Cuaderno de

laboratorio de
microbiología
Profesor: Richard Williams

Paula Escolano
1ºSemestre
Grupo A1
PRÁCTICA 1: MEDIOS DE CULTIVO Y ESTERILIZACIÓN

OBJETIVO
El objetivo de la práctica es preparar distintos medios de cultivo, que posteriormente se emplearán en el
cultivo de microorganismos. Asimismo, se estudiarán los distintos tipos de medios y sus respectivas
cualidades para aplicarlas en un futuro y acarrear nuestros estudios de la manera más eficiente.
Tras esta preparación someteremos los medios a una esterilización profunda para el cultivo de los
microorganismos deseados.

DISCUSIÓN TEÓRICA
Los medios de cultivo en microbiología son sustancias o ambientes que proporcionan las condiciones
necesarias para el crecimiento, desarrollo y reproducción de microorganismos, como bacterias, hongos y
virus, en el laboratorio.
Existen varios tipos de medios de cultivo en microbiología que debemos de seleccionar según las
necesidades del estudio. La elección del medio de cultivo adecuado depende del tipo de microorganismo
que se está cultivando y del propósito específico del cultivo.

Según su consistencia:
○ Medios sólidos: Contienen un agente solidificante, generalmente agar, que permite el
crecimiento de microorganismos en la superficie del medio.
○ Medios líquidos: No contienen agente solidificante y permanecen en estado líquido. Se
utilizan a menudo para cultivar microorganismos en suspensiones, como el caldo
nutritivo.
Según su función:
○ Medios de cultivo generales: Proporcionan los nutrientes esenciales para el crecimiento
de una amplia variedad de microorganismos.
○ Medios de cultivo selectivos: Contienen ingredientes que inhiben el crecimiento de
ciertos microorganismos mientras permiten el crecimiento de otros. Se utilizan para
aislar microorganismos específicos.
○ Medios de cultivo diferenciales: Contienen indicadores que permiten distinguir entre
diferentes tipos de microorganismos según sus características bioquímicas.
○ Medios de cultivo enriquecidos: Son medios que contienen componentes adicionales,
como sangre o suero, para favorecer el crecimiento de microorganismos fastidiosos o
aquellos que requieren nutrientes adicionales.
○ Medios de enriquecimiento: Diseñados para favorecer el crecimiento de
microorganismos en muestras que pueden contener pequeñas cantidades de patógenos.
○ Medios anaeróbicos: Se utilizan para el cultivo de microorganismos que crecen en
ausencia de oxígeno.

La esterilización es un proceso fundamental que se utiliza para eliminar o destruir todos los
microorganismos presentes en un objeto, medio o superficie. Existen varios métodos de esterilización
según los materiales y resultados deseados.
● Calor Húmedo
○ Autoclave: Utiliza vapor de agua a alta presión y temperatura para esterilizar.
○ Esterilización fraccionada: se realiza a menor presión y temperatura que el autoclave.
Utilizada principalmente para medios de cultivo que no pueden someterse a altas
temperaturas.

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 ● Calor Seco
○ Incineración: sometimiento directo del material a la llama de un mechero.
○ Horno Pasteur: Emplea aire caliente a altas temperaturas para destruir microorganismos.
Se utiliza para esterilizar instrumentos y materiales que no pueden soportar la
exposición al vapor de agua, como algunos tipos de vidrio y metal.
● Radiación: La radiación ionizante, como los rayos gamma y los rayos X. La radiación daña el
material genético de los microorganismos, impidiendo su capacidad de reproducción, pero esta
no es capaz de traspasar materiales por lo que es una esterilización superficial.
● Filtración: Este método implica el paso de líquidos o gases a través de filtros que retienen los
microorganismos. Se utiliza comúnmente para esterilizar soluciones líquidas y gases, y es
especialmente útil para aquellos materiales sensibles al calor.

MATERIALES Y MÉTODOS
La práctica consiste en hacer 2 medios de cultivo (TSA y TSB) y un medio salino.

TSB (Caldo tripticaseína-soja)

Contiene 17 g de peptona pancreática de caseína, 3 g de harina de soja digerida con papaína, 5 g de
cloruro sódico, 2,5 g de fosfato dipotásico, 2,5 g de glucosa y 1 l de agua destilada.
Para su preparación, se mezclan 4,5 gramos de TSB (preparado previamente en un recipiente) con 150
mililitros de agua destilada. La mezcla se calentará para favorecer su disolución utilizando un mechero
Bunsen, evitando llegar a la ebullición y con precaución para evitar la carbonización.
Posteriormente, el líquido se transferirá a tubos de ensayo, aproximadamente 7 mililitros por tubo,
mediante el uso de una goma en el extremo más estrecho. Esta goma está equipada con una pinza para
medir la cantidad de líquido que se vierte en cada tubo. Los tubos se sellarán y se colocarán en una
cesta para su posterior esterilización en el autoclave.

TSA (Agar tripticaseína-soja)

Contiene 1 litro de TSB y 9 gramos de Agar, el cual servirá como agente solidificante en el medio de
cultivo.
Se realizan dos preparaciones a partir de este medio de cultivo: una de 500 ml, que se vertirá en un
frasco y otra de 150 ml, que será distribuida en tubos de ensayo.
Para la preparación del frasco, se mezclarán 24 gramos de TSA con 1 litro de agua destilada. En este
caso, el Agar y el TSB ya estarán premezclados en el frasco según sus proporciones. La mezcla será
calentada con precaución para evitar que se queme, luego se transferirá a un recipiente y posteriormente
al autoclave para su esterilización.
En cuanto a la preparación de los tubos de ensayo, se seguirán los mismos pasos que con los tubos de
TSB, pero con una disolución diferente. En este caso, se utilizarán 4,5 gramos de TSB por 150 ml de
agua destilada. Se verterán aproximadamente 7 ml en cada tubo con la ayuda de un embudo. Los tubos
se sellarán y colocarán en la misma cesta que los tubos de TSB para ser esterilizados en el autoclave.

SUERO SALINO
Proporción de 9 gramos de cloruro sódico por cada litro de agua destilada.
En este caso se hará una preparación de 900 ml, por lo que emplearemos 8,1 gramos de cloruro sódico.
Esta mezcla se hará sin necesidad de calor externo y se transportará a tubos de ensayo (9 ml exactos
por tubo). Para el traspaso utilizaremos un dosificador que se encargará de introducir los mililitros
deseados a los tubos. A continuación, los tubos se sellarán y transportarán al autoclave.

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ESTERILIZACIÓN
Los medios no se harán bajo condiciones de laboratorio, ya que posterior a su formación se introducirán
en un autoclave durante 20 min, asegurando la esterilidad de los mismos. Tras esto se deberá depositar
el TSA del tarro en las placas de petri. Esto se hará dentro de una cabina de flujo laminar que
proporciona un entorno limpio y estéril para la manipulación de materiales sensibles a la contaminación.
Estas cabinas están diseñadas para crear un flujo de aire unidireccional y laminar que minimiza la
contaminación de partículas, ya que fluye de manera constante desde la parte superior hacia la parte
inferior de la cabina. Este flujo ayuda a mantener un entorno libre de partículas contaminantes. Además,
suelen estar equipadas con filtros de alta eficiencia (HEPA o ULPA) que retienen partículas pequeñas y
microorganismos presentes en el aire, garantizando un ambiente limpio.

RESULTADOS
Se obtendrán 19 tubos de TSA y los mismos de TSB, esto se debe a las pérdidas por traspasos y
evaporación. De los tubos de suero salino obtendremos 99 tubos por pérdidas

PRÁCTICA 2: CULTIVO DE MICROORGANISMOS

OBJETIVO
Utilizar los medios de cultivo anteriormente preparados para cultivar unos microorganismos
determinados mediante distintas técnicas. Conocer los distintos métodos de siembra, así como de
cultivos en función de las necesidades de los microorganismos y del estudio.

DISCUSIÓN TEÓRICA
El cultivo de microorganismos es un proceso fundamental en microbiología que permite el crecimiento y
la propagación controlada de bacterias, hongos, virus u otros microorganismos en un entorno de
laboratorio, este cultivo lo haremos sembrando los microorganismos deseados en una placa petri.
La siembra consiste en depositar una pequeña cantidad de microorganismos en un medio de cultivo
estéril que más tarde se multiplicarán al proporcionarles las condiciones óptimas para su desarrollo. Hay
distintos métodos de siembra según el tipo de cultivo previo, líquido o sólido.
Las dos técnicas utilizadas para la obtención de colonias aisladas son:
1) Diluciones sucesivas y siembra en placa: se diluye de manera serial una cantidad inicial de
microorganismos en un medio (por ejemplo suero salino). De esta manera conseguimos una
cantidad óptima de bacterias que formarán colonias y nos permitirán una posterior observación.
Más tarde se sembrarán en una placa petri con un asa de Drigalski. De esta manera se podrá
calcular la concentración de organismos viables de la muestra inicial con una fórmula:
𝑑
N = (ufc contadas /V) * 10
Donde:
N: unidades formadoras de colonias por mililitro o gramo
ufc: unidades formadoras de colonias contabilizadas
V: volumen inoculado en la placa
d: dilución
2) Agotamiento de asa en placa: es un método de aislamiento donde se recogerán con un asa de
siembra una cantidad indeterminada de microorganismos y tras dibujar un patrón en el medio de

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 cultivo se conseguirán aislar estos para su posterior formación de colonias. No se puede
identificar la cantidad de muestra inicial.

3) Cultivo de organismos anaerobios: el crecimiento de microorganismos se ve afectado por el

oxígeno, por lo que en algunos casos para el correcto desarrollo de estos se deben de cultivar en
condiciones anaerobias. Los organismos anaerobios son aquellos microorganismos que pueden
crecer y vivir en ausencia de oxígeno molecular (O2). Estos organismos han desarrollado
adaptaciones metabólicas para obtener energía sin depender del oxígeno, ya que la presencia de
oxígeno puede ser tóxica para algunos de ellos. Los microorganismos se clasifican en los
siguientes grupos dependiendo de su afinidad con el oxígeno:
○ Anaerobios estrictos: no toleran la presencia de oxígeno y pueden morir en su presencia.
○ Anaerobios aerotolerantes: pueden crecer en presencia de oxígeno, pero no lo utilizan
activamente en su metabolismo
○ Microaerófilos: Prefieren niveles bajos de oxígeno, pero no pueden tolerar
concentraciones normales de este gas.
○ Aerobios facultativos: Pueden crecer tanto en presencia como en ausencia de oxígeno, y
ajustan su metabolismo según las condiciones ambientales
○ Aerobios estrictos: solo pueden crecer bajo la presencia de oxígeno

MATERIALES Y MÉTODOS
Todos los pasos explicados serán realizados bajo condiciones de esterilidad, alrededor de un mechero
Bunsen, flameamiento de los materiales y los tubos en cada uso tanto al inicio como al final. Lo único
que no será flameado será la pipeta automática por ser de plástico, aunque nos aseguraremos de que
mantenga su esterilidad al haber pasado por el autoclave (observamos una cinta con líneas visibles si en
los materiales ya esterilizados por el autoclave). El asa de Drigalski se bañará en alcohol previo al
flameo, ya que, al ser de cristal, no se puede mantener mucho tiempo bajo el fuego.
Tener en cuenta también que las placas petri se almacenan boca abajo para evitar la contaminación de
las muestras y que la condensación de las mismas afecte al crecimiento bacteriano.

CULTIVOS
a) Cultivo en tubos de ensayo:
1. Recogemos la muestra
1) Medio líquido: removemos la muestra
2) Medio sólido: aplicamos en la superficie con un movimiento de zigzag

b) Diluciones sucesivas y siembra:

1. Removemos un tubo con TSB y cultivo bacteriano con ayuda del vórtex (3-6
segundos)
2. Se añade 1 ml de cultivo bacteriano en TSB a un tubo de ensayo con 9 ml de suero
salino gracias a una pipeta automática. (Disolución 1:10)
3. Se remueve esta disolución con el vórtex.
4. Se añade 1 ml de la disolución anterior a otro tubo con 9 ml de suero salino y
removemos. Repetimos la operación guardando los tubos y enumerándolos hasta
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conseguir una disolución 1:10
4 5 6
5. Las diluciones 1:10 , 1:10 y 1:10 serán las seleccionadas para la siembra.
6. Se cogen 100μl de las muestras seleccionadas y se ponen en una placa petri.
7. Esparcimos la muestra sobre la placa con asa de Drigalski

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 8. Incubamos durante 24 h
9. Seleccionamos para el recuento una placa que contenga entre 30 y 300 colonias.
10. Se cuentan las placas halladas
𝑑
11. Se aplica la fórmula N=ufc *10*10
○ N: unidades formadoras de colonias por mililitro o gramo
○ ufc: unidades formadoras de colonias
○ d: dilución

c) Agotamiento de asa en placa:

1. Con el asa de siembra se coge una cantidad indeterminada de
microorganismos
2. Realizar varias estrías con el inóculo sobre la placa
3. Flamear el asa
4. Enfriar el asa en el centro de la placa petri
5. Realizar varias estrías (con un ángulo de 80 grados aproximadamente)
cruzando las anteriores
6. Repetir los pasos 2-5 hasta hacer 4 o 5 estrías
7. Incubar 24 - 48 horas a 37 grados
8. Aislar una colonia y volver a sembrar
9. Obtención de una colonia pura

d) Cultivo de microorganismos anaerobios

1. Marcar 2 placas de TSA con una cruz en el centro y una diferenciación que permita saber
cuál ha sido cultivada en un medio aerobio y cuál en un medio anaerobio
2. Sembrar un organismo aerobio estricto conocido en ambas placas (control positivo)
3. Sembrar un organismo anaerobio facultativo en ambas placas (control negativo)
4. Sembrar dos organismos no conocidos en ambas placas
5. Introducir un sobre de anaerogen 2,5 (vitamina C) en la jarra de anaerobiosis: esto extrae
el oxígeno del interior de la jarra creando un medio anaerobio
6. Introducir el medio anaerobio en la jarra
7. Dejar incubar ambos cultivos a 28 grados durante 24 horas
8. Observar el crecimiento

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RESULTADOS

SIEMBRA DE LAS DISOLUCIONES

6
La placa seleccionada para el recuento es la disolución 1:10 . Esto nos indica que la cantidad de
bacterias en el medio original era muy alta, ya que solo se ha podido contar la placa más diluida.
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Teóricamente, la placa seleccionada debería haber sido la dilución 1:10 puesto que de esta manera nos
aseguramos de contar las colonias adecuadas, por esto mismo se seleccionan distintas placas para la
siembra, para poder tener cierto margen de selección sin saber la concentración bacteriana inicial.
Tras el recuento hallamos 83 colonias y, tras aplicar la fórmula, llegamos a la conclusión que la
7
concentración inicial era de 8,3*10 bacterias por mililitro.

AGOTAMIENTO DE ASA
Tras el primer agotamiento de asa no se consiguen colonias aisladas, ya que la cantidad de bacterias es
demasiado grande. Se debería haber hecho una quinta estría para intentar conseguir menos muestras y
aislar la colonia. De todas formas, se consigue encontrar algunas colonias y aislarlas para su segundo
agotamiento.

CULTIVO ANAEROBIO
Los controles en el cultivo anaerobio indican que no hay crecimiento bacteriano en casi ninguna bacteria,
esto indica que todas necesitan oxígeno a la hora de desarrollarse correctamente. Se observa que la
muestra 1 (anaerobio facultativo) no crece en el medio anaeróbico, esto se debe a algún error a la hora
de siembra. En general, los controles no han tenido el resultado esperado, por lo que lo ideal sería tirar
las muestras y comenzar de nuevo ya que los resultados no son fiables.

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 1: anaerobio facultativo (control +)
8: aerobio estricto (control -)
7 y A : muestras desconocidas

PRÁCTICA 3: OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS

OBJETIVO
Visualización de los organismos previamente cultivados y obtención de conocimiento sobre los tipos de
tinciones, su realización y la elección de estos según lo deseado. Posterior diferenciación morfológica
mediante tinción simple y tinción negativa, diferenciación de las paredes mediante tinción gram y
detección de endoporas.

DISCUSIÓN TEÓRICA
Una vez producido el crecimiento bacteriano deseado hay una serie de técnicas que permiten la
observación de este con el microscopio. El teñido celular es una técnica comúnmente utilizada para
resaltar estructuras celulares y hacerlas más visibles bajo el microscopio. La tinción permite estudiar la
morfología, distribución y características específicas de las células. Hay una gran variedad de tinciones
con fines distintos que ayudarán a observar distintas zonas o requerimientos de nuestras células. Las
utilizadas en las prácticas serán:
a) Tinción simple: empleo de un colorante insoluble para aumentar el contraste de la pared
bacteriana con el medio, de esta forma se busca estudiar su morfología.
b) Tinción negativa: empleo de un colorante que teñirá el medio donde se encuentra el
microorganismo, sin teñir las células. Se emplea un coloide llamado nigrosina, demasiado
grande para penetrar en las células, por lo que solo se teñirá el medio.
c) Tinción diferencial
○ Tinción de Gram: procedimiento que permite diferenciar las bacterias en dos categorías,
Gram+ y Gram -, basadas en las diferencias en la composición de la pared celular. Las
bacterias Gram-positivas tienen una pared celular más gruesa compuesta
principalmente por peptidoglicano, mientras que las bacterias Gram-negativas tienen
una pared celular más delgada compuesta por una capa delgada de peptidoglicano y
una membrana externa que contiene lipopolisacáridos. Inicialmente, se añade un
colorante que pigmentará todas las bacterias, más tarde se añade un mordiente que
aumentará la afinidad entre colorante y células. A continuación se lavarán con alcohol
que decolora las bacterias gram negativas. Finalmente, añadimos otro colorante que
teñirá las bacterias que han perdido el colorante.
○ Tinción Ziehl-Neelsen: es un procedimiento utilizado para teñir bacterias resistentes a
ácido y alcohol. Estas bacterias tienen una pared celular con una gran concentración de

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 ácidos lipólicos, lo que las confieren resistencia e impermeabilidad frente a tinciones.
Normalmente, estas forman parte de la familia de las micobacterias.
d) Tinción de esporas bacterianas: las esporas son células que producen ciertas bacterias como un
mecanismo de defensa, mediante esta tinción diferenciamos con dos colores las esporas y las
bacterias. Las esporas al ser formas de resistencia tienen una pared bacteriana mucho más
gruesa que las bacterias, por esto se debe emplear calor para aumentar la permeabilidad de la
pared de la espora y que entre el colorante. Para esta tinción se emplea un colorante soluble que
se calentará una vez puesto sobre el frotis. El colorante ha de ser soluble, ya que, después, se
lavará con agua para retirarlo de la pared bacteriana. Aun así, el color se mantendrá en las
esporas, pues el calor debilitará su pared permitiendo su entrada y el agua la regenerará
impidiendo la salida de colorante. A continuación, se colorearán las paredes bacterianas para
diferenciarlas.
e) Observación de cultivos en vivo: revela detalles significativos sobre el comportamiento y
morfología de los microorganismos presentes. En las prácticas se harán observaciones de
bacterias con movilidad y de cianobacterias. Estas últimas son capaces de fijar el nitrógeno en
medios aerobios y anaerobios, de esta forma se hará una observación de cianobacterias
cultivadas en ambos ambientes para ver las diferencias estructurales de estas.

MATERIALES Y MÉTODOS
FROTIS
1. Tomar una pequeña cantidad de muestra
a. Líquida: una gota de la muestra se extiende sobre el frotis
b. Sólida: se pone una gota de agua sobre el portaobjetos y se extiende encima una
muestra de cultivo
2. Dejar secar al aire
3. Fijar la preparación pasándola por encima de la llama 3-4 veces
La toma de muestra y el secado se harán en condiciones de esterilidad pura. Flameando el asa de
siembra y los correspondientes tubos de ensayo. Solo se podrá apagar el mechero y volver a
condiciones no asépticas tras la fijación de la muestra.

TINCIÓN SIMPLE
1. Hacer un frotis
2. Cubrir el frotis con un colorante no soluble, en nuestro caso se cubre un frotis con cristal violeta
y otro con safranina.
3. Dejar actuar 1 minuto
4. Lavar con agua destilada, evitando el contacto directo del chorro de agua con la muestra para
evitar que se despegue y se pierda con el colorante.
5. Dejar secar la muestra
6. Examinar la muestra

TINCIÓN NEGATIVA
1. Colocar la muestra en el porta y añadir una gota de nigrosina
2. Mezclar con el asa
3. Con otro porta se hace un frotis. Se extiende un lateral del porta sobre el porta con la muestra
arrastrando el exceso de nigrosina.
4. Dejar secar
5. Examinar la muestra

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TINCIÓN DE GRAM
1. Hacer el frotis
2. Cubrir con cristal violeta (1 min)
3. Cubrir con lugol (1 min)
4. Lavar durante 30 segundos con alcohol en posición inclinada
5. Cubrir con safranina (1 min)
6. Lavar con agua destilada
7. Secar al aire y examinar

TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN
Esta tinción solo será observada, ya que la fucsina es un líquido tóxico que produce fuertes dolores de
cabeza y es preferible no hacer la preparación.
1. Hacer un frotis
2. Cubrir la preparación con fucsina fenicada
3. Calentar con un hisopo impregnado en alcohol durante 5 minutos
4. Añadir ácido nítrico y dejar actuar 30-40 segundos
5. Lavar con agua destilada
6. Decolorar con alcohol durante 30 segundos
7. Lavar con agua destilada
8. Aplicar azul de metileno durante 2 minutos
9. Secar al aire
10. Observar

TINCIÓN DE ESPORAS BACTERIANAS

1. Hacer el frotis
2. Añadir verde de malaquita
3. Calentar con un hisopo prendido en alcohol durante 5
minutos
4. Lavar con agua
5. Añadir safranina y esperar 2 minutos
6. Lavar con agua
7. Dejar secar al aire
8. Observar

OBSERVACIÓN EN VIVO

Movimiento bacteriano:
1. Tomar una gota del cultivo en TSB previamente hecho
2. Colocar la gota sobre el centro del cubre con una pipeta Pasteur
3. Poner dos pequeñas gotas de aceite de inmersión en los extremos del cubre para ayudar a la
adhesión del cubre sobre el porta
4. Situar el cubre sobre un porta excavado
5. Observar la muestra

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Cianobacterias:
1. Poner una gota de la muestra de bacterias sobre un portaobjetos con una pipeta Pasteur
2. Situar un cubre encima
3. Observar a 40 aumentos

RESULTADOS

Tinción simple
Bacterias con forma de cocos de la familia Kokuria, organizadas en tétradas.
Esta tinción tan solo nos permite diferenciar su morfología, no aporta ninguna prueba
característica

Tinción negativa
El portaobjetos queda cubierto por una tinta negra y nos permite
diferenciar los cocos agrupados en tétradas de forma más clara. Al
igual que la tinción simple, no aporta ningún dato sobre las células
teñidas. Como se ve en las imágenes, el exceso a la hora de retirar
la nigrosina con el otro porta hace que este no se tiña
adecuadamente y no se crea un contraste tan intenso.

Tinción Ácido-Alcohol resistente

Se observan las bacterias resistentes en un tono morado, mientras que aquellas con una
pared mas simple se ven de color azul.

Tinción de esporas bacterianas

En el interior de las bacterias se distinguen estructuras teñidas de verde que
corresponden a endosporas. La bacteria a observar es Bacillus sp, lo que permite la
posible presencia de estas esporas tanto en el interior como en la periferia celular,
dado que esta bacteria se caracteriza por liberar sus endosporas al entorno. Es
importante señalar que el cultivo se ha desarrollado durante un periodo de 24 horas,
aunque se estima que este bacilo debería incubarse durante 48 horas para asegurar la
máxima observación de endosporas. Podemos afirmar que se trata de una cepa con
una notable producción, ya que en tan solo 24 horas se ha registrado una considerable
cantidad de estas estructuras.

Observación en vivo de cianobacterias

En las dos muestras observadas se encuentra mayor cantidad de acinetos y
heterocistos en la muestra con menos volumen de nitrógeno al incubarse.
Puesto que los heterocistos se encargan de la fijación de nitrógeno en
medios aerobios. Los acinetos son estructuras análogas a las endosporas
cuya función es de resistencia.

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 Observación de bacterias in vivo
Se observa movimiento bacteriano alrededor de la curvatura de la gota. Las bacterias
tienen un ligero movimiento, sin poder tener un gran desplazamiento o fuerza en el. Aún
así, se dejan ver pequeños microorganismos nadando contracorriente

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