Ing. Lorena Oa, M.Bio.Mol.

Ingeniera Forestal

 Estrategia para mantener y propagar clulas

vegetales

Consiste Clulas libres o agregados celulares

medio lquido en constante movimiento

suministro constante de nutrimentos

Medio de cultivo MS o medio B5 de Gamborg

Medio de induccin de callo diferente del medio

para establecimiento de suspensiones celulares

 Material de partida trozos de callo friables, con alto

ritmo de divisin celular

Medio lquido
Condiciones constante movimiento 80-150rpm, 25C

Frascos Erlenmeyer 1/5 de la capacidad

Subcultivo diluciones bajas 1:5

Incio Clulas libres o agregados, alargadas, grandes, no se

dividen

Final Clulas dispersas, pequeas, isodiamtricas,

paredes finas, citoplasma denso

 Cultivos cerrados:
Clulas producidas se quedan en el medio
Aumento en densidad celular
Fin Fase estacionaria
Fracciones de cultivo para iniciar uno fresco

Cultivos continuos cerrados

Suministro de medio fresco continuo
Se retira solo medio usado

Clulas separadas mecnicamente se

acumulan

Cultivo continuo abierto

Suministro de medio fresco constante
Se retira medio usado junto con clulas

 Fase de retraso:
Inicia con subcultivo en medio fresco

Cambios en sntesis de ARN y protenas

Alta actividad metablica
Clulas vienen de fase estacionaria 1 a 3 das, es

corta
Clulas viene de fase en crecimiento a veces no se
presenta o se acorta
Acortar extractos orgnicos, CH
Nmero de clulas comienza a aumentar al final
ndice mittico es bajo
Final Inicia replicacin de ADN

Fase de
retraso

 Fase exponencial:
Tasa especfica de crecimiento (aumento de la

biomasa por unidad de concentracin) es constante y

medible
Alargar densidades celulares iniciales bajas o alto
contenido de nutrimentos
Aumento en peso fresco, peso seco y volumen de
celular menor al nmero de clulas
Alta actividad mittica

Fase
exponencial

 Fase linear:
Tasa especfica de crecimiento declina uniformemente
Final ndice mittico comienza a declinar

Fase de desaceleracin:
Declinacin de la tasa especfica de crecimiento aumenta
Fase estacionaria:
No hay aumento neto en la sntesis de biomasa o nmero

de clulas
ndice mittico nulo
Incremento en peso fresco, peso seco y volumen celular
Nmero de clulas no cambia, viabilidad declina
Contenido de protenas

Fase linear

Fase
estacionaria
Fase de
desaceleracin

 Nmero de clulas:
Necesario Disgregar clulas
CrO3 o pectinasas
Conteo bajo microscopio
Volumen celular:
Volumen conocido de suspensiones se centrifuga
Se determina volumen de clulas
Se expresa en ml de clulas/ml de cultivo

Aumenta en fase de poca actividad mittica

Peso fresco:
Sobre papel filtro pesado se colocan clulas lavadas
No se recomienda si la densidad es baja
Aumenta en fase de poca actividad mittica

 Peso seco:
Igual al peso fresco

Antes de pesar las clulas se desecan a 60C por 12h

Aumenta en fase de poca actividad mittica

Turbidez:
Frasco con brazo lateral
Se mide con fotocolormetro

ndice mittico (IM):

Se recolectan clulas y se fijan
Sobre portaobjetos se colorean
Se revisan 1000 clulas bajo microscopio y se cuentan aquellas en mitosis

 Metabolismo primario Crecimiento rpido

Metabolismo secundario Crecimiento lento y cierta

organizacin de los cultivos

Plantas superiores Sintetizan diferentes metabolitos

secundarios

Clulas en suspensin No producen metabolitos,

cambios en la expresin gnica

Mxima acumulacin en cultivos Ritmo de

crecimiento decrece y exhiben alguna diferenciacin

Fase estacionaria

Bioreactores Sistema de cultivo continuo y abierto

 Produccin de metabolitos secundarios de uso farmacutico, agrcola o industrial en

clulas in vitro

Sntesis qumica o extraccin desde plantas en poco viable

Espectro de metabolitos en plantas comparable con clulas in vitro

Proporcin cuantitativa es diferente
Suspensiones producen cantidades mayores de un compuesto y menores de otro

Suspensiones pierden capacidad de producir algn compuesto presente en la planta

 Quinina Cinchona officinalis y C. ledgeriana rboles de 21 aos Paludismo

Vincoleucoblastina y vincristina Catharantus roseus aislamiento y cantidades

pequeas Actividad antitumoral

Diosgenina Dioscorea compositae rendimientos bajos Precursor de hormonas

esteroidales

Morfinanos Papaver somnferum control estricto para evitar trfico ilegal

Precursores de la morfina y la codena

POSIBILIDAD Aumentar rendimientos de principios activos usando suspensiones

celulares in vitro

 Bajo estricta regulacin metablica

Sntesis regulada por: luz, reguladores de crecimiento y temperatura
Sugiere que su sntesis es vital para la supervivencia
Aun se desconoce mucho sobre sntesis y regulacin

 Dos grandes dificultades:

Seleccionar lneas sobreproductoras entre millones de clulas

Clonar lneas seleccionadas a bajas densidades

Se debe medir concentraciones intracelulares en busca de altas concentraciones

Diferentes mtodos

Se puede inducir la formacin de rganos para aumentar niveles de produccin

Necesario optimizar el medio

 Cultivo en dos fases con medios diferentes:

Mantenimiento crecimiento rpido

Produccin Acumulacin de metabolitos

Factores nutricionales y pH
Macronutrientes incremento en biomasa
Nitrgeno orgnico incrementa metabolitos
Disminucin de fosfatos incrementa metabolitos

Sacarosa su adicin aumenta metabolitos

 Factores fsicos
Radiacin: longitud de onda, intensidad y fotoperodo

Aireacin: agitacin mecnica o flujo de gases

Temperatura: ms baja que T de crecimiento

Reguladores:
Auxinas Marcado efecto sobre metabolismo primario y secundario
Poliaminas Incrementan produccin de metabolitos

Otros factores:
Carbn activado
Infeccin por patgenos

 Produccin industrial Grandes volmenes de mezclas de reaccin

Bioreactores de 2 a 20000L con sistemas de aireacin y agitacin, que funcionen

por semanas sin contaminarse Obtencin de toneladas de producto

Problemas:
Crecimiento lento de biomasa
Agregacin celular
Acumulacin intracelular de productos

Poca resistencia a la agitacin mecnica