Crecimiento celular

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Microbiologa Industrial

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Fases del crecimiento de un cultivo
En este apartado vamos a revisar el estudio de la cintica del crecimiento de
microorganismos que crecen en un cultivo realizado en un volumen finito. a esto se le
denomina cultivo batch y podramos traducirlo por cutivo discontinuo por
contraposicin con el cultivo continuo que desarrollaremos ms adelante. El desarrollo
de un cultivo discontinuo se ajusta al representado en la siguiente figura:
Se pueden
distinguir
cuatro fases
en el cultivo:
(1) la fase lag
en la que el
microorganis
mo se adpata
a las nuevas
condiciones y
pone en
marcha su
maquinaria
metablica
para poder
crecer
activamente.
La duracin
de esta fase es
variable y en
general es
mayor cuanto
ms grande
sea el cambio
en las
condiciones
en las que se
encuentra el
microorganis
mo. (2) La
fase
exponencial
cuya cintica

explicamos en
la pgina
anterior. (3)
La fase
estacionaria
en la que no
hay aumento
neto de
microorganis
mos, lo que
no significa
que no se
dividan
algunos, sinio
que la
aparicin de
nuevos
individuos se
compensa por
la muerte de
otros. (4) La
fase de
muerte en la
que el nmero
de
microorganis
mos vivos
disminuye de
forma
exponencial
con una
constante k
que depende
de diferentes
circunstancias
.
En la fase de mmuerte decimos que el nmero de microorganismos vivos disminuye
exponencialmente. Pero qu es un microorganismo vivo en trminos microbiolgicos?.
Consideramos vivo al microorganismo que puede multipicarse (dividirse), y muerto al
que ha perdido irreversiblemente la capacidad de dividirse. Es importante entender este
concepto porque los microorganismos microbiolgicamente muertos no tienen porqu
estar metablicamente inactivos.

2.4.- Medida del crecimiento microbiano

Podemos medir el crecimiento microbiano siguiendo diferentes parmetros algunos
de los cuales presentar a continuacin. No debemos olvidar que en condiciones de

crecimiento equilibrado todos los parmetros del cultivo evolucionan de forma

proporcional y, por consiguiente, midiendo uno de ellos (el de medida ms fcil)
podemos medir el resto.
En este apartado revisaremos los principales mtodos de recuento de
microorganismos. Una informacin ms completa puede encontrarse en la conexin
Mtodos de recuento.
Los mtodos para el seguimiento de la evolucipon de un cultivo microbiano pueden
clasificarse en directos e indirectos. Los mtodos directos se basan en la medida de la
evolucin del nmero de clulas vivas (tcnicas de plaqueo) o del nmero de partculas
(tcnicas microscpicas y de contadores de partcuas). Ls mtodos indirectos se basan
en la medida de algn parmetro del cultivo que nos permite deducir informacin sobre
la evolucin del nmero de microorganismos. La eleccin de un mtodo de seguimiento
del cultivo en concreto depende de las caractersticas del cultivo y del proceso.
Entre los mtodos principales de recuento de microrganismos podemos destacar:
1.- Las tcnicas de recuento microscpico de clulas sin fijar usando microscopa de
contraste de fae. Para ello se cuenta el nmero de partculas en un volumen determinado
usando una clula de Petroff-Hauser o de Neubauer (portaobjetos modificado en e que
una rejilla nos permite conocer el volumen que estamos observando). El procedimiento
es rpido y sencillo; pero no permite distinguir clulas vivas inmviles de clulas
muertas.
2.- Contaje de partculas utilizando sistemas automticos del tipo Coulter Counter. La
operacin de estos sistemas es sencilla (mtodo de empleo) y permite rpidamente
determinar el nmero de patculas presentes en una suspesin y la distribucin de sus
tamaos. El problema es que no distingue entree clulas vivas y muertas ni entre clulas
y agregados de material insoluble presente en la suspensin del cultivo.
3.- Tcnicas de recuento en placa, basadas en colocar en un medio de cultuivo adecuado
un volumen determinado de muestra. Cada una de las clulas aisladas dar lugar,
despus de la incubacin correspondiente, a una colonia de forma que el nmero de
estas nos permitir estimar el nmero de clulas presentes en la muestra plaqueada
(sembrada). El sistema es fcil de utilizar en el caso de clulas aisladas (no sirve en el
caso de hongos filamentosos, por ejemplo). Puede realizarse sembrando en superficie
(extendiendo un volumen dado de muestra sobre el medio de cultivo slido) o en
profundidad (mezclando un volumen dado de muestra con el medio de cultivo antes que
solidifique). Esta ltima opcin permite realizar el recuendto de microorganismos
microaerfilos que no crecen bien en la superficie de las placas de cultivo. Para que el
sistema de recuento en placa tenga validez estadstica, es necesario contar entre 30 y
300 colonias con objeto de disminuir el error de la medida.
4. Tcnicas turbidomtricas basadas en la medida de la turbidez de los medios de
cultivo en los que crecen microorganismos unicelulares. La turbidez es proporcional a la
masa de las partculas en suspensin (clulas) y su medida nos permite estimarla. Para
ello se utiliza un equipo similar al que se emplea en la medida de la absorbancia de luz
por disoluciones coloreadas (colormetro, por ejemplo). Las medidas se hacen a una
longitud de onda adecuada (normalmente en el entorno de 550 nm) y los valores se

suelen denominar valores de densidad ptica. La limitacin de este sistema, por otra
parte muy sencillo, es que no distingue clulas vivas de muerta y que normalmente no
es capaz de detectar densidades celulares menores a 10.000 clulas por mililitro.
5.- Medida de peso seco. El sistema consiste en la filtracin del cultivo a travs de una
membrana que retenga las clulas y su posterior desecacin hasta peso constant. El
sistema, obviamente, no disferencia clulas vivas de muertas y su sensibilidad es
limitada.
6.- Medida del ATP. Es una medida relativamente sencilla basada en la emisiin de luz
por la luciferasa de lucirnaga (Photimus pyralis) en presencia de O2 y de ATP. De esta
forma se puede medir la concentracin de ATP en un volumen dado de cultivo. Esta
medida es interesante porque la concentracin de ATP decae rpidamente en las clulas
muertas, de forma que esa medida indirecta detecta nicamenta las clulas vivas.
Los sistemas de medida del crecimiento celular se han adaptado tcnicamente para
poder ser utilizados como sistemas online. En una opracin on line no es necesario
extraer la muestra del cultivo para realizar la medida. Esto es muy importante en el caso
de fermetaciones en gran volumen porque permite realizar medidas en tiempo real y
disminuye los riesgos de contaminacin.
Antes de cerrar este apartado hay que sealar que en la naturaleza hay muchsimos
ms microorganismos de los que podemos detectar por la mayora de los sistemas de
recuento. De hecho, se estima que en el suelo o en el agua podemos cultivar nicamete
proporciones menores al 1% de los microorganismos vivos. Esto es debido a varias
causas entre las que se cuenta la falta de medios de cultivo adecuado, la dependencia de
otros microorganismos para el cultivo debido a procesos de sintrofa y la oligotrofa
(inhibicin por altas concentraciones de nutrientes) que muestran algunos
microorganismos.
9 MICROBIOLOGIA DE LOS ALIMENTOS

Tema 9
FACTORES QUE AFECTAN A LA SUPERVIVENCIA DE LOS
MICROORGANISMOS EN LOS ALIMENTOS
Factores que afectan a la supervivencia de los microorganismos en los alimentos: Temperatura: Refrigeracin, Congelacin,
Altas temperaturas. Radiacin ultravioleta. Radiacin ionizante. Actividad de agua reducida. El pH y la acidez. Potencial redox.
Acidos orgnicos. Sales de curado y substancias anlogas. Los gases como conservantes.

1.- TEMPERATURA..
- Segn su comportamiento frente a la temperatura, los organismos pueden ser
trmofilos, mesfilos y psicrotrofos. (Tabla 1)

1.1.- Refrigeracin.
- A temperaturas inferiores a la ptima, la velocidad de crecimiento de los
microorganismos disminuye y los periodos de latencia se alargan mucho.
- A una temperatura de refrigeracin (0 - 5 C) los organismos psicrfilos crecen
ms rpidamente que los mesfilos. Po tanto, la baja temperatura supone un
factor de seleccin de la flora del alimento de gran importancia.
- Cuando se enfra rpidamente un alimento muchas de las bacterias mesfilas
que normalmente resistiran la temperatura de refrigeracin, mueren como
consecuencia del choque de fro. Esto es ms frecuente en Gram-negativas
que en Gram-positivas.
- A baja temperatura las rutas metablicas de los microorganismos se ven
alteradas, como consecuencia de su adaptacin al fro. Estos cambios
metablicos pueden dar lugar a que se produzcan deterioros diferentes,
causados por los mismos microorganismos a diferentes temperaturas.
- El deterioro de alimentos refrigerados se produce por microorganismos
psicrofilos porque, aunque sus velocidades de crecimiento son lentas, los
periodos de almacenamiento son muy prolongados.
- Los microorganismos patgenos son, en su mayora, mesfilos y no muestran
crecimiento apreciable, ni formacin de toxinas, a temperaturas de refrigeracin
correctas. Ahora bien, si la temperatura no es controlada rigurosamente puede
producirse un desarrollo muy peligroso rpidamente.
1.2.- Congelacin.
- La congelacin detiene el crecimiento de todos los microorganismos. Los
superiores (hongos, levaduras, helmintos) son ms sensibles que las bacterias
y mueren.
- A temperaturas ms bajas (-30 C) la supervivencia de las bacterias es mayor
que en temperaturas de congelacin ms altas (-2 a -10 C), sin embargo estas
temperaturas tambin deterioran el alimento ms que las ms bajas.
- La congelacin puede producir lesiones subletales en los microorganismos
contaminantes de un alimento. Este aspecto hay que considerarlo al hacer
control microbiolgico.
- Durante la congelacin la carga microbiana continua disminuyendo. Sin
embargo, las actividades enzimticas de las bacterias pueden continuar dando
lugar a ms deterioro.

- Tras la congelacin los microorganismos supervivientes pueden desarrollarse

en un ambiente en el que la rotura de la integridad estructural del alimento
como consecuencia de la congelacin puede producir un ambiente favorable
para el deterioro microbiano.
1.3.- Altas temperaturas.
- Las temperaturas superiores a las de crecimiento ptimo producen
inevitablemente la muerte del microorganismo o le producen lesiones
subletales. Las clulas lesionadas pueden permanecer viables; pero son
incapaces de multiplicarse hasta que la lesin haya sido reparada.
- Aunque se han observado excepciones, est perfectamente establecido que
la cintica de termodestruccin bacteriana es logartmica.
- Se pueden determinar para cada microorganismo y alimento los valores de
termodestruccin D y z.
- La velocidad de termodestruccin se ve afectada por factores intrnsecos
(diferencia de resistencia entre esporas y clulas vegetativas), factores
ambientales que influyen el crecimiento de los microorganismos (edad,
temperatura, medio de cultivo) y factores ambientales que actan durante el
tratamiento trmico (pH, aw tipo de alimento, sales, etc.).

2.- RADIACION ULTRAVIOLETA.

- La radiacin ultravioleta produce una disminucin exponencial en el nmero
de clulas vegetativas o de esporas vivas con el tiempo de irradiacin. Por
tanto se pueden calcular los valores D para la irradiacin.
- Existe una falta de informacin precisa sobre la susceptibilidad de las
diferentes especies microbianas a la radiacin U.V.: diferentes cepas de una
misma especie pueden tener una resistencia distinta.
- El mayor valor del tratamiento con radiaciones U.V. se encuentra en el
saneamiento del aire, aunque tambin pueden aplicarse para esterilizar
superficies de alimentos o para el equipo de los manipuladores de alimentos.

3.-RADIACION IONIZANTE.

- La radiacin ionizante es altamente letal, puede ajustarse su dosis para

producir efectos pasteurizantes o esterilizantes y su poder de penetracin es
uniforme.
- Es letal por destruccin de molculas vitales de los microorganismos, esto los
consigue sin produccin de calor, por lo que los alimentos se conservan
frescos. La mayora de los daos son a nivel ADN.
- La sensibilidad a la radiacin de los microorganismos difiere segn las
especies e incluso segn las cepas, aunque las diferencias de resistencia entre
cepas de una mismas especie son generalmente lo suficientemente pequeas
para no tenerlas en cuenta a efectos prcticos.
- Las bacterias Gram-negativas son generalmente ms sensibles a la
irradiacin que las Gram-positivas y las esporas an ms resistentes.
- En general, la resistencia a la radiacin de los hongos es del mismo orden
que la de las formas vegetativas bacterianas.
- Los virus son an ms resistente que las bacterias a la radiacin.

4.- ACTIVIDAD DE AGUA REDUCIDA.

- Los microorganismos requieren la presencia de agua, en una forma
disponibles, para que puedan crecer y llevar a cabo sus funciones metablicas.
La mejor forma de medir la disponibilidad de agua es mediante la actividad de
agua (aw). La aw de un alimento puede reducirse aumentando la concentracin
de solutos en la fase acuosa de los alimentos mediante la extraccin del agua o
mediante la adicin de solutos.
- La deshidratacin es un mtodo de conservacin de los alimentos basado en
la reduccin de la aw, durante el curado y el salazonado, as como en el
almbar y otros alimentos azucarado son los solutos los que, al ser aadidos,
descienden la aw.
-Un pequeo descenso de la aw es, a menudo, suficiente para evitar la
alteracin del alimento, siempre que esta reduccin vaya acompaada por
otros factores antimicrobianos.

- La mayora de las bacterias y hongos crece bien a aw entre 0,98 y 0,995; a

valores aw ms bajos la velocidad de crecimiento y la masa celular disminuyen
a la vez que la duracin de la fase de latencia aumenta hasta llegar al infinito
(cesa el crecimiento).
- Algunos tipos de microorganismos son capaces de crecer en condiciones de
alto contenido de sal (Baja aw). Dependiendo de la capacidad de supervivencia
a baja aw se denominan osmfilos, xerfilos y halfilos (segn va aumentando
su requerimiento de sal).
- La baja aw reduce tambin la tasa de mortalidad de las bacterias: una baja aw
protege los microorganismos durante tratamientos trmicos.

5.- pH Y LA ACIDEZ.
- En general, la presencia de cidos en el alimento produce una drstica
reduccin de la supervivencia de los microorganismos. Los cidos fuertes
(inorgnicos) producen una rpida bajada del pH externo, aunque su presencia
en la mayora de los alimentos es inaceptable. Los cidos orgnicos dbiles
son ms efectivos que los inorgnicos en la aciclificacin del medio intracelular;
se supone que esto ocurre porque es ms fcil su difusin a travs de la
membrana celular en su forma no disorciada (lipoflica) y posteriormente se
disocian en el interior de la clula inhibiendo el transporte celular y la actividad
enzimtica.
- La mayora de los microorganismos crecen a pH entre 5 y 8, en general de
hongos y las levaduras son capaces de crecer a pH ms bajos que las
bacterias. Puesto que la acidificacin del interior celular conduce a la prdida
del transporte de nutrientes, los microorganismos no pueden generar ms
energa de mantenimiento y, a una velocidad variable segn las especies, se
produce la muerte celular.

6.- POTENCIAL REDOX.

- Se piensa que el potencial redox es un importante factor selectivo en todos
los ambientes, incluidos los alimentos, que probablemente influye en los tipos
de microorganismos presentes y en su metabolismo. El potencial redox indica
las relaciones de oxgeno de los microorganismos vivos y puede ser utilizado
para especificar el ambiente en que un microorganismo es capaz de generar
energa y sintetizar nuevas clulas sin recurrir al oxgeno molecular: los
microorganismos aerobios requieren valores redox positivos y los anaerobios

negativos. cada tipo de microorganismo slo puede vivir en un estrecho rango

de valores redox.

7.- ACIDOS ORGANICOS.

- La actividad antimicrobiana de un cido orgnico o de su ster se debe a las
molculas no disociadas de este compuesto, porque esta forma molecular es la
ms soluble en las membranas celulares, por esto slo los cidos orgnicos
lipoflicos tienen actividad antimicrobiana.
- Estos compuesto inhiben el crecimiento de los microorganismos o los matan
por interferir con la permeabilidad de la membrana celular al producir un
desacoplamiento del transporte de substratos y el transporte de electrones de
la forforilacin oxiclativa. como consecuencia de esto las bacterias no pueden
obtener energa y mueren.
- La mayoras de los cidos orgnicos resultan poco eficaces como nhibidores
del crecimiento bacteriano a los pH de 5.5 a 5.8, y son ms eficaces a altas
concentraciones y pH ms bajos. (Cuando el estado disociado del cido es
ms infrecuente). Su empleo ms frecuente es como micostticos.
- De todos los cidos el ms efectivo es el actico.

8.- SALES DE CURADO Y SUBSTANCIAS ANALOGAS.

- Las sales de curado son el cloruro sdico y los nitratos o nitritos de sodio y
potasio; estos productos modifican el alimento base en el color, aromas, textura
y sensibilidad al crecimiento microbiano.
- A las concentraciones y bajo las condiciones corrientemente utilizadas, los
agentes de curado no causan una destruccin microbiana rpida; ms bien
retrasan o previenen el desarrollo de los microorganismos perjudiciales de los
productos sin tratar por el calor y el de los termotolerantes no esporulados y
evitan el desarrollo de las esporas que sobreviven al tratamiento trmico ms
drstico aplicado a ciertos productos curados.
- Se desconoce el mecanismos excto de la inhibicin de las bacterias por el
nitrito que, aunque no previene la germinacin de las esporas, evita su
desarrollo.

9.- GASES COMO CONSERVADORES.

- Diversos gases y vapores naturales o artificiales destruyen o inhiben los
microorganismos. El nitrgeno y el oxgeno se usan con frecuencia en el
envasado y almacenamiento de los alimentos pero su fin primario no es la
inhibicin de los microorganismos; diversos gases son poderosos biocidas y se
han utilizado con xito en la desinfeccin de hospitales, establos y
compartimentos de barcos o como fumigantes del suelo, pero no se han
aplicado a los alimentos.
- El CO2 inhibe el crecimiento de microorganismos sobre los alimentos con
eficiencia creciente cuanto ms desciende la temperatura. Este efecto se
manifiesta tanto en bacterias como en hongos por un incremento de la fase de
latencia y del tiempo de generacin durante la fase logartmica. Su
mecanismos de inhibicin no se conoce con claridad, aunque se debe a la
presencia del CO2 (y quiz a la formacin de cido carbnico) y no a la
ausencia de oxgeno. Los mohos y las levaduras son alga ms resistentes al
CO2 que las bacterias (las Gram-negativas ms sensibles que las Grampositivas).
- La actividad antimicrobiana del dixido de azufre est relacionada con la
forma molecular no ionizadas: no se conoce un modo de accin, aunque este
gas es muy reactivo y probablemente interacciona con muchos componente
celulares. Su accin txica es selectiva: las bacterias son ms resistentes que
los mohos y las levaduras, por la que este gas se emplea frecuentemente como
antifngico.
- El xido de etileno resulta muy txico para los microorganismos y su actividad
est relacionada con su accin como agente alquilante. Los mohos y levaduras
son ms sensibles que las bacterias y estas que las esporas.