Facultad de Ciencias de la Vida

Departamento de Ciencias Biológicas

Laboratorio de Biología Celular BIO 131-302

Informe 5 de laboratorio:
“Organización subcelular”

Integrantes:
Josefa Alamos
Carla Oneto
Margarita Navajas
Profesores:
Profesor Gianfranco Pietrantoni
Profesora Andrea Tapia
Carrera:
Medicina
Fecha:
09.06.2022
Sección:
BIO 131-302
 I. Introducción:
“Las células son la unidad básica y estructural de todo ser vivo. Pero no todas las
células son iguales entre sí, están las eucariontes y las procariontes. Donde una de
las diferencias de estas células es la presencia de organelos por parte de la
eucariota, la procariota no tiene. Estos compartimentos, están delimitados por una
membrana y son muy útiles para la organización de la célula”.4
Los organelos de la célula son: El retículo endoplasmático, el cual sintetiza lípidos y
proteínas. En segundo lugar, están los ribosomas, encargados de la traducción de
síntesis de proteínas. Las mitocondrias, las cuales realizan el proceso de respiración
celular y obtención de energía. Los cloroplastos, también se encargan de la
obtención de energía en células que realizan fotosíntesis. El siguiente organelo es el
Aparato de Golgi el cual elabora proteínas y moléculas de lípidos (grasa) para su
uso en otros lugares dentro y fuera de la célula 1. , entre otros organelos existentes.
Si se quisieran separar estos orgánulos para su estudio y análisis, se recurre a la
técnica de fraccionamiento subcelular. Permite “conseguir fracciones puras o
enriquecidas en un determinado compartimento celular.”2 Esta técnica se realiza a
través de pasos. En primer lugar se rompe y homogeneiza la muestra, puede ser
de modo mecánico, químico o físico. Aquí se rompen las membranas, produciendo
pequeñas vesículas que dan origen a la fracción microsomal y otros organelos como
el núcleo, mitocondrias. Se mantendrán intactos formando un ̈lisado ̈, el que se va a
fraccionar en la segunda etapa, la cual es una serie de etapas sucesivas de
centrifugación (centrifugación diferencial) 3 en las que los componentes del lisado
se separan en un campo gravitatorio. Al terminar la centrifugación se tiene el fondo
del tubo un pellet y sobre él una parte líquida, el sobrenadante. Este sobrenadante
se somete a otra centrifugación, formándose un pellet enriquecido en membrana
plasmática y retículo endoplásmico. Posteriormente se realiza una última
centrifugación, permite sedimentar finalmente los ribosomas, dejando en el
sobrenadante el citosol. De todas formas, luego de este proceso, no se obtienen
fracciones totalmente puras. Para evaluar qué tan pura es la fracción, se utilizan los
marcadores celulares. Se analiza la presencia de ciertos componentes de los tipos
celulares, por ejemplo, si hay ADN, entonces estará presente el núcleo.
Hipótesis: En la actividad de evaluación del fraccionamiento subcelular mediante
marcadores moleculares en la detención de mitocondrias, deberá reducirse el azul
de metileno si es que hay presencia de mitocondrias, cambiando su color. Este
cambio deberá aparecer en los tubos de homogenizado crudo y la fracción
mitocondrial, pues ahí deberá haber presencia de mitocondrias.
Objetivos : Comprender y analizar el fundamento de la técnica de fraccionamiento
celular aislando organelos celulares, a través del conocimiento del campo
gravitacional y el rompimiento de la célula, a partir del hígado de pollo. Actividad
uno: Fraccionar un hígado, utilizando la técnica estudiada en clases y aplicándola de
forma práctica. Actividad dos: Aplicar el concepto de marcadores celulares
analizando la presencia de núcleo y mitocondria en distintas fracciones a partir de
los organelos aislados del hígado de pollo. Utilizando la tinción de azul de tripan y la
reacción del SDH.
 II. Metodología

Actividad 1: El propósito de esta actividad es fraccionar un hígado de pollo para

utilizar la técnica estudiada y aplicarla prácticamente, obteniendo los organelos
separados. En primer lugar, se lavó el pollo con suero fisiológico para eliminar restos
de sangre y después se cortó en trozos. A estos trozos se les añadió 100 ml de
suero y se homogeneizaron en el ULTRATURRAX. Lo obtenido, que es el
homogeneizado total, se filtró a través de una gasa, creando el homogenizado
crudo, el cual se mantuvo en hielo en todo momento. 100 ml de homogeneizado
crudo fue lo que se nos entregó como grupo, 1 ml se guardó para un experimento
posterior.
Lo que quedó, se Centrifugó a 1000 RPM por 5 minutos a 4ºC. Posteriormente el
sobrenadante se trasladó a un tubo de centrifugación y el pellet 1 (Fracción Nuclear)
se guardó en hielo tras agregar 3ml de IBC. Seguido a esto se centrifugó el
sobrenadante 1 a 6000 RPM por 20 minutos a 4ºC. Se transfirió el sobrenadante
obtenido al tubo 2 de centrifugación. Al pellet 2 (Fracción Mitocondrial), se le agregó
3 ml de IBC y se guardó en hielo. Finalmente se centrifugó el sobrenadante 2 a
6000 RPM por 30 minutos a 4ºC. Se obtuvo el sobrenadante 3 (Fracción
Microsomal), el cual se guardó en hielo. El último pellet se eliminó.
Actividad 2.1: El propósito de esta actividad es evaluar la pureza de los organelos
obtenidos en la posterior actividad, observando en el microscopio las fracciones
nucleares, utilizando azul de Tripan para teñir.
Se analizaron al microscopio dos muestras, una muestra de fracción nuclear y otra
de fracción nuclear teñida con una gota azul de tripano. Todo esto bajo el objetivo de
40X. Se colocó una gota de fracción nuclear en el portaobjetos y se puso el
cubreobjetos, se observó y luego se dibujó. Se hizo lo mismo con la muestra teñida,
se puso en el portaobjetos y luego se añadió el cubreobjetos, se observó y se
dibujó.
Actividad 2.2: El propósito de esta actividad es la evaluación del fraccionamiento
subcelular mediante marcadores moleculares, en este caso analizando la presencia
de mitocondrias gracias a la actividad de la enzima Succinato deshidrogenasa
(SDH) que cataliza la deshidrogenación estéreo específica de Succinato a Fumarato
durante el ciclo de Krebs.
Para lograr esto se separaron 5 tubos de ensayo, previamente rotulados. El primer
tubo será blanco, el segundo con 1 ml de homogeneizado crudo, el tercero con 1 ml
del primer pellet (Fracción Nuclear), el cuarto 1ml del segundo pellet (Fracción
Mitocondrial) y el último con 1 ml de sobrenadante 3 (Fracción Microsomal). A cada
uno de los tubos posteriormente se le había agregado 1 ml de Succinato 0,1M, 1 ml
de Azul de Metileno y 1 ml de Agua Destilada. Ya con los tubos listos, se
homogeneizaron, se les agregó 200 ml de vaselina. Luego se agregaron a un baño
termorregulado a 37°C de 5 a 10 minutos. Finalmente se sacaron y se observaron
los cambios de color de cada tubo.
III. Resultados

Actividad 1: Fraccionamiento subcelular

Dibujo: 1

Nombre: Observación microscópica de fracción nuclear

Tipo de muestra: Temporal
Tinción: No
Aumento del objetivo: 40X
Aumento total : 400X
Observaciones:
1) Se observan estructuras circulares de bordes definidos, que corresponden a
los eritrocitos.
2) En los glóbulos rojos se aprecia su biconcavidad al tener una especie de
círculo en su interior.
 3) Se observa que los glóbulos rojos forman pequeños conjuntos de estos,
formando una especie de aglomeración.

Dibujo: 2

Nombre: Observación microscópica de fracción nuclear teñida

Tipo de muestra: Temporal
Tinción: Azul de tripán
Aumento del objetivo: 40X
Aumento total: 400X
Observaciones:
1) Se observan figuras circulares incoloras, de borde definido y marcado que
corresponden a células sanguíneas intactas, específicamente
eritrocitos.Estas se encuentran de color blanco y no poseen ADN.
 2) Se observan estructuras circulares de bordes no tan definidos de color azul
oscuro y otras veces del mismo color pero más claro, los cuales son los
núcleos celulares, que contienen ADN.
3) Se ven más claros los núcleos que los glóbulos rojos, es decir, el grado de
nitidez de estos últimos es menor.

Actividad 2: Evaluación del fraccionamiento subcelular mediante marcadores

moleculares

IV. Discusión
La actividad N°1 se basó en el fraccionamiento subcelular, donde se utilizó la
muestra de un hígado de pollo, con el fin de identificar la presencia de mitocondrias
en las distintas fracciones obtenidas de la centrifugación diferencial llevada a cabo
en el ULTRATURRAX.
En la actividad N°2 se llevó a cabo el reconocimiento de organelos celulares a
partir de tinción con azul de tripano. Primero observamos bajo el microscopio
fracciones nucleares sin tinción y con tinción. En esta última el profesor nos facilitó
una imagen del experimento bien logrado, para poder ser analizado. En nuestro
caso no se marcaron los núcleos, lo que pudo haber ocurrido por la necesidad de
una tinción más sensible, de una concentración mayor de tinción , por un error de
traspaso de sobrenadante o por la falta precipitación de los núcleos.
Por otro lado, cada tubo tenía 1 mL de Succinato 0,1M; 1 mL de azul de metileno; 1
mL de agua destilada; 1 mL de vaselina, y fue sometido a un baño termorregulado a
37°C por 10 minutos.
El primer tubo corresponde a la muestra control, ya que no tiene estructuras
subcelulares por lo que la reacción es negativa, y por esto la solución a pesar del
calor se mantiene incolora.
El tubo 2 correspondiente a 1 ml de homogeneizado crudo, es positivo, lo que se
justifica a través de la decoloración de la muestra, que evidencia la presencia de
mitocondrias. Sin embargo, estas no son las únicas estructuras celulares presentes,
ya que el tubo contiene el homogenizado crudo, lo que significa, que posee varias
partes de una célula y que para obtener cada una de ellas por separado es
necesario que sean centrifugadas.
El tubo 3 se debería mantener el color azul y no tornarse incoloro, pues no contiene
mitocondrias sino que posee estructuras nucleares y subcelulares, productos
resultantes de la fracción nuclear, y que no reaccionan con la enzima succinato
deshidrogenasa. Pero en nuestro caso la muestra se contaminó debido a la
imprecisión a la hora de pasar el sobrenadante anterior a este tubo o por falta de
tiempo de centrifugación del pellet, por lo que se filtraron estructuras celulares a
este y tornó nuestra muestra de un tono azul levemente cafesoso. Una solución a
este problema puede ser el usar un tipo de tinción que sea más sensible a los
organelos específicos que se buscan, de manera que no hayan detecciones de
otros organelos que no deseamos detectar.
En la cuarta solución se produce una reacción positiva, ya que la tonalidad azul se
torna incolora por el aumento de la temperatura a 37°C, lo que indica la presencia
de mitocondrias y la acción de la SDH. Esta última se relaciona a la membrana
interna mitocondrial e interviene en el ciclo de Krebs y en la cadena de transporte de
electrones, es así que su actividad en la muestra evidencia la existencia de
mitocondrias. “Cabe destacar que la succinato deshidrogenasa logra un
funcionamiento óptimo normalmente a los 37°C, ya que esta temperatura cae en el
rango de la actividad correcta y óptima de ambiente de una enzima”5, que es de
35°C a 40°C, muy cercanas a la temperatura corporal humana, en este rango se
logra la rapidez óptima de reacción. Es por la razón anterior que la enzima no
reaccionó en la muestra previo a la aplicación de calor, porque a 4°C no se alcanza
un funcionamiento ni velocidad correcta.
Para finalizar, en el tubo 5, que contiene el sobrenadante 3 de la fracción
microsomal, es decir membrana plasmática y retículos endoplasmáticos, se observa
una reacción negativa, pues la muestra mantuvo el color azul, sin presentar ninguna
decoloración.
Las actividades experimentales fueron relevantes para entender cómo opera el
fraccionamiento subcelular, y la identificación de los distintos pellets y
sobrenadantes obtenidos en cada centrifugación junto a los componentes incluidos
en cada uno. De igual forma, el experimento fue útil para evidenciar que la actividad
enzimática es óptima cuando se somete a temperaturas cercanas a las del cuerpo
humano (35°C a 40°C), y que por otro lado, es prácticamente nula cuando se
expone a bajas temperaturas que salgan de este rango, como lo fue a los 4°C,
donde no se evidenció ninguna reacción.

V. Conclusión
Finalmente, tras la investigación y desarrollo de las actividades experimentales,
logramos cumplir el objetivo 1 y medianamente el 2. Con respecto al objetivo 2,
pudimos aplicar el concepto de marcadores correctamente en el experimento, pero
debido a que hubo contaminación a la hora de traspasar el pellet en el área práctica,
los resultados difirieron en un tubo. Esto nos hizo concluir que a la hora de separar
los sobrenadantes, es de suma importancia ser precisos para no contaminar la
muestra, pues esta debe ser esperada a que pelletee bien, se separe solo lo
indicado y no se mueva bruscamente, debido a que esto, altera todo el experimento
y los resultados de este. En cuanto al experimento del microscopio, concluimos que
pudieron haber influido muchos factores distintos que hicieron que los núcleos no se
hayan teñido correctamente, esto nos hace darnos cuenta que necesitamos
muestras de tinción muy específicas y fraccionamientos muy meticulosos para que
el resultado que deseamos sea óptimo y preciso.
Dentro de todo, los demás experimentos lograron lo esperado, se entendieron las
diversas técnicas que permiten identificar estructuras celulares en específicas
durante el práctico, tales como el uso del azul de tripano que marca el adn
tiñéndose de azul, permitiendo el reconocimiento de organelos de dicha solución,
como son los núcleos celulares, o del empleo de enzimas, que en esta
experimentación fueron sumamente relevantes para determinar la presencia de
mitocondrias en diversas muestras o fracciones subcelulares.
En cuanto a la hipótesis, podemos confirmar la idea de que los marcadores
celulares tal como lo fue la enzima, reacciona en presencia de mitocondrias, todo
esto nos llevó a concluir que esta actividad enzimática fue dictada por la variable de
la temperatura, donde los rangos de temperatura parecidos a las corporales
humanas (35°C-40°C) provocan la unión de esta al organelo, dando así el positivo
que buscábamos, todo esto debido a que la enzima respondía a una temperatura,
que la hacía reaccionar a la velocidad y funcionamiento óptimo, pero cuando era
puesta a temperaturas bajas, la enzima no reaccionaba, dando a entender que el
funcionamiento enzimático se rige estrictamente por el ambiente en el que
reacciona.
Para finalizar, cabe destacar que los procedimientos realizados en este laboratorio,
fueron sumamente importantes para entender los procesos y estudios celulares, que
sin duda seguirán siendo útiles para futuras investigaciones y nuevos
descubrimientos de nivel farmacológico, que puedan relacionarse a la célula y la
función de sus respectivos orgánulos.

Referencias Bibliográficas:
1.El sistema endomembranoso (artículo). (s. f.). Khan Academy.
https://es.khanacademy.org/science/ap-biology/cell-structure-and-function/cell
-compartmentalization-and-its-origins/a/the-endomembrane-system
2.Fraccionamiento subcelular | Izasa Scientific. (s. f.). Izas scientific.
https://www.izasascientific.com/es/fraccionamiento-subcelular#:%7E:text=El%
20fraccionamiento%20subcelular%20tiene%20como,en%20un%20determina
do%20compartimento%20celular.

3.file:///C:/Users/SAMSUNG/Downloads/Gu%C3%ADa%20del%20estudiante
%20Act%20pr%C3%A1ctica%204%20n%C3%BAcleo.pdf

4. Alberts, B., Bray, D., Hopkin, K., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts,
K. & Walter, P. Introducción a la biología celular. (2011). Médica
Panamericana, 3a edición, México. pp 184.

5. Ross, M. H & Pawlina, W. Histología: Texto y atlas color con biología

celular y molecular (2013). Médica Panamericana. 6a edición, Buenos Aires.
pp 293-295. 8. Jiménez L., Merchant H., Biología Celular y Molecular. (2002).
Pearson Educación, 1a edición. México. pp. 296.