DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLGICAS

Organizacin Subcelular
Laboratorio de Biologa Celular
Nombres: Claudia Betancourtt Felipe Chamorro Carolina Cienfuegos

Introduccin
Las primeras clulas eran relativamente simples y pequeas, similares a los organismos que actualmente conocemos como procariontes. Con el pasar del tiempo ya la evolucin de este organismo aparecieron las clulas eucariontes, ms grandes y de organizacin ms compleja, que hoy forman parte de animales y plantas. A diferencia de las clulas procariontes, las clulas eucariontes poseen un ncleo que contiene la mayora del ADN el cual se encuentra envuelto en una membrana. Esto deja al material gentico en un compartimento separado del resto de los contenidos de la clula contenidos en el cito plasma, donde ocurren las reacciones metablicas. En el citoplasma se pueden distinguir distintos organelos: cloroplastos, mitocondrias, retculo endoplsmico, aparato de Golgi, ribosomas, peroxisomas, lisosomas, citoesqueleto, los cuales poseen diversas enzimas que cumplen funciones especficas dentro de una clula. El fraccionamiento Subcelular es una tcnica utilizada que permite obtener los componentes celulares aislados, en grandes cantidades y con un alto grado de pureza. Esta tcnica consiste en la separacin de los componentes de la clula basndose en su tamao y densidad por lo que los organelos con mayor densidad y tamao quedan en el fondo del tubo, son llamado pellet y aquellos que poseen una menor densidad con un menor tamao quedan suspendidos en una solucin de nombre sobrenadante.

Objetivos
Comprender la importancia de la tcnica de fraccionamiento Subcelular, para as utilizar correctamente los componentes requeridos para la reaccin. Observar e identificar la estructura de la muestra para as dibujar detalladamente lo observado durante el prctico. Utilizar reactivos para el reconocimiento de una faccin Subcelular en particular, con el propsito de provocar cambios de color caractersticos con los cuales se puede reconocer la presencia de un organelo en particular. Hiptesis Un procedimiento bien elaborado conlleva al resultado correcto

Materiales y Mtodos
Primero que todo los profesores prepararon el hgado de pollo (Homogenizado filtrado) para que nosotros lo ocupramos. Este procedimiento se basa en moler la muestra en un homogenizador mecnico, en donde se rompen muchas de las membranas de las clulas. La suspensin de las clulas rotas las llamamos lisado, y es la que se fracciona en el segundo proceso. Lo primero que hicimos fue colocar el tubo de centrifugacin (Falcon de polipropileno) por 5 min. En hielo antes de iniciar el procedimiento para que estuviera a una temperatura acorde para el hgado, luego en un tubo de centrifugacin el profesor puso una muestra de este hgado, luego fue sometido a centrifugacin de 2500 RPM RPM (la velocidad ms baja en este caso) a una temperatura de 4C por 10 min. (El proceso de centrifugacin consiste en girar rpidamente los tubos y as separar el pellet del sobrenadante). Al pasar los 10 min, en el tubo se vean claramente dos fases el pellet (corresponde a los organelos que han sedimentado) y el sobrenadante (corresponde a la fraccin liquida que permanece sobre el material sedimentado), el cual con una pipeta sacamos lo que ms se pudiera. Al pellet que qued haba que agregarle 1ml de Buffer, y hacerlo una mezcla homognea (resuspender el pellet). El sobrenadante sobrante lo pusimos en otro tubito para volver a someterlo a la centrifugacin esta vez por 20 min. a 6000 RPM a 4C. Al pasar el tiempo establecido volvemos a sacar el sobrenadante y dejar el pellet con 1ml de buffer, este mismo procedimiento lo hicimos una vez ms, hasta obtener 4 tubitos con: fraccin nuclear, fraccin mitocondrial, fraccin microsomal y el Blanco (todo como una mezcla

homognea). Cada uno de ellos contena el pellet ms 1ml de buffer. Todos ellos fueron puestos en hielo mientras no los fusemos ocupando. Eso corresponde a la parte de fraccionamiento, ahora continuamos con la parte de evaluar las fracciones celulares mediante marcadores moleculares. De mezcla que salio la fraccin nuclear con una pipeta sacamos 2 gotitas las cuales pusimos en un porta objetos limpio y seco y lo tapamos con el cubre objetos y as los observamos al microscopio en un aumento de 40X, una de las gotas la observamos normal, pero a la otra le agregamos una gota de azul de tripan para poder observar mejor el (los) ncleos. Cada uno de los tubos fue rotulado con anterioridad, para as no confundirse con lo que contena cada uno. Cada uno de estos tubos anteriormente fueron puestos al hielo de manera que estuviesen ms frescos. El primer tubo de ensayo que es el blanco contena el pellet (homogneo) ms buffer, succinato, azul de metileno y agua destilada. El segundo tubo de ensayo contena 1ml pellet de la fraccin nuclear ms buffer, succinato, azul de metileno y agua destilada. El tercer tubo de ensayo contena, 1ml pellet de fraccin mitocondrial mas el buffer, succinato, azul de metileno y agua destilada. Y por ltimo el cuarto tubo de ensayo tiene, 1ml el pellet de fraccin microsomal ms buffer, succinato, azul de metileno y agua destilada. Lo que hicimos con estos tubos fue agitarlos y agregarles a cada uno 1 ml de vaselina liquida, luego cada uno de ellos lo colocamos en un termorregulador con una temperatura de 37C, esperamos unos minutos, esperamos a ver que era lo que ocurra con cada uno de ellos.

Resultados
Actividad n 1: Fraccionamiento subcelular Recibimos un homogenizado filtrado de hgado, preparado por los profesores. A) Fraccionamiento subcelular de Hgado: El Fraccionamiento Subcelular comprende dos etapas, una primera etapa de ruptura u homogenizacin, y una segunda etapa de fraccionamiento propiamente tal. El fraccionamiento o separacin de los distintos componentes celulares se realiza mediante una serie de centrifugaciones sucesivas. Al centrifugar una muestra se obtienen dos fases claramente definida: el pellet que corresponde al sedimento propiamente tal y el sobrenadante, que corresponde a la fraccin liquida. Los pellet obtenidos corresponden a los organelos que han sedimentado, stos s resuspenden y se guardan para el resto de los anlisis bioqumicos, mientras que los sobrenadante se vuelven a centrifugar. Tabla n 1 Tubo 1 2 3 4 Pellet Ncleo Mitocondria Microsomal Sobrenadante Resultados +++ +++ +++ -- -

Simbologa: +++: 100% reaccin - - -: no hay reaccin Leyenda: Fraccionamiento del hgado en pellet y sobrenadante mediante centrifugacin

Tabla n 2 Muestras Pellet con azul de tripan Pellet normal Simbologa: +++: se ve 100% +: se ve 50% Leyenda: Observacin del ncleo del hgado, con y sin tincin, con tincin podemos ver ms claramente el ncleo. Dibujo A Leyenda: Fraccin del nucleo visto a 40 x sin tincin. Dibujo B Leyenda: Fraccin del nucleo visto a 40 x con tinci de azul de tripano B) Evaluacin del fraccionamiento Subcelular mediante marcadores moleculares. Cada organelo contiene enzimas o molculas que lo caracterizan, las que no se encuentran en los otros compartimientos celulares y permiten identificarlos. El DNA es la molcula marcadora de ncleos. Esta macromolcula puede ser identificada mediante colorantes bsicos, como el azul de tripno. Tabla n 3 Resultados +++ +

N Tubo 1 2 3 4 +++: 100% reaccin - - -: 0 % reaccin

Fraccin Agua Destilada Nuclear Mitocondrial Microsomal

Resultado

Leyenda: Reacciones que ocurrieron en los tubos sometindolos a un aumento de temperatura (37C) Dibujo C Leyenda: Tubos de ensayo cada uno con la fraccin Subcelular correspondiente antes de ser sometidos a un aumento de temperatura (37C).

Dibujo D Leyenda: Tubos de ensayo cada unos con la fraccin Subcelular correspondiente y reaccin correspondiente despus de ser sometidos a un aumento de temperatura (37C) Discusin Tabla n1 1) Por qu la centrifugacin nos permite separar la muestra en pellet y sobrenadante? Porque es un mtodo por el cual se pueden separar slidos de lquidos de diferente densidad mediante una centrifugadora, la cual imprime a la mezcla un movimiento rotatorio con una fuerza de mayor intensidad que la gravedad, provocando la sedimentacin del slido o de las partculas de mayor densidad. Este es uno de los principios en los que se basa la densidad: Todas las partculas, por poseer masa, se ven afectadas por cualquier fuerza (origen de una aceleracin). La centrifugacin impone, gracias a la aceleracin centrfuga, un efecto parecido al gravitacional: Las partculas experimentan una aceleracin que las obliga a sedimentar. La centrifugacin puede dividirse en primera instancia en dos grandes grupos: La preparativa y la analtica. En la primera, se obtienen grandes cantidades del material que se desea estudiar (pllet), mientras que en la segunda (sobrenadante) se procede al anlisis de las macromolculas en una ultra centrifugacin. Existen diversos mtodos de centrifugacin y una extensa variedad de tcnicas derivadas de esta. El objetivo de la centrifugacin es separar partculas de diferentes caractersticas. Para ello, se aplica un fuerte campo centrfugo, con lo cual las partculas tendern a desplazarse a travs del medio en el que se encuentren con la aceleracin G. G=velocidad angular2 x radio de giro. G=velocidad angular + radio 2) Porque el procedimiento de fraccionamiento se realiza a temperatura baja? Se suele aplicar en frio el procedimiento de fraccionamiento para evitar el sobrecalentamiento de las muestras que podra provocar la desnaturalizacin de las protenas y en este caso de deja a 4 C ya que minimiza la activacin de dao generado por fosofolipasas y proteasas. 3) Por qu se utiliza el Buffer en el pellet? Un buffer, tambin es un sistema constituido por un cido dbil y su base conjugada o por una base y su cido conjugado que tiene capacidad "tamponante", es decir, que puede

oponerse a grandes cambios de pH (en un margen concreto) en una disolucin acuosa, en este caso se utiliza para homogenizar la muestra. Tabla n2 Por qu la tincin con azul de tripano nos permite tener una mejor visualizacin del ncleo? El azul de tripano se utiliza para diferenciar clulas vivas de clulas muertas. Las clulas vivas o tejidos con la membrana celular intacta no son coloreados debido a que las clulas son muy selectivas a los compuestos que dejan pasar a travs de la membrana. En las clulas viables el Azul de Tripano no es absorbido; sin embargo, atraviesa la membrana de las clulas muertas. Por lo tanto, las clulas muertas se muestran de un distintivo color azul bajo el microscopio. Debido a que las clulas son excluidas de la tincin, este mtodo tambin es llamado Mtodo de tincin por exclusin. As las clulas que aparecen en la imagen visualizada en el microscopio (en este caso en 40x), claramente de color azul, son consideradas no viables (ncleo). Por qu obtuvimos esos resultados? Al visualizar la muestra del pellet homogenizado de hgado de rata con 1 ml de buffer en un microscopio a 40x del pellet del ncleo sin tincin, es muy difcil poder observar el ncleo, ya que se visualiza con poca nitidez, en cambio en la muestra que fue teida con una gota de azul de tripano se puedo observar claramente como fue absorbido por los ncleos de la clula y gracias a ello se pudo observar con mayor nitidez. Tabla n3 Por qu reaccin el tubo de fraccionamiento de ncleo y no el de fraccionamiento mitocondrial? La reaccin debiese ocurrir con la fraccin mitocondrial debido a que el succinato deshidrogenasa, es una flavoprotena (protenas que contienen un cido nuclecos) ligada a la membrana interna mitocondrial que interviene en el ciclo de Krebs y en la cadena de transporte de electrones. Pero la reaccin que se obtuvo fue de la fraccin nuclear lo cual podra ser explicando que La mayora de las protenas mitocondriales estn codificadas en genes nucleares, y su mRNA es traducido en el citosol. Esto hace necesaria la existencia de "pptidos gua" o secuencias gua, que sealan el destino de estas protenas mitocondriales que se sintetizan en el citosol. De esta forma estas protenas mitocondriales codificadas en el genoma nuclear llegan a su destino correcto; es decir, al lugar donde llevarn a cabo su funcin estructural y/o metablica, sea la matriz mitocondrial, la membrana interna, el espacio intermembrana o la membrana externa. Solo una pequea parte de las protenas mitocondriales son codificadas por el genoma mitoocondrial en humano. Sin embargo esto no ocurre igual en todos los organismos; en

los organismos menos evolucionados la mitocondria tiene un gran genoma que codifica un gran nmero de protenas, aparte de otros elementos como rRNAs, tRNAs y RNA, pero este genoma es reducido drsticamente en el curso de la evolucin hasta alcanzar su mnima expresin en la especie humana.

Conclusin
En sntesis podemos mencionar que la identificacin de una fraccin Subcelular son de suma importancia ya que permiten identificar las distintas funciones que poseen los organelos celulares y la importancia de su existencia en la clula debido a que estos producen en general todas las reacciones de una clula. De una manera general, podemos constatar que Finalizada la actividad prctica, se pudo establecer un anlisis a cerca del fraccionamiento Subcelular, permitindonos distinguir e identificar los componentes del una fraccin Subcelular y los organelos presentes en cada uno de ellos siendo parte de los componentes celulares, los cuales cumplen importantes funciones para el buen funcionamiento celular. Posteriormente se pudo identificar mediante investigaciones los principales elementos que conforman a los distintos organelos (enzimas, ribosomas, membrana, etc.) y conocer cada uno de los metabolismos existentes en ellos. Como fue de esperar pudimos comprobar que los conocimientos, estudios y posteriores investigaciones al terminar el prctico nos dio paso a la comprobacin de la hiptesis planteada con antelacin. Obteniendo que el fraccionamiento Subcelular es una tcnica que nos permite obtener diferenciadamente cada uno de los organelos celulares, los cuales poseen diferentes componentes los que reaccionaran de distinta manera segn sea su metabolismo enzimtico.

Bibliografa
http://www.scribd.com/doc/13587987/Centrifugacion http://es.wikipedia.org/wiki/Azul_de_tripano http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/contajecelular.htm http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/fraccionamiento.htm

Universidad Andres Bello, Gua n 5 Organizacin Subcelular, Laboratorio de biologa celular, curso BIO035.2010. http://es.wikipedia.org/wiki/Succinato_deshidrogenasa http://www.lab314.com/mitocondria/proteinas/mitoproteinas.htm http://es.wikipedia.org/wiki/Tampn_qumico

Introduccin a la biologa celular y molecular, Albert, 2 edicin editorial media panamericana(2006), Capitulo 11 Estructura de la membrana . http://www.scribd.com/doc/13587987/Centrifugacion