LABORATORIO N2

MTODOS DE SEPARACIN: CROMATOGRAFA

1. Aspectos tericos de la cromatografa.
La cromatografa es una tcnica de separacin de solutos de una mezcla, que se basa
en la diferente velocidad con que se mueve cada uno de los solutos a travs de un
medio poroso, arrastrados por un disolvente en movimiento. A este disolvente se le
llama fase mvil y el medio poroso puede ser la fase estacionaria, o bien servir de
soporte a esta fase. Se habla de cromatografa en columna cuando la fase estacionaria
o su soporte estn contenidos en una columna.
La separacin cromatogrfica constituye un proceso dinmico que permite un
intercambio continuo por desplazamiento de una fase con respecto a la otra. El
diferente reparto de solutos entre las fases mvil y estacionaria es la causa de la
separacin de los solutos. El soluto que tiene mayor afinidad por la fase estacionaria se
mover con mayor lentitud.
La fase mvil se llama eluyente. Cuando emerge por la salida de la columna se llama
eluato. El proceso que consiste en hacer pasar un lquido o un gas a lo largo de la
columna de cromatografa se llama elucin. El volumen de elucin (ve) es el volumen
de fase mvil que se requiere para eluir un soluto dado de la columna cromatogrfica.
Se puede clasificar las cromatografas en 5 grandes grupos:

Cromatografa de Reparto.
Cromatografa de Adsorcin.
Cromatografa de Intercambio Inico.
Cromatografa de Exclusin.
Cromatografa de Afinidad.

Cromatografa de Reparto:
Est basada en la separacin o reparto de una mezcla de solutos entre la fase mvil
(disolvente) y la fase estacionaria soportada sobre un slido adecuado, de acuerdo a
las distintas solubilidades de estos solutos en ambas fases. Si el disolvente es un
lquido se denomina cromatografa lquida. Son cromatografa de reparto la
cromatografa en papel y la cromatografa en capa fina (TLC).
La cromatografa en papel se utiliza para la separacin de cantidades mnimas de
soluto y tambin como un criterio de pureza. Se basa en la diferente velocidad con que
se mueve cada uno de los solutos a travs de una fase estacionaria que es el agua
retenida sobre un soporte slido e inerte (celulosa), arrastrado por un disolvente en
movimiento.
Una vez realizada la cromatografa, la posicin de los componentes se determina
mediante una tcnica que permita visualizarlos. Es comn revelar el cromatograma
mediante reacciones que originen productos coloreados.
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Los componentes de una mezcla se pueden identificar por su migracin con respecto
al solvente mvil en condiciones definidas en relacin con el comportamiento de
patrones. El cromatograma no es alterado por la presencia de otros solutos.
Se calcula la razn de migracin del soluto con respecto a la fase mvil (Rf ) que se
compara con la de los patrones (Ec. 2.1).
Rf

distancia recorrida por el soluto

distancia recorrida por la fase mvil

Ecuacin 2.1

El Rf debe calcularse de acuerdo a la distancia recorrida por el soluto, desde su punto

de partida hasta el punto medio de la posicin de ste una vez corrida la cromatografa,
y la distancia recorrida por la fase mvil, tambin medida desde el punto de partida del
soluto hasta el frente del solvente en el papel.
Como los Rf son constantes en condiciones definidas y controladas permiten identificar
los componentes de una mezcla de solutos, en la medida que los Rf de muestras y
patrones se obtengan en un mismo experimento.
b.
Cromatografa de Adsorcin:
Est basada en la diferente adsorcin y posterior desorcin de sustancias contenidas
en un disolvente mvil (lquido o gas) sobre un slido estacionario. No se debe
confundir la adsorcin que es un fenmeno de superficie que se manifiesta por el
aumento de concentracin de la interfase que rodea al medio estacionario, con la
absorcin que consiste en la penetracin de una sustancia en el seno de otra. Ejemplos
de cromatografa de adsorcin son la cromatografa en columna de almina y de carbn
activado, la placa de slica gel.
c.
Cromatografa de Intercambio Inico:
La fase estacionaria es una matriz polimrica porosa que posee grupos inicos unidos
covalentemente y contraiones mviles que pueden ser intercambiados por iones
arrastrados por la fase mvil (lquido).
d.
Cromatografa de Exclusin Molecular:
Las molculas pueden ser separadas tambin sobre la base de sus diferentes tamaos
al pasar a travs de una columna que contiene partculas hidratadas de geles porosos.
Se encuentra en el mercado un buen nmero de materiales para estos fines, cuya
composicin y porosidad son controladas cuidadosamente, de modo que molculas de
tamao relativamente parecido puedan ser separadas mediante la adecuada seleccin
del tamao del poro gel (tabla 1). El Sephadex consta de partculas pequeas de
dextrano formadas por una red tridimensional de cadenas de polisacridos ramificados.
Es altamente polar debido a su alto contenido de grupos hidroxilos, por ello se hincha
considerablemente cuando se coloca en agua. La mezcla de molculas grandes y
pequeas se colocan sobre la superficie libre superior del gel. A medida que la muestra
desciende por la columna, las molculas pequeas difunden dentro del gel teniendo
que recorrer un camino ms largo, mientras que las molculas grandes pueden ser
completamente excluidas de los poros del gel. Eventualmente se obtiene una
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separacin completa en la que las molculas grandes salen primero de la columna y

por ltimo las ms pequeas.
El resultado de la columna cromatogrfica se expresa en la forma de un diagrama de
elucin que muestra la variacin de la concentracin del soluto en el eluyente versus el
volumen del eluyente que ha pasado por la columna. De este diagrama se obtiene el
volumen de elucin.
El volumen de elucin (Ve) no es un criterio para definir el comportamiento de un
compuesto, ya que vara con el volumen total de la columna (Vt) y la forma como la
columna ha sido empaquetada. Para ello se utiliza la constante Kav (Ec. 2.2).

K av

v v
v v
e

Ecuacin 2.2

En cromatografa de exclusin el volumen de la fase mvil se llama volumen intersticial

(V0). El valor de V0 se determina haciendo pasar por la columna una molcula grande e
inerte de peso molecular superior al lmite de exclusin del gel. El azul de dextrano
2000, un colorante con peso molecular de 2*10 6, se utiliza generalmente con este
propsito. Cuando no se dispone de la informacin adecuada para este clculo, el Vo se
puede estimar como el 35% del volumen total de la columna (Vt). El volumen total de la
columna se calcula a partir de las dimensiones de la columna (V t = r2 h ).
De los cuatro tipos de cromatografa, en este laboratorio se usar la cromatografa de
reparto en papel y la de exclusin sobre Sephadex G-25.
2. Objetivos.
Identificar aminocidos de una muestra problema mediante la cromatografa de reparto
en papel.
Separar diclorofenol-indofenol y hemoglobina ocupando la tcnica de cromatografa de
exclusin.

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Parte experimental.
3.1 Materiales

espectrofotmetro / celdas.
1 cmara cromatogrfica
6 capilares
1 papel filtro (14 cm de ancho)
1 pizeta
2 placas de porcelana
1 columna cromatogrfica de Sephadex G-25 hidratado
1 manguera y regulador
1 pipeta graduada de 1 ml
1 pipeta graduada de 5 ml
1 vaso precipitado de 250 ml
1 vaso precipitado de 150 ml
2 gradillas
20 tubos de ensayo
3.2 Reactivos

leucina, glicina, lisina y prolina (1mg/ml) (patrones)

solucin n-butanol / cido actico/ H2O en relacin 3:1:1 (fase mvil).
ninhidrina 0,2 % en etanol.
tampn fosfato 67mM pH 7,0 / NaCl 0,1 M .

4. Procedimiento.
4.1 Cromatografa de reparto en papel para separacin e identificacin de
aminocidos.

Coloque con anticipacin la fase mvil en la cmara cromatogrfica y tape la

cmara, de modo que se sature con los vapores de esta fase.
Tome el papel de un borde (superior) ocupando guantes de goma para evitar
contaminarlo con aminocidos o protenas que se encuentren en las manos.
Corte el papel filtro como un rectngulo de 30 cm de alto y 14 cm de ancho. Marque
con lpiz grafito una lnea a lo ancho del papel a 1,5 cm del borde inferior. Marque
puntos en esta lnea separados por una distancia de 1,5 a 2,0 cm entre si.
Coloque con un capilar fino, diferente para cada muestra, las soluciones de los
aminocidos patrones y las muestras problemas sobre la lnea marcada. Identifique
siempre con lpiz grafito cada aplicacin.
Enganche la tira de papel filtro en la parte superior de la cmara cromatogrfica que
se encuentra saturada con los vapores de la fase mvil. Deje el borde inferior del
papel sumergido 1,0 cm en la fase mvil.
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Deje que la fase mvil ascienda unos 15 cm aproximadamente, no permita que el

lquido sobrepase el borde superior y saque el papel de la cmara.
Deje secar a temperatura ambiente.
Revele la cromatografa rociando el papel con ninhidrina y secando el cromatograma
en una estufa a 80 90C. Los aminocidos aparecen como manchas prpuras y
amarillas.
Marque el centro de las manchas de los aminocidos, mida el avance de cada
muestra y del frente del solvente a la altura de cada muestra.
Calcule la razn de migracin de los solutos con respecto a la fase mvil (R f) (Ec.
2.1).

4.2 Separacin de la hemoglobina (Hb) del colorante diclorofenol-indofenol

(DCPIP) por cromatografa de exclusin en Sephadex G-25 (1- 5 kD).

Abra la llave reguladora del flujo de la columna cromatogrfica y deje salir el tampn
hasta que quede al nivel del Sephadex, una vez realizado, detenga el flujo cerrando
la llave.
Agregue 0,5 ml de la muestra problema sobre la superficie del gel de la columna
cromatogrfica y mantenga el flujo detenido. Recolecte y mida el volumen eluido a
partir de este momento.
Conecte la columna a la fase mvil y regule el flujo a 10 gotas por minuto mediante
las llaves reguladoras.
Recoja fracciones de 3,0 ml del eluyente hasta que toda la muestra haya eluido.
Mida la absorbancia de todas las fracciones recolectadas a 420 nm (Hb) y 580 nm
(DCFIF)
Mida la absorbancia de las muestras recogidas a 420 (Hb) y 580 nm ( DCFIF).
Grafique en un grfico la absorbancia versus el volumen de elucin a ambas
longitudes de onda.
Determine el Kav para cada constituyente de la mezcla segn la Ec. 2.2.

5. Bibliografa

Robert Bohinski, 1991. Bioqumica, 5 Edicin, Addison-Wesley, Iberoamericana.

Donald Voet and Judith G. Voet, 1998. Biochemistry. John Wiley & Sons.
A.L. Lehninger, D.L. Nelson and M.M. Cox, 1993. Principles of Biochemistry (Second
Edn.) Worth Publishers.

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