
contacto y luminiscencia de ATP.
73
La cmara de recuento de Herbert es una placa de 2-3 mm de

gruesa con un rea en el centro, llamada la plataforma, que se halla
rodeada por un anillo excavado, la que es 0,02 mm ms baja que el
resto de la placa .
La parte superior de la placa est esmerilada, de forma que cuando

un cubreobjetos pticamente plano se pone sobre el centro de la
depresin, la profundidad es uniforme.
Sobre la plataforma hay un rea de 1 mm dividida en 400
pequeos cuadrados, cada uno de los cuales tiene un rea de
0,0025 mm.
El volumen sobre cada cuadrado es de 0,02 x 0,0025 mm esto es,
0,00005 ml.
74
Llamado as por el nombre de su creador, es una tcnica
rudimentaria pero til.
Los portaobjetos de Breed tienen marcadas reas de 1 cm.
Dentro del cuadrado se ponen 0,01 ml del lquido que se va a

contar, por ejemplo, un asa (B. W. o Astell).
Se deja secar. Se tie con azul de metileno.
Se examina bajo objetivo de inmersin al aceite, un dimetro de

campo conocido, generalmente de unos 0.16 mm.
75
Recuentos de organismos vivos

En estas tcnicas, el material que contiene las bacterias se diluye
seriadamente y se ponen partes alcuotas de cada dilucin en o sobre
medios de cultivo convenientes.
Se supone que cada colonia que se desarrolla ha crecido a partir de una

unidad viable que, como ya se ha dicho, puede ser un germen
o un grupo de muchos de ellos.
Diluyentes
Algunos diluyentes, por ejemplo, el suero salino o el agua destilada,
pueden ser letales para algunos grmenes.
No deben utilizarse los diluyentes inmediatamente despus de sacarlos del

refrigerador, ya que el choque trmico puede impedir la reproduccin de los
grmenes.
El mejor diluyente es el agua de peptona al 0,1 %.

76
Preparacin de las diluciones

Se pipetean 9 ml de la solucin diluyente en tubos de ensayo
estriles.
Cuando se hagan diluciones de lquidos, por ejemplo, leche, para
recuentos bacterianos, se procede de la siguiente manera:
Se mezcla la muestra por agitacin. Con una pipeta recta, que se
hunde en la muestra 2.5 cm tan slo, se toma 1 ml. Se deja caer en
el primer blanco de dilucin a aproximadamente un cm por encima
del nivel del lquido.
Se espera 3 segundos . Esta pipeta se elimina.

77
Recuento en placas
Se funde agar nutritivo u otro medio adecuado puesto en tubos en cantidad
de 10 a 15 ml se enfra a 45 C en bao mara.
Se rotulan dos o ms placas de Petri por cada una de las diluciones que
van a ser ensayadas, etiquetando con el nmero de la dilucin.
Se vierte 1 ml de cada una de las diluciones en el centro de la placa
correspondiente. Para cada dilucin se usa una pipeta esteril.
No descubrir la placa ms que el tiempo justamente preciso para la
operacin.
78
Se aade a cada placa el contenido de un tubo de agar,

girndola y mezclndola de la siguiente forma:
Se mueve la placa suavemente seis veces describiendo
crculos en el sentido de las agujas de un reloj, crculos
de unos 15 cm de dimetro. Se repite el mismo nmero
de veces en el sentido contrario. Se mueve la placa de
atrs adelante seis veces, con unos 15 cm de recorrido.
Se repite con los mismos movimientos laterales. Se deja
que se solidifique, se invierte y se incuba durante 24-48
horas.
79
80
81
Recuento de colonias
Para realizar el recuento en un contador de colonias simple se
escogen placas que presenten entre 30 y 300 colonias.
Se pone la placa, con la base de vidrio hacia arriba, sobre la

pantalla iluminada.
Se cuentan las colonias mediante una lupa de 75 mm y un

contador de mano.
Se marca el vidrio sobre cada colonia con la punta de un rotulador.

Se calculan las colonias o el recuento de organismos vivos/ml
multiplicando el nmero medio de colonias por placa contable por el
recproco de la dilucin.
82
83
Se da el informe como unidades formadoras de colonias/ml (ufc)
o como recuento de organismos vivos/ml y nunca como
bacterias/g o /ml.
Si todas las placas contienen ms de 300 colonias, se divide la

placa en sectores, por ejemplo, un cuarto o un octavo de la placa,
se cuentan las colonias en esos sectores y se incluye el valor del
sector en los clculos.
Mtodo de recuento superficial
No es un mtodo muy seguro, pero es til para estimaciones
aproximadas de la carga bacteriana, por ejemplo, en exmenes de
investigaciones sistemticas en plantas de industrializacin de
alimentos
84
Se pone 0,1 ml u otra cantidad conveniente de la muestra, medida
con asa tipo (Astell Ltd.) o con una microjeringa en el centro de una
placa bien seca de un medio adecuado y se extiende con el asa o
con un extendedor sobre toda la superficie.
Se incuban y se cuentan las colonias.
Mtodo de la placa espiral
Se admite que los resultados son comparables con los que se
obtienen por el mtodo de extensin supeficial en placas.
Recuento en filtros de membrana

Los lquidos que contienen las bacterias se hacen pasar a travs de
un filtro que retiene los grmenes.
Se deja despus que el filtro absorba un medio de cultivo y se
incuba, pudiendo contarse las colonias que se desarrollen.
85
Estimacin del nmero ms probable (NMP)
Se basan estos mtodos en la presuncin de que las bacterias se
hallan normalmente distribuidas en un medio lquido, esto es, que
las muestras repetidas del mismo tamao de un mismo producto,
debe esperarse contengan el mismo nmero de grmenes como
promedio; naturalmente, algunas de las muestras pueden contener
algunos grmenes ms o menos.
La cifra media es el nmero ms probable (Most Probable Number

o MPN).
Si el nmero de grmenes es grande, la diferencia entre las

muestras sern pequeas; todos los resultados individuales estarn
prximos a la media.
Si el nmero de grmenes es pequeo, las diferencias, hablando

relativamente, sern mayores.
86
Si un lquido contiene 100 grmenes por 100 ml, cada muestra de

10 ml debe contener 10 grmenes como promedio.
Algunas contendrn ms, quiz una o dos muestras puedan

contener hasta 20 grmenes; otras contendrn menos, pero es
poco probable encontrar muestras que no tengan grmenes.
Es posible calcular el nmero ms probable de grmenes/l00ml

con cualquier combinacin de resultados obtenidos de tales
muestras.
Se han hecho tablas (Tablas 9.1-9.4) para muestras de 10 ml, 1 ml

y 0,1 ml, utilizando cinco o tres tubos para cada tamao de la
muestra y, para determinaciones en el agua, utilizando una muestra
de 50 ml, cinco de 10 ml y cinco de 1 ml.
87
88
RECUENTO DE
MICROORGANISMOS
89
90
DESARROLLO BACTERIANO
ndice de Desarrollo y Tiempo de Generacin
El modo prevaleciente de la reproduccin celular es, como ya
sealamos, la fisin binaria; una clula que se divide, produce dos.
As, si empezamos con una sola bacteria, el incremento en la
poblacin se har en progresin geomtrica:
1 2 - 2 a la 2 2 a la 3 2 a la 4 2 a la 5 ..etc.
El plazo que se necesita para que una clula se divida o para que la
poblacin celular se duplique se conoce como tiempo de
generacin.
No todas las bacterias tienen el mismo tiempo de generacin.
Para algunas, como Eschercha coli, es de 15 a 20 minutos; para
otras es de varias horas.
91
92
El mayor acercamiento convencional se obtiene inoculando el
medio con un nmero conocido de clulas, dejar que se desarrollen
en ptimas condiciones, y despus determinar la poblacin final.
Entre los datos experimentales necesarios para calcular el tiempo

de generacin se encuentran los siguientes:
a) el nmero de bacterias iniciales,
b) el nmero de bacterias al final de un intervalo dado, y
c) el intervalo
93
El crecimiento se define como un aumento en el nmero de clulas
microbianas en una poblacin que tambin se puede medir como
aumento en la masa microbiana.
La tasa de crecimiento es el cambio en la cantidad de clulas o de
masa por unidad de tiempo.
CURVA DE CRECIMIENTO
Si se inocula un medio lquido con clulas microbianas, tomadas de
un cultivo que previamente ha crecido hasta la saturacin el cual
peridicamente se ha determinado el nmero de clulas viables, por
mililitro, y trazado una grfica de l, generalmente se obtiene una
curva del tipo siguiente.
94
95
Las diferencias entre los efectos que tienen sobre el crecimiento,
diversos nutrientes o el ndice de crecimiento de distintas cepas de
bacterias, pueden expresarse en trminos de los siguientes:
1 Tiempo de generacin (tiempo necesario para que el nmero de
clulas se duplique).
2. Nmero de generaciones en un lapso determinado.
3. ndice matemtico con el cual aumentan las clulas.
96
Las clulas pueden conservarse en fase exponencial
transfirindolas repetidamente a un medio fresco de composicin
idntica cuando estn an creciendo exponencialmente.
Se han ideado dos aparatos para llevar a acabo este procedimiento
automticamente:
a) El quimiostato.
b) El turbidostato
Quimiostato
Este aparato consiste en un vaso de cultivo equipado con un sifn
para el rebosamiento y un mecanismo de goteo de medio fresco
desde un recipiente a velocidad regulada.
Turbidostato
Este dispositivo se parece al quimiostato, pero difiere en que el flujo
de medio se controla por un mecanismo fotoelctrico, se mide la
turbidez del cultivo.
97
98
G = T.log 2
logb logB
G = tiempo de generacin.
T = Tiempo en hrs. en que las bacterias se encuentran en fase

logartmica.
Log b = Logaritmo del nmero de bacterias.
Log B = Logaritmo del nmero de bacterias al comienzo de la fase

logartmica.
Log 2 = Constante
99
T = 65xNxD
S
T = Nmero total de organismo por ml. de muestra original.
N = Nmero de colnias contadas.
D = Recproco de la dilucin utilizada en la placa contada
S = Nmero total de cm2 contada en el cuenta colonia (la placa
entera tiene 65 cm2)
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
Placas con 30-300 colonias.

Cuando el nmero de colonias por placa est entre 30 300, contar
las colonias en aquellas porciones de la placa que sea
representativa de la distribucin de colonias.
Recuento por duplicado

Se tienen 2 placas de una dilucin 10-1 cuyos recuentos son:
Placa 1
Dividir la placa en dos partes y contar las colonias que se
encuentran en la mitad de la placa. Dilucin utilizada: 10-1
N de colonias en la placa:
51 x 2 = 102
Factor de dilucin: 10 por lo tanto 102 x 10 = 1,020 UFC
Dividir la placa en cuatro partes y contar las colonias que se
encuentran en un cuadrante de la placa.
115
Placa 2
Se cuenta en un cuarto de la placa de petri
Dilucin utilizada: 10-1N de colonias contadas: 27
N de colonias en la placa: 27 x 4 = 108
Factor de dilucin: 10 por lo tanto 108 x 10 = 1,080 UFC
Se reporta el promedio de las dos placas:

Placa 1: 1020
Placa 2: 1080
Sumar 1020+1080 / 2
Promedio: 1050 UFC/ml , por regla se reportan 2
nmeros enteros
Resultado: 1,100 UFC/ml
116
Placas con ms de 300 colonias

En caso de que ninguna placa tenga de 30 -300 colonias y una o
ms tenga ms de 300 colonias, se debe utilizar aqullas con el
nmero ms cercano a 300.
Se registra el recuento, luego se multiplica por el factor de dilucin y
se reportan como UFC/ml o g.
Cuando el nmero de colonias por placa supere ampliamente las
300, no comunicar resultados del todo DNPC (demasiado
numerosas para contarlas).
Para hacer el recuento tomar en consideracin lo siguiente:
a-Si hay menos de 10 colonias por centmetro cuadrado en el
cuadro.
b- Si hay ms de 10 colonias por cm2 (cuadro).
117
Menos de 10 colonias en el cuadro de 1 cm2

Contar las colonias de 13 cuadros (del contador de colonias)
representativos de la distribucin de las colonias.
Seleccionar: 7 cuadros horizontales y 6 cuadros verticales. En
ambos casos consecutivos
118
Suma del nmero de colonias de los 13 cuadros x 5 = Nmero de

colonias por placa.
Ejemplo: Dilucin utilizada 10-3, colonias contadas en los 13
cuadros = 91.
Multiplicar por 5.
91 x 5 = 455 colonias
Factor de dilucin 1000
por lo tanto: 455 x 1000 = 455000 se reporta 460,000UFC/ml
119
Con ms de 10 colonias/centmetro cuadrado

-Contar las colonias de 4 cuadros (del contador de colonias)
representativos de la distribucin de las colonias.
-Calcular el promedio por cuadro (sumar las colonias de los 4
cuadros) y multiplicar por 65. Luego multiplicar por el factor de
dilucin.
Calculo: 4 x 65
= Nmero de colonias por placa
Ejemplo: Conteo:
Cuadro N 1 = 22
Cuadro N 2 = 20
Dilucin = 10-3
Cuadro N 3 = 22
Cuadro N 4 = 25
Total = 89
Promedio por cuadro: 89 / 4 = 22.25 colonias X 65
Dilucin utilizada: 10 a la menos 3 = 1000
Por lo tanto: 1446 x 1000 = 1,446,000 colonias
Se reporta: 1, 400,000 UFC/ml.
120
Con ms de 100 colonias/cm cuadrado.

Cuando los recuentos bacterianos superen las 100 colonias por
cm2(cuadro): Se registra la placa como: DNPC (demasiado
numerosas para contar)
El resultado se debe reportar como: mayor de 6,500 veces el factor
de dilucin ms alta.
Ejemplo: Si las diluciones para una muestra de pescado presentan
los siguientes recuentos:
Dilucin: 10-1 placa 1 DNPC
placa 2 DNPC
Dilucin 10-2 placa 1 DNPC
Placa 2 DNPC
placa 2 DNPC
121
placa 2 DNPC
La dilucin ms alta utilizada es 10-4, por lo tanto su inverso

es10,000, y el resultado se expresa como:
Mayor de 650000 UFC/g
Placas sin crecimiento
Cuando las placas de todas las diluciones utilizadas no muestran
colonias, se reporta la cuenta en placa como: menor de una vez el
recproco de la dilucin ms baja
Por ejemplo, si hemos utilizado las diluciones 10-1, 10-2, 10-3, y en
las tres diluciones no hay colonias se reporta: Menor de 1 vez x
inverso de la dilucin ms baja Menor de 1 x 10 = Menor de 10
UFC/ml.
122
Redondear la cuenta
Redondear la cuenta a dos cifras significativas. Si el tercer digito
del recuento es igual o mayor que 5, se aumentara en una unidad el
segundo digito de la izquierda y colocar ceros para el resto de la
cifra.
Si el tercer dgito de recuento es menor que 5, reemplazar el dgito

con ceros y el segundo mantenerlo igual, y colocar ceros en el resto
de la cifra.
Ejemplo: 128 redondear a 130 UFC/ml o g
155 redondear a 160 UFC/ml o g
2417 redondear a 2400 UFC/ml o g
123
Cuando deban contarse colonias en expansin, cuntese como una

unidad cada uno de los siguientes tipos:
-Cadenas de colonias que parezcan ser consecuencia de la

desintegracin de un grupo de bacterias al mezclar el agar con la
muestra.
- Expansiones que se desarrollen en las placas entre el agar y suelo
de la placa Petri.
- Colonias que se formen como una pelcula entre el agar y el borde
de la superficie del agar sobre esta ultima.
Su formacin se debe, sobre todo, por acumulacin de humedad en
el punto originario de la expansin
124
Cuntese como colonias individuales aquellas que posean aspecto

de colonias y crezcan muy cerca unas de otras, auque sin tocarse,
siempre que la distancia entre ellas sea al menos igual al dimetro
de la colonia ms pequea.
125
126
Hemos visto que el trmino desarrollo suele utilizarse en
bacteriologa y seala la magnitud de la poblacin total.
El desarrollo en este sentido se puede determinar por muchas

tcnicas que se basa en algunos de los siguientes tipos de medida.
1- Cuenta celular (directamente al microscopio o mediante un

contador electrnico de partculas o indirectamente por la cuenta de
colonias)
2- Masa celular (en forma directa, pesando o midiendo el contenido
celular de nitrgeno o indirectamente por turbidimetra).
3- Actividad celular (indirectamente, relacionando el grado de
actividad bioqumica al tamao de la poblacin bacteriana).
127
128
Determinacin de la Densidad Celular Mediante Turbidimetra
Las bacterias en una suspensin absorben esparcen la luz que las
atraviesa, de tal manera que un cultivo con aproximadamente ms
de 10 a la 7 a 10 a la 8 clulas por milmetros se vera turbio.
De hecho, la cantidad de luz esparcida es proporcional a la masa
de clulas presentes en la trayectoria de la luz; las clulas grandes
interfieren el paso de la luz ms que las pequeas.
Instrumentos sensibles como por ejemplo, un espectrofotmetro o

un colormetro, pueden servir en turbidimetra para medir la masa
de clulas
129
Determinacin de la Densidad Celular

Mediante Turbidimetra
130
131
Determinacin del peso Seco en las Clulas
La determinacin del peso seco en las bacterias es el mtodo ms
directo para las mediciones cuantitativas de la masa celular y
probablemente el ms fcilmente realizable y reproducible, aunque
se debe aplicar slo en suspensiones celulares muy densas y las
clulas deben ser lavadas muy bien para quitarles todo material
extrao.
Este mtodo se aplica principalmente en investigacin
132
133
Factores ambientales que afectan al

crecimiento
Un medio de cultivo adecuado debe contener todos los nutrimentos
requeridos por el microorganismo que va ser cultivado y factores
tales como:
pH,
temperatura,
presin osmtica,
concentracin.
Casi todos los microorganismos neutrfilo crecen mejor en un pH
entre 6.0 y 8.0, aunque algunos
( acidfilos) tiene un pH ptimo tan bajo como 3.0 y otros
(alcalfilos), tan altos como 10.5.
134

crecimiento
pH y crecimiento microbiano
Cada organismo tiene un rango de pH dentro del cual es posible el
crecimiento y normalmente posee un pH ptimo bien definido.
La mayora de los ambientes naturales tienen un valor de pH entre
5 y 9, y los organismos con pH ptimos de este orden son los ms
comunes.
Slo unas cuanta, especies pueden crecer por debajo de 2 o por

encima de 10.
135
136

crecimiento
Los organismos que crecen mejor a bajo pH constituyen un tipo de
extremfilos llamados acidfilos.
El grupo de los hongos son ms acidfilos que las bacterias.

Muchos hongos crecen de forma ptima a pH 5 o inferior e incluso
algunos crecen bien a pH 2. Algunas bacterias tambin son
acidfilas.
De hecho, algunas de estas bacterias son acidfilas estrictos,

incapaces de crecer a pH neutro.
Entre las bacterias acidfilas estrictas se encuentran varias

especies de Thiobacillus y algunos gneros de Archaea como
Sulfolobus, Termoplasma y Ferroplasma.
137

crecimiento
pH intracelular
Cuando se considera para cada organismo particular el
requerimiento de un pH especifico para el crecimiento, hay que
tener en cuenta que el pH ptimo representa solo el pH del medio
extracelular; el pH intracelular debe permanecer prximo a la
neutralidad para evitar la destruccin de las macromolculas
celulares que son sensibles al acido o al alcali.
En los acidofilos, o alcalfilos extremos, el pH intracelular puede

variar algunas unidades respecto a la neutralidad, pero en la
mayora de los microorganismos cuyo pH ptimo para el
crecimiento es entre 6 y 8 (los llamados neutrfilos ), el citoplasma
permanece neutro o muy prximo a la neutralidad
138

crecimiento
Temperatura
Diferentes especies microbianas varan ampliamente en sus
fluctuaciones de la temperatura ptima para su desarrollo, las
formas psicrfilas crecen mejor a temperaturas bajas (15- 20 C).
Las frmas mesfilas lo hacen mejor de 30 a 37 C y la

termfilas de 50 a 60C, la mayor parte de los microorganismos
son mesfilos, 30C es la temperatura ptima para muchas de las
formas de vida libre y la temperatura del husped es ptima para
los simbiontes de los animales de sangre caliente.
139
140
141

crecimiento
AIREACION: Muchos microorganismos son aerobios obligados,
requiriendo especficamente oxigeno como aceptor de hidrgeno;
otros son facultativos y capaces de vivir aerobia o

anaerobicamente;
por ltimo otros son anaerobios obligados, requiriendo una

sustancia diferente del oxigeno como aceptor de hidrgeno y son
sensibles a la inhibicin por aquel.
La toxicidad del oxigeno se debe a su reduccin por las enzimas en

las clulas (como las Flavoprotenas) a perxidos hidrogeno)
(H2O2) y por el ion ferroso al radical libre aun mas txico (02)
superxido
142
143
144

crecimiento
145

crecimiento
PRESIN OSMTICA
En menor grado, pueden ser necesarios controlar factores como la
presin osmtica y la concentracin salina.
Las propiedades de los medios ordinarias son satisfactorios; pero
para las formas marinas y los microorganismos adaptados a crecer
en soluciones concentradas de azcar.
Los microorganismos que requieren altas concentraciones salinas

son llamados halfilos ; los que requieren presiones osmticas
altas se llaman osmfilos.
146
147
148

Unidad II Microbiología General

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UNIDAD II

3) Fotosntesis: La fotosntesis es semejante a la respiracin en que la

Factores Ambientales que Afectan el Crecimiento

Ni un medio cualquiera, ni cualquier temperatura pueden permitir el

Es preferible utilizar varios medios diferentes, cada uno de ellos

El pH del medio utilizado debe estar prximo al del producto que se

Se ponen a enfriar en bao mara a 45-50 C.

Se emulsiona el producto que se va a examinar en agua de

A 15 ml de medio fundido a 45 C se aade 1 ml de una de las

Se hacen rplicas de placa vertida para cada dilucin, para la

Se hacen diluciones del material emulsionado como se ha descrito

Se ponen unos 0.05 ml (1 gota) de dilucin en el centro de una

Se vuelve a poner la tapa de la placa de petri y se deja secar 1 o 2

Se pone un asa cargada de material sobre el medio, cerca del

Se flamea el asa y se hace la extensin desde el rea A sobre la

Las placas se invierten y se incuban.

Se dice que estos mtodos de placas en superficie dan

Se dispone de modelos que funcionan manualmente (con mesa

Con los ltimos, deben sembrarse volmenes exactos.

Para utilizar las mquinas manuales se pone la placa abierta en la

Esta tcnica debe proporcionar un cultivo puro, aunque el proceso

Por tanto, son ms seguros que los primitivos modelos: las

Sin embargo, el catalizador debe mantenerse seco, desecarlo

Los medios de cultivo se reducen previamente, se siembran y se

La mayor parte de las cabinas recuerdan a las cabinas de seguridad

Cultivos de dixido de carbono

Se cierra con la tapa. La llama se apagar cuando se haya agotado

Cultivos de estirpes microbianas

Estas estirpes deben subcultivarse peridicamente para

Es precisamente por las mutaciones de los cultivos bacterianos por

En tales establecimientos los cultivos se conservan liofilizados y

Medios tiles para el mantenimiento de cultivos de estirpes de

Los hongos pueden mantenerse en el medio de Saboureaud.

Es difcil mantener cultivos de algunos organismos muy exigentes,

Uno de estos cultivos, A, se conserva como estirpe y el otro, B, se

De esta forma permanecen vivos muchos organismos durante

Feltham , han descrito un mtodo de congelacin de suspensiones

Este proceso conserva a las bacterias indefinidamente y se conoce

Las levaduras, criptococos, nocardias y estreptomicetos pueden

Este sencillo medio protector puede esterilizarse al autoclave.

USO DE TEJIDOS (vegetales y animales) PARA

La morfologa de una bacteria varia con los factores y

Descripciones de colonias en placas de agar :

Aspecto con la luz reflejada y luz trasmitida.

Pueden aparecer a veces variaciones temporales en

TECNICAS DE COLORACIN Y CARACTERISTICAS

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TECNICAS DE COLORACIN Y CARACTERISTICAS

Preparaciones sin tincin

TECNICAS DE COLORACIN Y CARACTERISTICAS

TECNICAS DE COLORACIN Y CARACTERISTICAS

Los colorantes son compuestos orgnicos que contienen radicales

TECNICAS DE COLORACIN Y CARACTERISTICAS

cidos : porcin coloreada acta como cido (material bsico)

Bases : porcin coloreada acta como base (material cido)

Fsico: adsorcin, absorcin capilaridad y osmosis.

Qumicos: afinidad del colorante bsico por los tejidos cidos y

TECNICAS DE COLORACIN Y CARACTERISTICAS

c. Fijar al portaobjetos con sustancias qumicas o por calor

TECNICAS DE COLORACIN Y CARACTERISTICAS

El tiempo necesario para la coloracin vara de uno a cinco

Luego son secados en el aire, y se examina en el microscopio.

Utilidad: Para apreciar la forma, la disposicin y tamao relativo de

TECNICAS DE COLORACIN Y CARACTERISTICAS