BUENAS PRACTICAS DE

LABORATORIO
Generalidades de buenas practicas de
laboratorio
 Asegurar la ejecución de que los ensayos se realicen de manera
detallada y ordenada.
Seleccionar y utilizar el equipo y material señalado en la técnica.
Colocar el material usado separado del material limpio, no
dejarlo sobre la mesa de trabajo.
Asegurar el buen funcionamiento de todos los equipos a utilizar, su
conexión, calibración y ubicación.
Almacenar y manejar todas las muestras evitando su
contaminación dentro del laboratorio.
.
 Preparar y almacenar los reactivos y medios de cultivo
según los procedimiento establecidos.
Emplear la técnica analítica correcta y de manera
exacta, cualquier cambio en el método debe estar
debidamente validado y aprobado.
Asegurar el uso de los implementos de seguridad, tales
como mandiles, gorras, extintores, etc.
Limpiar y desinfectar las mesas de trabajo antes y
después de los análisis de un alimento
 MATERIAL DE VIDRIO
 Utilizar para los análisis, material de vidrio de baja
alcalinidad o material de plástico libres de defectos y
residuos tóxicos.

 Examinar antes de cada uso el material de vidrio y

desechar todos aquellos que presenten daños; si los bordes
están rotos pueden ocasionar cortaduras, si las superficies
internas están deterioradas o con rajaduras pueden retener
parte del precipitado que desea analizar.

 Lavar y/o estabilizar el material de vidrio antes de volver

a usar
BOMBILLAS O AUXILIARES DE PIPETAS

 Aspirar las muestras, diluciones de las muestras,

soluciones de reactivos o suspensiones de
microorganismos, utilizando los auxiliares de
pipetas.

 Cuando el auxiliar tenga contacto con las

sustancias antes mencionadas, cambiar el filtro y
colocar el auxiliar sin la bombilla de succión en
alcohol al 70% por una hora o esterilizar sin la
bombilla a 121 º C x 15 minutos si es necesario.
PERSONAL
 El personal del laboratorio está obligado a usar
bata y gorro de color blanco durante su
permanencia dentro del laboratorio y además
cuando se inicien los análisis y se efectúen pasajes
utilizará una mascarilla naso-bucal.

El personal externo para su ingreso al laboratorio

debe ponerse bata.
Tipos de siembre
SIEMBRA INCORPORADA
 Se deposita 500 micrlotros de cada dilución en
placas estériles, vacías, por duplicado. Se
puede emplear la misma pipeta para todas las
diluciones si se comienza por la más diluida.
Posteriormente, se agrega a cada placa 15 a
20 mL del medio de cultivo a emplear,
previamente fundido y termostatizado a 45ºC
(en baño o estufa). Se agita moviendo la placa
tapada sobre la superficie de la mesa con
movimiento circular, horario y antihorario y y
hacia delante y hacia atrás.
 En algunas situaciones puede sembrarse un
volumen diferente, en general no más de 3 mL
por placa.
SIEMBRA EN SUPERFICIE
 Se deposita en la superficie de las
placas que ya contienen el medio de
cultivo, 0.1 mL de cada dilución. Se
realiza duplicado para cada
dilución.
 Se puede emplear la misma pipeta
para todas las diluciones si se
comienza por la más diluida. Luego
de realizada la descarga de la
muestra, se procede a extenderla
sobre toda la superficie de las
placas para que se absorba, usando
rastrillo estéril.
 VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE
AMBOS MÉTODOS:

Incorporado Superficie

Mayor cantidad de muestra. Menor cantidad de muestra

Mayor precisión Menor precisión

Mejor aprovechamiento de nutrientes Peor aprovechamiento de nutrientes

Dificultades al subcultivar colonias Facilidad para subcultivar colonias

Visualización de colonias dificultosa Fácil visualización

Temperatura del agar puede afectar la viabilidad de

No se afectan los m.o. termosensibles
algunos m.o.

En aerobiosis sólo crecen aerobios y anaerobios

Se desarrollan m.o. microaerofilicos
facultativos
 Spreaders
 Es frecuente que desarrollen colonias extendidas sobre
la superficie o el fondo y bordes de la placa, o que se
den cadenas de colonias unidas. Este tipo de
crecimiento se denomina "spreaders" y se cuentan como
una. Cuando el spreader cubre más del 50% de la
placa, esta no debe contarse. Cuando el spreader
cubre una superficie menor del 50%, se cuentan las
colonias en el resto de la placa, SOLO si están
uniformemente distribuidas.
 Si en todas las placas hay spreaders se informa :
Spreaders
 Conservación de los medios
preparados
 Lo más recomendable es preparar el medio cuando se
va a emplear, aunque en muchos casos por razones
obvias una parte del medio preparado se consume y el
resto se guarda como medio preparado. El tiempo de
vida del medio preparado dependerá de la propia
naturaleza del medio, de la hermeticidad de los
recipientes que lo contienen, de la temperatura de
conservación y de las condiciones medioambientales. Si
la hermeticidad es buena y la temperatura baja, 2-
8ºC, la vida del medio puede llegar a ser de 4 a 6
semanas.
 Conservación de los medios preparados, listos
para su uso
 Los medios preparados listos para usar tienen un tiempo limitado de
conservación, que es de varios meses si las condiciones de
almacenamiento y transporte son las adecuadas. Se recomienda su
almacenamiento por regla general por debajo de los 20ºC y
protegidos de la luz. Algunos medios deben conservarse entre 2-
8ºC, siendo este requisito especificado en la etiqueta del producto.
Los medios de cultivo con Agar no deben guardarse por debajo de
0ºC, ya que se alteraría la estructura del gel. La pérdida de agua
puede provocar precipitados o hacer que cristalicen ciertas
sustancias del medio de cultivo, así como originar grietas en las
placas preparadas. En los medios de cultivo que deben refundirse y
que deben contener aditivos lábiles, se suministra el medio basal
preparado y según la necesidad se deben añadir los aditivos de
forma estéril.
 Refundido de medios sólidos
 Cuando se precisa refundir los medios sólidos, preparados y
estériles en frascos y tubos, para verterlos en placa, es aconsejable
hacerlo en baño maría, en microondas o en autoclave a vapor
fluente. En ningún caso debe aplicarse calor directo. Una vez
fundidos, deberán dejarse enfriar hasta unos 50ºC para añadir los
aditivos, si fuera necesario y para distribuirlos o sembrarlos. Hay
que tener en cuenta que los medios refundidos tienen una cierta
tendencia al oscurecimiento y precipitación, que aumenta cuando se
mantienen fundidos durante periodos de tiempo prolongados y a
temperaturas entre 45-65ºC y que ello puede suponer una pérdida
de las características nutritivas o selectivas del medio, por lo que es
aconsejable, no fundirlos más de una vez y no mantenerlos en el
calor largos periodos de tiempo.
Introducción
 ¿Qué utilidad tiene conocer las condiciones que un
microorganismos requiere para crecer?

# Obtenerlo en el laboratorio Cultivo

# Combatirlo o
evitar su proliferación
Nutrientes
 Substancias necesarias para
asegurar supervivencia.
 Proveen energía y elementos
necesarios para síntesis de
estructuras celulares.
 Ingreso por absorción.
 Viabilidad: capacidad de
reproducción.
Nutrientes esenciales o Básicos
 Asimilables por simple difusión o por transporte
activo
 Agua
 Fuentes de Carbono
 Compuestos de nitrógeno
 Fósforo (fosfatos inorgánicos)
Otros nutrientes
 Iones potasio
 Iones Magnesio
 Factores de Crecimiento u orgánicos
 Vitaminas

 Aminoácidos

 Oligoelementos
 Hierro

 Cobre

 Cobalto
Factores Estimulantes
 Influyen en el proceso de crecimiento.
 No son imprescindibles.
 En presencia de factores estimulantes crecen mas
rápido y mejor.
Categorías Nutritivas
 Fuente de Carbono
 Carbono inorgánico: dióxido de carbono autótrofas o
litótrofas
 Carbono orgánico: Heterótrofas u organótrofas

 Fuente de Energía
 Fotótrofas

 Quimiótrofas: energía suministrada por ATP

 Crecimiento Bacteriano
 Aumento de número (no
de tamaño)
 Multiplicación bacteriana:
fisión simple o binaria
 Elongación
 Auto duplicación de ADN
cromosómico
 Tabicado central
 Invaginación membrana
celular
 Síntesis de pared
Tiempo de generación
 Tiempo necesario para la duplicación celular
 Distintiva de cada especie
 Puede influirse por factores estimulantes
 Varían de 20 minutos (Escherichia coli) hasta 24
horas
Curva de Crecimiento Bacteriano

•Bacteria en medio adecuado

•Gráfico de coordenadas:
número de bacterias (logaritmo)
versus lapso de tiempo.
•Distinta para cada bacteria
•En todas se identifican cuatro
etapas
Fase de Latencia
 El número de microorganismos no varía
 Adaptación al medio, producción de enzimas
 Tiempo variable: entre una hora a días.
 Tamaño relativo aumentado por división
 Fase exponencial o de crecimiento
logarítmico
 Relación casi lineal entre el tiempo y
el número de elementos.
 Actividad metabólica incrementada
 Depende del tiempo de generación
de cada bacteria
 Los antimicrobianos son mas activos
 Puede haber variaciones entre el
crecimiento in vitro e in vivo.
Fase Estacionaria
 En determinado punto el crecimiento disminuye
 La población no aumenta
 Células nuevas reemplazan a las células muertas
 Actividad metabólica mas lenta
 Células en animación suspendida
 Producción de metabolitos secundarios
 Antibioticos
 Toxinas

 Fase de Esporogenesis para las especies productoras

de esporas
 Fase de declinación o muerte
 Recuento de células disminuye sensiblemente
 El numero de células muertas supera al número de
células vivas
 Acumulación de productos tóxicos
 Disminución de nutrientes
 Aparición rápida : autolimitar diseminación
infecciones
Técnicas para determinar el número y
viabilidad de las células
 Contar al microscopio el número
de células en un volumen
conocido
 Establecer el número de células
por turbidimetria
 Recuento de elementos viables
por cultivo (Unidad Formadora
de Colonias o UFC)
Efecto de la Temperatura
 Temperatura mínima de crecimiento
 Temperatura óptima de crecimiento
 Temperatura máxima de crecimiento
Sicrófilos
 Requieren bajas temperaturas
 15 – 20 ºC
 La mínima puede ser muy baja
 Bacterias en el fondo del mar y en los polos
Mesófilos
 Rango de temperaturas: 25 – 40 ºC
 Temperatura óptima: 37 ºC ± 1 ºC
 Agentes que afectan al hombre y los animales
Termófilos
 Toleran altas temperaturas
 Temperatura óptima: 55 ºC
 Temperatura máxima: 80 ºC o mas.
Condiciones de pH
 pH : Potencial Hidrógeno. Va desde 0 a 14.
 pH < 6,5 ácido
 pH > 7,5 básico o alcalino
 pH 6,5 – 7,5 neutro Mas adecuado para
crecimiento bacteriano
 Bacterias que crecen hasta pH 4 Acidófilas (Por
ejemplo: Lactobacillus)
 Vibrio cholerae : medio alcalino
Presión Osmótica
 Los solutos (sales y azúcares) disueltos se desplazan
a zonas de menor concentración. El agua se
desplaza a zonas de mayor concentración de
solutos
 Una presión osmótica alta causa pérdida de agua
y plasmólisis de la célula
 Halófilas: bacterias que toleran altas
concentraciones salinas
 Halófilas facultativas : toleran hasta un 2 % de
sales
Condiciones atmósféricas
 Potencial de óxido-reducción o Redox (Eh)
 Respiración bacteriana : reacciones de óxido-
reducción, en cadena
 El aceptor final de electrones o hidrogeniones es
variable
Aerobios
 Requieren oxígeno, aceptor final de hidrógeno
 Formación de H2O y CO2
 Producción de enzima Catalasa : desdoblamiento
del Peróxido de hidrógeno (H2O2) en H2O y
oxígeno
 Prueba de Catalasa para diferenciar
microroganismos (Staphylococcus de Streptococcus)